PL201880B1 - Sposób chromatograficznego oczyszczania insulin - Google Patents
Sposób chromatograficznego oczyszczania insulinInfo
- Publication number
- PL201880B1 PL201880B1 PL346865A PL34686599A PL201880B1 PL 201880 B1 PL201880 B1 PL 201880B1 PL 346865 A PL346865 A PL 346865A PL 34686599 A PL34686599 A PL 34686599A PL 201880 B1 PL201880 B1 PL 201880B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- pressure
- chromatographic
- water
- organic solvent
- insulin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011368 organic material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 28
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 claims description 3
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 18
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 9
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 3
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 3
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 3
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000010327 methods by industry Methods 0.000 description 2
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical group C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 108700022849 desamido- insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy sposobu chromatograficznego oczyszczania insulin, polegaj acego na tym, ze jako faz e nieruchom a stosuje si e odporny na dzia lanie ci snienia, polimerowy chromatograficzny materia l organiczny do chromatografii w uk ladzie faz odwróconych, faza ruchoma do elucji zawiera co najmniej jeden rozpuszczalnik organiczny mieszaj acy si e z wod a i co najmniej jedn a substancj e bufo- row a, a warto sc pH wynosi 7 - 11, przy czym cz astki materia lów chromatograficznych s a z polimerów organicznych, których odkszta lcenie pod dzia laniem ci snienia do 7 MPa jest niewielkie. PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób chromatograficznego oczyszczania insulin.
W sposobach wytwarzania insulin, obejmują cych procesy enzymatyczne i/lub inż ynierii genetycznej, ważnym procesem jest chromatografia, dla spełnienia wyjątkowo wysokich wymagań odnośnie czystości.
Pojęcie insuliny w niniejszym opisie obejmuje pochodzące ze źródeł naturalnych lub rekombinowane (to znaczy eksprymowane przez genetycznie modyfikowane mikroorganizmy) insuliny pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego (np. insulinę świńską, insulinę bydlęcą lub insulinę ludzką), proinsuliny (np. prekursory insuliny, preinsuliny) lub pochodne insuliny.
Jako pochodne insuliny określa się pochodne występujących w naturze insulin, a mianowicie insuliny ludzkiej lub insulin zwierzęcych, które różnią się od naturalnych insulin jedynie podstawieniem co najmniej jednej występującej w naturze reszty aminokwasu i/lub przyłączeniem co najmniej jednej reszty aminokwasu i/lub innej grupy organicznej.
Ludzka insulina jest polipeptydem zbudowanym z 51 aminokwasów. Tak zwany łańcuch A (kwasowy) składa się z 21, a łańcuch B (zasadowy) z 30 reszt aminokwasów. W obu łańcuchach aminokwasów występuje 6 reszt cysteiny, przy czym po dwie reszty cysteiny są związane ze sobą mostkiem disulfidowym (oba łańcuchy są połączone ze sobą dwoma mostkami cysteinowymi). W biologicznie czynnej insulinie ludzkiej łańcuchy A i B są związane ze sobą dwoma mostkami cysteinowymi i dodatkowy mostek występuje w ła ńcuchu A. W (biologicznie czynnej) insulinie ludzkiej następujące reszty cysteiny są ze sobą połączone:
A6-A11
A7-B7
A20-B19
Litery A lub B oznaczają dany łańcuch aminokwasów w insulinie, liczba oznacza pozycję reszty aminokwasu, liczonej od końca aminowego do końca karboksylowego w każdym z łańcuchów aminokwasów.
Insulinę rekombinowaną zazwyczaj wytwarza się drogą fermentacji i rozbicia komórek, po czym produkt oczyszcza się stosując procesy oczyszczania, zwykle procesy chromatograficzne, znane w chemii białek i inżynierii procesowej.
Metody inżynierii genetycznej umożliwiają wytwarzanie w mikroorganizmach proinsuliny ludzkiej lub proinsuliny (proinsuliny pochodnych insuliny), mającej odmienną od insuliny ludzkiej sekwencję aminokwasów i/lub długość łańcucha aminokwasów. Proinsuliny wytwarzane przez genetycznie zmienione komórki Escherichia coli nie mają poprawnie związanych mostków cysteinowych. Sposób otrzymywania z E. coli insuliny ludzkiej z poprawnie związanymi mostkami cysteinowymi jest znany np. z opisu patentowego EP 0 055 945. Ulepszone sposoby wytwarzania insuliny ludzkiej i pochodnych insuliny z poprawnie związanymi mostkami cysteinowymi opisano w EP 0 600 372 A1 (US 5 473 049) i EP 0 668 292 A2 (US 5 663 291).
Proinsulinę, prekursor insuliny, wytwarzaną przez genetycznie modyfikowane mikroorganizmy, wyodrębnia się najpierw z komórek, poprawnie fałduje, a następnie przeprowadza enzymatycznie w insulinę ludzką. Mieszanina produktów rozszczepienia, otrzymana w enzymatycznym procesie peptydyzacji, oprócz niepożądanych produktów ubocznych zawiera zarówno wartościową substancję, jak i niepożądane, podobne do insuliny substancje towarzyszące, nie różniące się od niej wyraźnie ani masą cząsteczkową, ani innymi właściwościami fizycznymi, co bardzo utrudnia oddzielanie i oczyszczanie, szczególnie w dużej skali technicznej.
Procesy oczyszczania w inżynierii procesowej realizuje się prowadząc kolejno różne procesy chromatograficzne (np. chromatografię adsorpcyjną, chromatografię jonowymienną, chromatografię wysokociśnieniową w układzie faz odwróconych lub takie procesy w połączeniu), częściowo w kilku etapach z użyciem różnych materiałów nośnikowych, przy czym w niektórych przypadkach następnie prowadzi się krystalizację, jednak właściwe oczyszczanie prowadzi się metodą chromatografii. Podobne do insuliny substancje towarzyszące zostają przy tym oddzielone na wymieniaczach jonowych lub na nośnikach typu żeli krzemionkowych do stosowania w układzie faz odwróconych.
Końcowy etap oczyszczania (oddzielanie niewielkich ilości zanieczyszczeń, jako ostatni etap oczyszczania) zwykle prowadzi się w zakresie wysokich ciśnień metodą chromatografii na żelu krzemionkowym w układzie faz odwróconych (RP-HLPC = wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa w ukł adzie faz odwróconych).
PL 201 880 B1
Określenie żel krzemionkowy do stosowania w układzie faz odwróconych (to znaczy modyfikowany lipofilowo czyli hydrofobowo) oznacza materiał krzemionkowy, naniesiony na matrycę hydrofobową. Przykładami matrycy hydrofobowej są alkany o łańcuchu zawierającym 3-20 atomów węgla, zwłaszcza 4-18 atomów węgla. Wielkość ziarna wynosi 10 - 50 μm, a szerokość porów wynosi 50 - 300 x 10-10 m.
Przykładowe procesy chromatograficzne z użyciem żeli krzemionkowych (lipofilowo modyfikowanych żeli krzemionkowych) w układzie faz odwróconych opisano w EP 0 547 544 A2 (US 5 621 073) lub EP 0 474 213 A1 (US 5 245 008). Zgodnie ze stanem techniki tylko dzięki użyciu żeli krzemionkowych w układzie faz odwróconych mogą być spełnione wysokie wymagania odnośnie czystości wytwarzanej insuliny. Stosowanie żelu krzemionkowego w układzie faz odwróconych ma jednak bardzo istotne wady.
Żele krzemionkowe do stosowania w układzie faz odwróconych są trwałe tylko w zakresie pH 2 - 10. W przypadku oczyszczania produktów fermentacji metodą chromatografii zawsze obecne są produkty uboczne o dużej masie cząsteczkowej ulegające trwałej adsorpcji, przy czym nie ulegają one desorpcji w wyniku zwykłej elucji. W miarę upływu czasu zawartość produktów ubocznych na żelu krzemionkowym w układzie faz odwróconych ulega zwiększeniu (mówi się o starzeniu się adsorbenta). Regeneracja czyli „cleaning in place” (CIP) możliwa jest najczęściej tylko przez przemywanie rozcieńczonym ługiem sodowym. Zatem w każdym procesie CIP część żelu krzemionkowego w układzie faz odwróconych ulega zniszczeniu, a jego stałe uzupełnianie jest bardzo kosztowne. Poza tym istnieje niebezpieczeństwo denaturacji insuliny na żelach krzemionkowych.
Znanych jest wiele prób zastąpienia żeli krzemionkowych stosowanych w układzie faz odwróconych. Próby stosowania w układzie faz odwróconych materiału na bazie tlenku glinu lub tlenku tytanu (oba materiały nie są całkowicie trwałe w całym zakresie pH, ale są przynajmniej trwalsze od żelu krzemionkowego) wykazały, że oddzielenie jest niewystarczające i że nie jest możliwe spełnienie żądanych wymagań lub osiągnięcie żądanej czystości.
Kolejną konieczną właściwością materiałów chromatograficznych jest odporność na działanie ciśnienia. Polimerowe materiały chromatograficzne odporne na działanie ciśnienia (mogące mieć wszelkie możliwe postacie, takie jak pręciki, materiał w postaci cząstek lub zwłaszcza w postaci kulek, korzystnie o średnicy 10 - 35 μm) to polimery organiczne, których odkształcenie pod działaniem ciśnienia (do 7 MPa) jest niewielkie. Materiał znajdujący się w kolumnie chromatograficznej musi być tak dobrze upakowany, aby nie występowały żadne puste przestrzenie (jakość upakowania decyduje o wynikach rozdzielania). Znane są zasadniczo dwie różne metody napełniania kolumn, które mogą być również stosowane łącznie. Zgodnie z jedną metodą ściska się wypełnienie za pomocą stempla (najczęściej uruchamianego hydraulicznie) (DAC = bezpośrednie ściskanie osiowe), a zgodnie z drugą metodą kolumnę napełnia się hydrodynamicznie za pomocą pompy wysokociśnieniowej, to znaczy zawiesinę cieczy i cząstek wtłacza się pod ciśnieniem do kolumny. W obu przypadkach z praktyki wynika, że trzeba stosować ciśnienie do 7 MPa na przekrój kolumny, aby móc upakować cząstki możliwie gęsto i bez powstawania pustych przestrzeni.
Wiele cząstek polimerów organicznych nie jest trwałych pod działaniem ciśnienia i odkształcają się one pod wpływem ciśnienia tak bardzo, że z kulek powstają płaskie płytki zachodzące na siebie i hamujące przepływ przez wypełnienie. Natomiast żele krzemionkowe do stosowania w układzie faz odwróconych są ze swej natury znacznie twardsze i prawie nie odkształcają się przy takim ciśnieniu.
Istniała potrzeba opracowania sposobu chromatograficznego oczyszczania insulin z użyciem odpowiednich materiałów chromatograficznych odpornych na działanie ciśnienia i nadających się do stosowania w całym zakresie pH 1 - 14, umożliwiającego uzyskanie tak wysokiej wydajności rozdzielania, że zamiast zwykle stosowanych dwóch lub większej liczby kolejnych etapów oczyszczania chromatograficznego, dla osiągnięcia wymaganej czystości insuliny przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności wystarczy przeprowadzić tylko jednoetapowy proces oczyszczania.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że metodą chromatografii w zakresie pH 7 - 11 osiąga się bardzo dobre rozdzielenie na odpornych na działanie ciśnienia, polimerowych chromatograficznych materiałach organicznych.
Wynalazek dotyczy sposobu chromatograficznego oczyszczania insulin, charakteryzującego się tym, że jako fazę nieruchomą stosuje się odporny na działanie ciśnienia, polimerowy chromatograficzny materiał organiczny do chromatografii w układzie faz odwróconych, faza ruchoma do elucji zawiera co najmniej jeden rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą i co najmniej jedną substancję
PL 201 880 B1 buforową, a wartość pH wynosi 7 - 11, przy czym cząstki materiałów chromatograficznych są z polimerów organicznych, których odkształcenie pod działaniem ciśnienia do 7 MPa jest niewielkie.
Korzystnie wartość pH wynosi 9 - 10.
Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się alkohol o 1 - 4 atomach węgla, a zwłaszcza 1-propanol lub 2-propanol, etanol albo metanol.
Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą również stosuje się keton, octan metylu albo acetonitryl.
Korzystnie stężenie mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej wynosi 1 - 90% objętościowych, a zwłaszcza 10 - 50% objętościowych.
Korzystnie prowadzi się elucję izokratyczną.
Korzystnie elucję prowadzi się przy liniowym zwiększającym się gradiencie udziału rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą.
Korzystnie średnia wielkość cząstek odpornego na działanie ciśnienia, polimerowego chromatograficznego materiału organicznego wynosi 5 - 300 μm, a zwłaszcza 10 - 50 μm.
Korzystnie średnia wielkość porów odpornego na działanie ciśnienia, polimerowego chromatograficznego materiału organicznego wynosi 5 - 500 nm, a zwłaszcza 10 - 50 nm.
Korzystnie jako odporny na działanie ciśnienia, polimerowy chromatograficzny materiał organiczny stosuje się polimetakrylan albo polistyren-diwinylobenzen.
Szczególna zaleta sposobu według wynalazku polega na tym, że we wspomnianym zakresie pH odpowiadającym odczynowi zasadowemu powstrzymywane jest tworzenie się desamidoinsuliny, substancji towarzyszącej, powstającej zwykle w środowisku kwaśnym, a zgodnie z wymaganiami dotyczącymi preparatów insulinowych jej resztkowa ilość musi być bardzo mała.
Fazy ruchome stosowane do elucji zawierają rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą, taki jak np. alkohole o 1 - 4 atomach węgla, ketony, octan metylu lub acetonitryl. Korzystne są takie alkohole, jak 1- lub 2-propanol (n- lub izopropanol), metanol lub etanol. Stężenie rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą korzystnie wynosi 1 - 90% objętościowych, korzystniej 10 - 50% objętościowych.
Fazy ruchome zawierają ponadto substancję buforową dla utrzymania stałej wartości pH eluenta. Odpowiednimi substancjami buforowymi są np. fosforany, sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, takie jak cytrynian sodu lub octan potasu, cytrynian amonu, octan amonu, siarczan amonu lub chlorek amonu.
Wartość pH nastawia się przez dodawanie kwasu solnego lub ługu sodowego.
Elucja może być izokratyczna, to znaczy przy stałym stężeniu substancji buforowych i przy stałej zawartości rozpuszczalnika organicznego, albo korzystnie można ją prowadzić przy gradiencie liniowym, a więc z podwyższaniem zawartości rozpuszczalnika organicznego.
Średnia wielkość cząstek odpornego na działanie ciśnienia polimerowego chromatograficznego materiału organicznego powinna korzystnie wynosić 5 - 300 μm, korzystniej 10 - 50 μm. Im mniejsza wielkość cząstek, tym ostrzejsze i lepsze jest rozdzielanie. Mniejsze cząstki są jednak mniej odporne na działanie ciśnienia.
Insulina jest stosunkowo małym polipeptydem (o masie cząsteczkowej około 6000) i może bez trudu dyfundować w pory o średnicy 10 nm (brak przeszkód sferycznych). Materiały o małej średnicy porów są korzystniejsze przy stosowaniu, ponieważ ich powierzchnia właściwa, a zatem i pojemność adsorpcyjna jest większa. Średnia wielkość porów odpornych na działanie ciśnienia, polimerowych chromatograficznych materiałów organicznych korzystnie wynosi 5 - 500 nm, korzystniej 10 - 50 nm.
Do stosowania w sposobie według wynalazku szczególnie odpowiednie są odporne na działanie ciśnienia, polimerowe chromatograficzne materiały organiczne stanowiące polistyren-diwinylobenzen lub polimetakrylan. Przykładowe dostępne w handlu, odporne na działanie ciśnienia, polimerowe chromatograficzne materiały organiczne, które korzystnie można stosować w sposobie według wynalazku, podano w tabeli 1.
PL 201 880 B1
T a b e l a 1. Materiały chromatograficzne dostępne w handlu
| Producent | Nazwa handlowa | Materiał | Najmniejsza wielkość cząstek [μιτι] | Średnica porów [nm] |
| TosoHaas | Amberchrome® | PMA | 35 | 100 |
| Pharmacia | Source® | StDVB | 15 | 100 |
| Perseptive | Poros® | StDVB | 10 | 200 |
| Mitsubishi | CHP20 P® | StDVB | 35 | 100 |
| Biosepra | RPC PolyBio® | StDVB | 10 | 30 |
| Macherey&Nagel | Nucleogel® | StDVB | 20 | 10 |
| Polymer Laboratories | PLRP® | StDVB | 10-15 | 10 |
PMA = polimetakrylan
StDVB = styren-diwinylobenzen
Sposób według wynalazku nadaje się do chromatografii analitycznej, półpreparatywnej, a w szczególności do chromatografii preparatywnej. Określenie „chromatografia preparatywna” dotyczy wytwarzania czystych produktów w skali technicznej.
Aby osiągnąć wymaganą czystość preparatów insulinowych trzeba stosować chromatografię w układzie faz odwróconych, np. według EP 0 547 544 A2 (US 5 621 073) lub EP 0 474 213 A1 (US 5 245 008), co najmniej jeszcze jeden proces chromatograficzny w układzie faz odwróconych lub chromatografię kationowymienną oraz ewentualnie dodatkowy etap krystalizacji. W sposobie według wynalazku taki sam wynik osiąga się metodą jednostopniowej chromatografii na nośniku polimerowym. Dzięki sposobowi według wynalazku znacznie polepsza się zatem łączna wydajność wytwarzania insuliny, gdyż w wyniku połączenia kilku etapów procesu w jeden etap unika się strat wydajnoś ci.
Sposób według wynalazku jest przydatny do chromatograficznego oczyszczania wszelkich insulin, zgodnie z podaną we wstępnej części opisu definicją, a mianowicie insulin pochodzących z naturalnych źródeł lub rekombinowanych (to znaczy eksprymowanych przez genetycznie modyfikowane mikroorganizmy) insulin pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego (np. insuliny świńskiej, insuliny bydlęcej lub insuliny ludzkiej), proinsulin (np. prekursorów insulin, preinsulin) lub pochodnych insulin, przy czym pochodne występujących w naturze insulin, a mianowicie insuliny ludzkiej lub insulin zwierzęcych, stanowią insuliny różniące się od naturalnych insulin jedynie podstawieniem co najmniej jednej występującej w naturze reszty aminokwasu i/lub przyłączeniem co najmniej jednej reszty aminokwasu i/lub innej grupy organicznej.
Przykładami takich insulin są insulina ludzka, insulina bydlęca, insulina świńska, insuliny według EP 0 368 187 (US 5 656 722), np. Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-insulina ludzka, insuliny według EP 0 821 006 (ZA 97/6645), albo insuliny opisane w EP 0 547 544 A1 (US 5 621 073), EP 0 474 213 A1 (US 5 245 008), EP 0 600 372 A1 (US 5 473 049) lub EP 0 668 292 (US 5 663 291) (litery A i B oznaczają dany łańcuch aminokwasów w insulinie, liczba oznacza pozycję występującej w naturze reszty aminokwasu, która została zastąpiona resztą aminokwasu podaną przed nawiasem).
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Zmiana wartości pH
W przykładzie 1 przeprowadzono próby z użyciem półpreparatywnej kolumny o średnicy 10 mm i długości 120 mm, wypełnionej PLRP-S 10-15 μm 100 (Polymer Laboratories). Zadanie polegało na tym, aby wstępnie oczyszczoną insulinę o czystości 95% (powierzchniowo) oczyścić do czystości powyżej 98,5% (powierzchniowo).
Ilość wprowadzanej substancji przeznaczonej do oczyszczania dobierano tak, aby obciążenie polimerowego materiału chromatograficznego wynosiło 6 g/litr [objętości złoża]. Stosowanym buforem i fazą ruchomą były mieszaniny wody i propanolu zawierające 0,05 m octan amonu i 0,1 m glicynę, które z użyciem kwasu solnego lub NaOH doprowadzano do właściwej wartości pH. Szybkość przepływu w kolumnie bez wypełnienia wynosiła 150 cm/h. Nastawiano trzy wartości pH: pH=3,5, pH=6,8 i pH=9. Eluat zbierano frakcjami.
Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 2. Tylko przy pH 9 osiągnięto czystość powyżej 98% (powierzchniowo), co spełniało żądane wymagania. Jednoznacznie można uznać, że oczyszczanie
PL 201 880 B1 insuliny na polimerowym materiale chromatograficznym zapewnia żądaną wydajność tylko w środowisku zasadowym.
T a b e l a 2. Czystość i stężenie insuliny przy różnych wartościach pH przy użyciu polimerowego materiału chromatograficznego PLRP-S 10-15 100
| pH 3,5 | pH 6,8 | pH 9 | ||||
| Frakcja | Czystość [% (pow.)] | Stężenie [mg/ml] | Czystość [% (pow.)] | Stężenie [mg/ml] | Czystość [% (pow.)] | Stężenie [mg/ml] |
| 1 | 95,22 | 0,236 | 92,74 | 0,565 | ||
| 2 | 96,74 | 0,449 | 94,68 | 0,196 | 96,70 | 1,310 |
| 3 | 96,69 | 0,690 | 94,84 | 0,274 | 98,59 | 1,362 |
| 4 | 97,43 | 1,020 | 95,38 | 0,454 | 99,54 | 2,020 |
| 5 | 97,39 | 1,240 | 96,84 | 1,120 | 98,99 | 2,230 |
| 6 | 97,14 | 1,330 | 97,95 | 2,236 | 99,24 | 1,730 |
| 7 | 96,07 | 1,250 | 97,82 | 3,140 | 98,80 | 1,340 |
| 8 | 94,94 | 1,120 | 97,64 | 3,120 | 98,46 | 1,200 |
| 9 | 93,30 | 0,974 | 97,12 | 2,080 | 97,28 | 0,960 |
P r z y k ł a d 2. Odporność na działanie ciśnienia i upakowanie kolumny
Kolumnę chromatograficzną (Prochrom® LC50 o średnicy 50 mm) upakowywano metodą DAC (bezpośrednie ściskanie osiowe - Direct Axial Compression). Materiał chromatograficzny (faza stacjonarna) umieszczono w 100% metanolu i napełniono kolumnę. Przy różnych szybkościach przepływu mierzono spadek ciśnienia mieszaniny zawierającej 11% n-propanolu. Nacisk stempla kolumny chromatograficznej zmieniano od 0,5 do 8 MPa.
Badano następujące materiały chromatograficzne:
PLRP-S 10-15 100® (Polymer Laboratories)
Source® 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
Kromasil® 13-120 (Akzo Nobel)
Średnica cząstek materiałów była w przybliżeniu taka sama (cząstki kuliste).
PLRP® i Source® to polimery, Kromasil® to wysokowartościowy żel krzemionkowy RP.
T a b e l a 3. Spadek ciśnienia [MPa/cm] w mieszaninie wody z propanolem
| Nacisk stempla 0,5 MPa | Nacisk stempla 2 MPa | Nacisk stempla 4 MPa | Nacisk stempla 8 MPa | ||||
| cm/h | PLRP® | Source® | PLRP® | Source® | PLRP® | Source® | Kromasil® |
| 50 | 0,031 | 0,040 | 0,032 | 0,085 | 0,050 | 0,333 | 0,05 |
| 100 | 0,062 | 0,080 | 0,072 | 0,185 | 0,108 | 0,633 | 0,10 |
| 150 | 0,100 | 0,150 | 0,104 | 0,314 | 0,167 | 0,933 | 0,16 |
Jednostkowy spadek ciśnienia 1 MPa/cm oznacza spadek ciśnienia 3 MPa w wypełnieniu o wysokości 30 cm, co jest normalne w chromatografii technicznej.
P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie insuliny ludzkiej w skali preparatywnej
Poniżej podano łącznie 3 przykłady, w których oczyszczano ludzką insulinę z użyciem kolumny technicznej, wypełnionej metodą DAC z przesuwalnym stemplem. Stosowano kolumnę Prochrom®, typ LC50. We wszystkich doświadczeniach wymiary wypełnienia były takie same: średnica 50 mm, długość złoża 110 - 120 mm.
Ludzką insulinę o czystości 95% (powierzchniowo) należało doprowadzić do czystości 98,5% (powierzchniowo).
PL 201 880 B1
Stosowano trzy nośniki chromatograficzne:
PLRP-S 10-15 100® (Polymer Laboratories)
Source® 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
Kromasil® C4 13-120 (Akzo Nobel)
Jak już podano w przykładzie 2, PLRP i Source® to materiały polimerowe, a Kromasil® to wysokowartościowy żel krzemionkowy RP.
Bufor i faza ruchoma odpowiadały danym podanym w przykładzie 1. Obciążenie podano w gramach insuliny ludzkiej na litr objętości złoża. Wydajność oznacza udział eluatu o czystości powyżej 98,5% (powierzchniowo).
T a b e l a 4. Wydajność przy preparatywnym oczyszczaniu insuliny ludzkiej
| Nośnik | Obciążenie | PH | Nacisk stempla | Wydajność |
| PLRP-S 10-15 100® | 6 g/l złoża | 9 | 4 MPa | 60% |
| Source® 15 RPC | 6 g/l złoża | 9 | 2,5 MPa | 73% |
| Kromasil® C4 13-120 | 6 g/l złoża | 3,5 | 8 MPa | 68% |
W tabeli 4 zestawiono osiągnięte wartości wydajności. Wartości 60 - 70% dla długości zło ż a około 12 cm są zaskakująco dobre. Najważniejszą różnicą pomiędzy stanem techniki (oczyszczanie na nośniku, żelu krzemionkowym, w tym przypadku Kromasil®) i chromatografią na nośniku polimerowym jest różnica w wartości pH: tylko przy pH 9 osiąga się tak wysokie wartości wydajności.
P r z y k ł a d 4. Oczyszczanie insuliny (bolus) w skali preparatywnej
W tym przykładzie oczyszczano insulinę szybko działając ą (bolus). Poza tym ten przykład pokazuje, że dla tego etapu chromatograficznego dopuszczalnymi materiałami wyjściowymi są substancje o gorszej jakości. W znanych sposobach końcowe oczyszczanie insuliny zazwyczaj prowadzi się w dwóch etapach chromatograficznych. Jeśli w końcowym etapie bezpośrednio oczyszcza się produkt o niskiej jakości, to znaczy silnie zanieczyszczony, to nie można osiągnąć żądanej jakości i jednocześnie wysokiej wydajności.
Nieoczekiwanie teraz stwierdzono, że badany materiał polimerowy umożliwia osiągnięcie takiej czystości w jednym, pojedynczym etapie chromatograficznym, dzięki małej średnicy cząstek 10 - 15 μm i doskonałym właściwościom adsorpcyjnym.
Przeprowadzono cztery próby z użyciem następujących materiałów wyjściowych: czystość 75% (powierzchniowo) czystość 85% (powierzchniowo) czystość 89% (powierzchniowo) czystość 93% (powierzchniowo)
W tabeli 5 podano osiągnięte wartości wydajności (to znaczy taką część użytej insuliny, która została wyeluowana jako produkt o czystości powyżej 98,5% (powierzchniowo)). Jeśli czystość substancji wyjściowej wynosiła tylko 75% (powierzchniowo), to nie osiągnięto czystości powyżej 98,5% (powierzchniowo). Osiągana czystość wynosi wówczas około 98,0% (powierzchniowo).
Jeśli czystość substancji wyjściowych wynosi powyżej 85% (powierzchniowo), to niezawodnie osiąga się żądaną czystość powyżej 98,5%, z wydajnością 60 - 80%.
Warunki preparatywne opisano w przykładzie 1. Wszystkie próby przeprowadzono w kolumnie Prochrome®, typ LC50, o średnicy 50 mm i długości wypełnienia 12 cm. Obciążenie w każdej próbie wynosiło 6 g/litr objętości złoża, odczyn doprowadzono do wartości pH 9, a nacisk stempla wynosił 3,5 MPa.
T a b e l a 5. Oczyszczanie insuliny (bolus) działającej o różnej jakości
| No ś nik | Czystość substancji wyjściowej [% (powierzchniowo)] | Wydajność [czystość powyżej 98,5% (powierzchniowo)] |
| PLRP-S 10-15 100® | 75% | 0% |
| PLRP-S 10-15 100® | 85% | 64% |
| PLRP-S 10-15 100® | 89% | 73% |
| PLRP-S 10-15 100® | 93% | 73% |
PL 201 880 B1
Z tabeli 5 wyraźnie wynika, jak w zależności od jakości substancji wyjściowej zwiększa się wydajność procesu chromatograficznego. Próby jednoznacznie wykazują, że możliwe jest oczyszczanie w jednym, pojedynczym etapie chromatograficznym.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób chromatograficznego oczyszczania insulin, znamienny tym, że jako fazę nieruchomą stosuje się odporny na działanie ciśnienia, polimerowy chromatograficzny materiał organiczny do chromatografii w układzie faz odwróconych, faza ruchoma do elucji zawiera co najmniej jeden rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą i co najmniej jedną substancję buforową, a wartość pH wynosi 7 - 11, przy czym cząstki materiałów chromatograficznych są z polimerów organicznych, których odkształcenie pod działaniem ciśnienia do 7 MPa jest niewielkie.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wartość pH wynosi 9 - 10.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się alkohol o 1 - 4 atomach węgla.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się 1-propanol lub 2-propanol.
- 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się etanol.
- 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się keton.
- 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się octan metylu.
- 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się acetonitryl.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej wynosi 1 - 90% objętościowych.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stężenie mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej wynosi 10 - 50% objętościowych.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się elucję izokratyczną.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że elucję prowadzi się przy liniowym zwiększającym się gradiencie udziału rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą.
- 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że średnia wielkość cząstek odpornego na działanie ciśnienia, polimerowego chromatograficznego materiału organicznego wynosi 5 - 300 μm.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że średnia wielkość cząstek wynosi 10 - 50 μm.
- 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że średnia wielkość porów odpornego na działanie ciśnienia, polimerowego chromatograficznego materiału organicznego wynosi 5 - 500 nm.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że średnia wielkość porów wynosi 10 - 50 nm.
- 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odporny na działanie ciśnienia, polimerowy chromatograficzny materiał organiczny stosuje się polimetakrylan.
- 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odporny na działanie ciśnienia, polimerowy chromatograficzny materiał organiczny stosuje się polistyren-diwinylobenzen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19838097A DE19838097A1 (de) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
| PCT/EP1999/005887 WO2000011030A2 (de) | 1998-08-24 | 1999-08-11 | Verfahren zur chromatographischen reinigung von insulinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL346865A1 PL346865A1 (en) | 2002-03-11 |
| PL201880B1 true PL201880B1 (pl) | 2009-05-29 |
Family
ID=7878335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL346865A PL201880B1 (pl) | 1998-08-24 | 1999-08-11 | Sposób chromatograficznego oczyszczania insulin |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6710167B1 (pl) |
| EP (1) | EP1107988B1 (pl) |
| JP (1) | JP2002523732A (pl) |
| KR (1) | KR100703578B1 (pl) |
| CN (1) | CN1198843C (pl) |
| AT (1) | ATE380827T1 (pl) |
| AU (1) | AU756105B2 (pl) |
| BR (1) | BR9913092A (pl) |
| CA (1) | CA2341355C (pl) |
| CY (1) | CY1107877T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ300604B6 (pl) |
| DE (2) | DE19838097A1 (pl) |
| DK (1) | DK1107988T3 (pl) |
| ES (1) | ES2296407T3 (pl) |
| HK (1) | HK1039130B (pl) |
| HU (1) | HU227753B1 (pl) |
| ID (1) | ID29517A (pl) |
| PL (1) | PL201880B1 (pl) |
| PT (1) | PT1107988E (pl) |
| RU (1) | RU2222546C2 (pl) |
| TR (1) | TR200100634T2 (pl) |
| WO (1) | WO2000011030A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200101096B (pl) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
| AU2003278550A1 (en) * | 2002-12-05 | 2004-06-23 | Edupuganti B. Raju | Process for the extraction and isolation of insulin from recombinant sources |
| US6921703B2 (en) * | 2003-05-13 | 2005-07-26 | Texas Instruments Incorporated | System and method for mitigating oxide growth in a gate dielectric |
| EP1589045B1 (en) * | 2004-04-20 | 2007-03-14 | Rohm And Haas Company | Polymeric adsorbent, and method of preparation and use |
| WO2005115303A1 (en) * | 2004-05-24 | 2005-12-08 | Wockhardt Limited | Purification of insulin-like material by reverse phase chromatography |
| DE102004051807B4 (de) * | 2004-10-25 | 2008-10-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verwendung von hydrophobiertem Kieselgel als selektives Sorbens zur Entfernung von organischen Siliziumverbindungen |
| CN100368804C (zh) * | 2006-01-24 | 2008-02-13 | 李振国 | 测定注射剂中高分子量物质含量的方法 |
| JP2012532862A (ja) * | 2009-07-09 | 2012-12-20 | バイオコン リミティド | 調製用非線形勾配に基づくクロマトグラフィー法及びその精製産物 |
| EP2659501B1 (en) * | 2010-12-28 | 2017-09-06 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Quantitation of insulin by mass spectrometry |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
| PL2748181T3 (pl) | 2011-09-30 | 2016-08-31 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Sposób oczyszczania rozszczepionej proinsuliny |
| WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| CN103275210B (zh) * | 2013-06-25 | 2015-02-25 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
| WO2015138548A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| US10155799B2 (en) | 2014-07-21 | 2018-12-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of insulin and insulin analogs |
| CN105111305B (zh) * | 2015-10-10 | 2018-12-14 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
| RU2736358C2 (ru) * | 2015-12-09 | 2020-11-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Синбио" | Способ очистки полисиалированного инсулина человека |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1285024A (en) * | 1968-08-09 | 1972-08-09 | Novo Terapeutisk Labor As | Process of purifying insulin |
| NZ199391A (en) | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| US4616078A (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-07 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proinsulin-like materials |
| DE3837825A1 (de) | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE4028120C2 (de) | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| DE59208181D1 (de) * | 1991-12-18 | 1997-04-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von insulinhaltigen Lösungen |
| DK0600372T3 (da) | 1992-12-02 | 1997-08-11 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer. |
| DE4405179A1 (de) | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DK0821006T3 (da) | 1996-07-26 | 2004-08-16 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivater med öget zinkbinding |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
-
1998
- 1998-08-24 DE DE19838097A patent/DE19838097A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-08-11 DK DK99944373T patent/DK1107988T3/da active
- 1999-08-11 PT PT99944373T patent/PT1107988E/pt unknown
- 1999-08-11 AT AT99944373T patent/ATE380827T1/de active
- 1999-08-11 WO PCT/EP1999/005887 patent/WO2000011030A2/de active IP Right Grant
- 1999-08-11 DE DE59914580T patent/DE59914580D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 PL PL346865A patent/PL201880B1/pl unknown
- 1999-08-11 HU HU0103325A patent/HU227753B1/hu unknown
- 1999-08-11 CZ CZ20010646A patent/CZ300604B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 KR KR1020017002331A patent/KR100703578B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 ID IDW20010441A patent/ID29517A/id unknown
- 1999-08-11 EP EP99944373A patent/EP1107988B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 CA CA002341355A patent/CA2341355C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 CN CNB998100161A patent/CN1198843C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 TR TR2001/00634T patent/TR200100634T2/xx unknown
- 1999-08-11 RU RU2001107841/04A patent/RU2222546C2/ru active
- 1999-08-11 AU AU57331/99A patent/AU756105B2/en not_active Expired
- 1999-08-11 BR BR9913092-0A patent/BR9913092A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-08-11 JP JP2000566302A patent/JP2002523732A/ja active Pending
- 1999-08-11 ES ES99944373T patent/ES2296407T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-24 US US09/379,796 patent/US6710167B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-08 ZA ZA2001/01096A patent/ZA200101096B/en unknown
-
2002
- 2002-01-16 HK HK02100330.7A patent/HK1039130B/zh unknown
-
2008
- 2008-02-04 CY CY20081100142T patent/CY1107877T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1039130A1 (en) | 2002-04-12 |
| EP1107988A2 (de) | 2001-06-20 |
| ATE380827T1 (de) | 2007-12-15 |
| CA2341355A1 (en) | 2000-03-02 |
| HUP0103325A2 (hu) | 2001-12-28 |
| DE59914580D1 (de) | 2008-01-24 |
| ID29517A (id) | 2001-09-06 |
| CY1107877T1 (el) | 2013-06-19 |
| JP2002523732A (ja) | 2002-07-30 |
| CZ2001646A3 (cs) | 2001-09-12 |
| AU5733199A (en) | 2000-03-14 |
| RU2222546C2 (ru) | 2004-01-27 |
| HU227753B1 (en) | 2012-02-28 |
| TR200100634T2 (tr) | 2001-07-23 |
| DE19838097A1 (de) | 2000-03-02 |
| CZ300604B6 (cs) | 2009-06-24 |
| PL346865A1 (en) | 2002-03-11 |
| DK1107988T3 (da) | 2008-04-21 |
| KR100703578B1 (ko) | 2007-04-05 |
| CN1198843C (zh) | 2005-04-27 |
| US6710167B1 (en) | 2004-03-23 |
| ZA200101096B (en) | 2002-06-26 |
| EP1107988B1 (de) | 2007-12-12 |
| AU756105B2 (en) | 2003-01-02 |
| PT1107988E (pt) | 2008-01-16 |
| WO2000011030A2 (de) | 2000-03-02 |
| ES2296407T3 (es) | 2008-04-16 |
| HUP0103325A3 (en) | 2003-09-29 |
| HK1039130B (zh) | 2006-05-12 |
| CA2341355C (en) | 2009-04-07 |
| WO2000011030A3 (de) | 2000-06-02 |
| BR9913092A (pt) | 2001-10-30 |
| KR20010072914A (ko) | 2001-07-31 |
| CN1313866A (zh) | 2001-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL201880B1 (pl) | Sposób chromatograficznego oczyszczania insulin | |
| KR101761168B1 (ko) | 재조합 ｆｓｈ 정제 방법 | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| JP4519646B2 (ja) | プレプロインスリンの精製方法 | |
| JPH08512323A (ja) | タンパク精製方法 | |
| AU637255B2 (en) | A process for the purification of insulins by chromatography | |
| US20070243602A1 (en) | Immobilized biocatalytic enzymes in electrodeionization (EDI) | |
| DK173414B1 (da) | Fremgangsmåde til rensning af proinsulin-lignende materialer | |
| Stentz et al. | A rapid means of separating A14-125I-insulin from heterogeneously labeled insulin molecules for biologic studies | |
| FI108644B (fi) | Menetelmä insuliinipitoisten liuosten valmistamiseksi | |
| EP2931301B1 (en) | Process for purifying insulin and analogues thereof | |
| JP5274771B2 (ja) | クロマトグラフィー固定相の再生 | |
| Flanders et al. | Semisynthetic derivatives of glucagon:(Des-His1) N. epsilon.-acetimidoglucagon and N. alpha.-biotinyl-N. epsilon.-acetimidoglucagon | |
| MXPA01001007A (en) | Method for chromatographically purifying insulins | |
| US4528134A (en) | Method of separating A14 -125 I-insulin from heterogeneously labeled insulin molecules for biological studies | |
| Gilpin et al. | Liquid chromatographic studies of memory effects of silica Immobilized Bovine serum Albumin: I. Influence of Methanol on Solute Retention | |
| CA2592014A1 (en) | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture | |
| CN114790473A (zh) | 一种利拉鲁肽融合蛋白在位酶切和纯化的方法 | |
| Hancock et al. | Biochemical applications of preparative liquid chromatography | |
| EP0791602A1 (en) | A purification process of a human growth hormone | |
| JPH04282399A (ja) | 放射性ヨウ素標識インシュリン様成長因子ｉ |