JPH04282399A - 放射性ヨウ素標識インシュリン様成長因子ｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、放射性ヨウ素標識イン
シュリン様成長因子Ｉに関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イン
シュリン様成長因子Ｉ（以下、ＩＧＦ−Ｉと称する）は
血中に存在するインシュリン類似のペプチドであり、種
々の細胞の増殖促進作用を有しており、ソマトメジンＣ
と同一の物質でそのアミノ配列および遺伝子組換え技術
によるその製造法も知られている（例えば特開昭６１−
１３９６号公報参照）。

【０００３】このＩＧＦ−Ｉは成長促進作用から下垂体
性小人症の治療剤、低身長者の成長促進剤として、軟骨
細胞増殖作用から骨粗鬆症の予防治療剤として、あるい
は骨折の治療剤として、インシュリン様作用から糖尿病
の治療剤として、さらにたんぱく同化作用から潰瘍、外
傷、火傷の治療剤などとしての用途が知られている。

【０００４】これらＩＧＦ−Ｉの作用の研究および測定
等を行なうに当たっては、放射性ヨウ素で標識されたＩ
ＧＦ−Ｉがトレーサとして利用されてきた。しかしなが
ら、これまで報告されたもの［例えばアメリカン　　ジ
ャーナル　　オブ　　フィジオロジィ　　２４６　　Ｇ
９６（１９８４）参照］は、非標識体と部分標識体の混
合物であり、しかもその生物活性は非標識体に基づく場
合が多く、研究用トレーサーとして充分満足されるもの
ではなかった。

【０００５】この様な現状において本発明者は、単一な
放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉを開発すべく種々研究した
結果、ＩＧＦ−Ｉの２４位および６０位のチロシン残基
を放射性ヨウ素で標識したＩＧＦ−Ｉの新規誘導体を創
成した。さらに驚くべきことに、この放射性ヨウ素標識
ＩＧＦ−Ｉは、そのような放射性標識にもかかわらず、
標識前のＩＧＦ−Ｉと同等の生物活性を示すという優れ
た利点を有することが判明した。従って、本発明の放射
性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉは研究用トレーサーとして非常
に有用である。

【０００６】本発明の放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉは、
遺伝子組換え技術，ペプチド合成法，細胞培養法等によ
り製造されたＩＧＦ−Ｉを放射性ヨウ素により標識し、
それを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等によ
り単離、精製することにより得られる。

【０００７】放射性ヨウ素によりＩＧＦ−Ｉを標識する
方法としては、ラクトパーオキシダーゼ法［生化学実験
講座（東京化学同人発行）第６巻　　４７１頁、（１９
７７年）参照］の他、ヨードゲン法［バイオケミストリ
ー，１７，４８０７（１９７８）参照］、クロラミンＴ
法［ネイチャー，１９４，４９５（１９６２）参照］等
が挙げられる。例えばラクトパーオキシダーゼ法を用い
た場合は次の様にして行なわれる。

【０００８】放射性ヨウ素を含むヨウ化ナトリウム溶液
，ＩＧＦ−Ｉ，ラクトパーオキシダーゼおよび過酸化水
素水を順次加え反応させる。反応温度は通常冷却乃至室
温程度で行なわれる。続いてナトリウムアジドを加え反
応をストップさせた後、逆相ＨＰＬＣカラム等を用いて
脱塩すると、放射性ヨウ素で標識した標識ＩＧＦ−Ｉと
非標識体の混合物を得ることができる。

【０００９】この様にして得られた反応混合物をＨＰＬ
Ｃ，ゲル濾過，イオン交換カラムクロマトグラフィー等
のペプチド精製法に付すことにより、又はこれらの各操
作の組合せにより精製できる。例えばラクトパーオキシ
ダーゼ法により標識された混合物は、逆相ＨＰＬＣカラ
ムを用い、移動相としてアセトニトリル−トリフルオロ
酢酸−ペンタンスルホン酸ナトリウム水溶液等を用いた
直線濃度勾配溶出を１回または数回行なうことにより、
目的の放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉを単離することがで
きる。この様にして得られた放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−
Ｉは、その本来の生物活性を保持している。

【００１０】

【実施例】以下実施例により本発明を説明する。ポリプ
ロピレンチューブ（１．５　ｍｌ）に　１２５Ｉを含む
ヨウ化ナトリウム（１３１ｎ　ｍｏｌ／５　μｌ，０．
１ｍ　Ｃｉ），ＩＧＦ−Ｉ（０．５　ｍｇ／１５０μｌ
），ラクトパーオキシダーゼ（８３．５μｇ／１０μｌ
），過酸化水素（５．６３　μｇ／６　μｌ）を順次加
え、２５℃にて１０分間反応させた。続いてナトリウム
アジド（５６．３　μｇ／２４μｌ）を加え、反応を停
止させた後、４％酢酸（８００μｌ）を添加し、Ｓｅｐ
−ｐａｋ　　Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に付
した。４％酢酸（１０ｍｌ）で２回洗浄した後、メタノ
ール（５ｍｌ）で溶出した画分を得た。この画分を減圧
濃縮し、４％酢酸（３００μｌ）に再溶解した後、３回
に分けてＨＰＬＣを行った。

【００１１】ＨＰＬＣは、ＨＰＬＣ用カラム、コスモシ
ル１０Ｃ１８（４．６　×２５０ｍｍ）（ナカライテス
ク）を用い、２７％アセトニトリル−０．０８％トリフ
ルオロ酢酸−５ｍＭペンタンスルホン酸ナトリウム水溶
液から、３８％アセトニトリル−０．０８％トリフルオ
ロ酢酸−５ｍＭペンタンスルホン酸ナトリウム水溶液を
用いた直線濃度勾配溶出（１ｍｌ／分，６０分，３５℃
）により行なった。検出は、２７０ｍｍの吸光度及び　
１２５Ｉの放射活性を測定することにより行った。保持
時間２６分のもっとも大きなピークの画分を減圧濃縮後
、同カラムを用い２７％アセトニトリル−０．０８％ト
リフルオロ酢酸水溶液から３８％アセトニトリル−０．
０８％トリフルオロ酢酸水溶液を用いた直線濃度勾配溶
出（１ｍｌ／分，６０分）で２回のリクロマトグラフィ
ーを行い単一の挙動（保持時間：１３分）を示す画分（
２４位および６０位のチロシン残基が　１２５Ｉで標識
されたＩＧＦ−Ｉ）を得た。収率は３２％，比放射能は
４７ｎ　Ｃｉ／　μｇ）であった。

【００１２】ペプチドマッピング：ポリプロピレンチュ
ーブ（１．５　ｍｌ）　中で上記で得られた放射性ヨウ
素標識ＩＧＦ−Ｉ（１２．８ｎ　ｍｏｌ）を６Ｍグアニ
ジン，１０ｍＭ−ＥＤＴＡを含む０．５　Ｍ−Ｔｒｉｓ
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）（８４０μｌ）に溶解し、２
−メルカプトエタノール（１１．５μｍｏｌ）を加え還
元を行った（窒素ガス下，５０℃，２時間）。反応混合
液に４−ビニルピリジン（３４．５μｍｏｌ）を加えて
反応を行い（窒素ガス下，室温，９０分）、さらに水に
対し透析（３リットル　，１２時間，３回）し、凍結乾
燥を行ない還元アルキル化放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉ
を得た。

【００１３】上記化合物を８Ｍ尿素を含む５０ｍＭ−Ｔ
ｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（６４μｌ）に溶解し
、３倍量の５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液を加えた後、
トリプシン溶液（０．１　ｍｇ／ｍｌ）　（２０μｌ）
を加え８時間消化し、さらに等量のトリプシン溶液を加
えて４時間消化して凍結することにより反応を停止した
。

【００１４】上記還元アルキル化後トリプシン分解した
放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉをコスモシル１０Ｃ１８カ
ラム（４．６　×２５０ｍｍ）を用い、５％アセトニト
リル−６４ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液から６０％
アセトニトリル−１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶
液の直線濃度勾配溶出（１ｍｌ／分，１００分）で、断
片ペプチドを分画し、更に同じカラムを用いて５％アセ
トニトリル−０．０８％トリフルオロ酢酸水溶液から、
５０％アセトニトリル−０．０８％トリフルオロ酢酸水
溶液により、リクロマトグラフィーを行った。放射活性
の認められた３つのピークＴ−１５，Ｔ−３４，Ｔ−３
９について、ダブシルクロライドによるプレラベル法を
用いてアミノ酸組成分析を行った。その結果、Ｔ−１５
は５７位から６５位のペプチド、Ｔ−３４は２２位から
２７位のペプチド、Ｔ−３９は５６位から６８位のペプ
チドであると考えられた。 従って上記放射性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ
の２４位および６０位のチロシン残基が　１２５Ｉで標
識されていることを確認した。

【００１５】生物活性：上記で得られた放射性ヨウ素標
識ＩＧＦ−ＩをＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞を用いる増殖活
性を用いた方法［生化学６０（８）６９６（１９８８）
参照］に従って測定したところ標識前のＩＧＦ−Ｉと同
等の生物活性を示した。

【００１６】安定性：上記で得られた放射性ヨウ素標識
ＩＧＦ−Ｉの化学的安定性は下記の通りであった。即ち
該化合物（１６．５μｌ）を−２０℃にて保存後各々１
，２，３週間後及び１カ月後に、コスモシル１０Ｃ１８
カラム（４．６　×２５０ｍｍ）を用いるＨＰＬＣ分析
を行ない検討した結果同一の保持時間で単一のピークを
認めた。生物学的安定性についても同様−２０℃で３カ
月保存後測定した結果変化はなかった。従って上記放射
性ヨウ素標識ＩＧＦ−Ｉは化学的にも生物学的にも安定
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　インシュリン様成長因子Ｉの２４位お
   よび６０位のチロシン残基が放射性ヨウ素で標識された
   放射性ヨウ素標識インシュリン様成長因子Ｉ。