DK173414B1 - Fremgangsmåde til rensning af proinsulin-lignende materialer - Google Patents

Description

i DK 173414 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til separation af urenheder fra en uren blanding indeholdende et proinsulin-lignende materiale.

5 Proteiner er biopolymere, som er afhængige af en strukturel stabilitet for at kunne udføre deres specificerede funktion. Eftersom som blot små ændringer i opløsningsmidlets sammensætning, pH, temperatur og saltkoncentration ofte kan bevirke en signifikant og 10 undertiden irreversibel ændring i proteinets konfor-mation, har den chromatografiske rensning af proteiner mest ideelt været foretaget ved anvendelse af harpikser, som kun i minimal udstrækning udviser ikke-specifikke, denaturerende vekselvirkninger. Klassisk set har sådanne 15 harpikser generelt været ekstremt hydrofile, idet de har et vandindhold, der ofte overstiger 80%. Som et resultat af deres hydrofile natur er de resulterende partikler af den chromatografiske harpiks meget tilbøjelige til at bryde sammen, selv under moderat modtryk. Desuden kan 20 enhver ikke-specifik adsorption være vanskelig at fortrænge som følge af en manglende evne til på effektiv måde at vaske disse hydrofile harpikser med organiske opløsningsmidler. Som følge heraf stilles man overfor et problem i det første trin af den præparative oprensning 25 af proteiner fra heterogene naturlige kilder. De mere ønskelige bærere er, på grund af deres hydrofile natur, uhensigtsmæssige til hurtig gennemledning af viskose, slam-mættede blandinger af naturlige produkter. Som et resultat heraf har det været nødvendigt ved den indle-30 dende rensning at anvende ikke-chromatografiske metoder, hvilket er ensbetydende med betydelige yderligere udgifter.

DK 173414 B1 2

Amberlite *XAD harpikser er polymere makroretikulære adsorbenter, som fremstilles kommercielt af Rohm and Haas Company. Disse produkter er beregnet til en separation af forbindelser baseret på forskelle i affinitet over for en 5 polymer hydrofob overflade. Eftersom harpikser af XAD-typen (1) har en stor partikelstørrelse (20 - 50 mesh svarende til 300 - 840 ym) og (2) er ekstremt hydrofobe, ville enhver praktisk udnyttelse af sådanne harpikser til chromatografi af komplekse biologiske blandinger af 10 strukturelt ensartede peptider og proteiner være overraskende. Faktisk findes der heller ingen rapporter, som giver detaljer med hensyn til disse bærermaterialers arbejdsparametre ved rensning af proteiner. De ovennævnte to egenskaber hos harpikser af XAD-typen gør dem 15 imidlertid på overraskende måde overordentligt effektive til anvendelse i de indledende trin ved rensning af meget urene, slam-mættede blandinger, som både indeholder strukturelt forskellige og strukturelt ensartede proteiner. Det ville være korrekt at forvente, at de 20 store og heterogene partikelstørrelser, som kendetegner harpikser af XAD-typen, i væsentlig grad ville formindske de chromatografiske egenskaber af produkterne på grund af vekselvirkningens langsomme og uregelmæssige dynamik. Som følge heraf ville man være tilbøjelig til at undgå at 25 anvende sådanne harpikser i forbindelse med oprensning af proteiner og polypeptider. Denne tilsyneladende mangelfuldhed har imidlertid overraskende vist sig at være en fordel til rensningsformål, når produktet anvendes under præcist definerede betingelser til 30 rensning af meget urene, slam-mættede materialer, der indeholder proinsulin-lignende materialer.

Ved rensning af sådanne proinsulin-lignende materialer er det desuden af praktisk betydning, at harpikser af XAD- DK 173414 B1 3 typen (1) er let tilgængelige til moderate priser, (2) er fuldstændigt stabile inden for hele pH-området fra 1 til 13 og (3) lader sig underkaste regenerering i kolonnen med vandige detergenter og organiske opløsningsmidler.

5

Bortset fra en helt generel omtale beskriver litteraturen ikke anvendelsen af harpikser af XAD-typen til rensning af proteiner og polypeptider. Pietrzyk, D. J. og Stodola, J. D., Anal. Chem. £3, 1822-1828 (1981) var de første, 10 som analytisk undersøgte XAD-4, som er en polystyren-divinylbenzen-copolymer, med hensyn til anvendelse med syntetiske dipeptider. En yderligere undersøgelse [Pietrzyk, D.J., Cahill, W. J. og Stodola, J. D., J.

Liquid Chrom. 5, 443-461 (1982)] med syntetiske peptider 15 på helt op til 5 rester afslørede muligheden af at opnå en rimeligt effektiv præparativ rensning på XAD-4-harpikser, som forinden er blevet findelt og sorteret til signifikant mindre partikler. Mens disse undersøgelser således viste, at små peptider kunne chromatograferes på 20 makroporøse hydrofobe harpikser, rejste de ikke spørgsmålet om, hvorvidt blandinger af betydeligt større og væsentligt mere komplekse proteiner på effektiv måde kunne separeres fra stærkt urene blandinger ved anvendelse af bærere med stor partikelstørrelse.

25

Fra dansk patentansøgning nr. 4590/70 kendes en fremgangsmåde til separering af et polypeptid fra en vandholdig væske. Ved fremgangsmåden separeres polypeptider fra en vandholdig væske ved at bringe væsken 30 i kontakt med en makroretikulær harpiks og fremkalde adsorption af polypeptidet på harpiksen, og at polypeptidet efterfølgende elueres fra harpiksen med en elueringsblanding indeholdende vand, et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel og en ioniserende DK 173414 B1 4 forbindelse, som er opløselig i blandingen. Fremgangsmåden har den ulempe, at blandingerne skal være rensede, f.eks. ved sining eller filtrering, inden den bringes i kontakt med harpiksen. Endvidere indeholder 5 elueringsvæsken et salt, hvilket kan få polypeptiderne til at udfælde.

De vanskeligheder, der er forbundet med oprensning af proteiner fra stærkt urene kilder, har vist sig særligt 10 åbenbare med fremkomsten af rekombinant-DNA-teknologien og dennes anvendelse ved kommerciel fremstilling af peptider og proteiner. Enhver kommercielt gennemførlig ud-trykkelse af et produkt ved rekombinant-DNA-metodik kræver også en isolation af det rekombinant-DNA-afledte pro-15 dukt fra de urenheder, som findes i fermenteringsvæskerne såvel som i de blandinger, der opstår gennem de efterfølgende kemiske behandlinger og/eller andre behandlinger. Det er således blevet af afgørende betydning at finde nye teknikker til oprensning af proteiner i kom-20 merciel målestok.

En endnu mere komplicerende faktor ved oprensning af proteiner, der hidrører fra rekombinant-DNA-kilder, opstår ved, at der i mange sådanne proteiner er cysteinyl-rester 25 til stede. Efter rekombinant udtrykkelse af cystein-holdige proteiner er det i de fleste tilfælde nødvendigt, at cysteinyl-sulfhydryl-grupperne bliver reversibelt beskyttet, generelt ved omdannelse til S-sulfonater, inden man påbegynder en oprensning af proteinet. Denne 30 omdannelse fører nødvendigvis til frembringelse af yderligere mængder uønskede, slam-lignende urenheder i nærværelse af stærkt viskose denaturerende midler, hvorfra det ønskede protein først må separeres.

DK 173414 B1 5

Som et specifikt eksempel herpå kan man nævne, at re-kombinant-DNA-produceret insulin generelt er tilgængeligt via en af to procesveje. Ved den ene procesvej bliver insulinets A-kæde og B-kæde udtrykt og isoleret hver for 5 sig, hvorefter kæderne kombineres kemisk til frembringelse af insulinet. Ved den anden procesvej udtrykkes en ligekæde proinsulin-præcursor, som herefter isoleres. Derpå renatureres produktet oxidativt til pro-insulin, og proinsulinet transformeres enzymatisk til 10 insulin.

Begge metoder til fremstilling af udtrykkelse af insulin involverer den samme sekvens bestående af kemisk omdannelse og rensning, som enten fører til insulin-A-kædens 15 S-sulfonat eller insulin-B-kædens S-sulfonat. Dette S- sulfonat er parat til kombination til insulin eller til proinsulin-S-sulfonat, der ved disulfid-udveksling kan omdannes til proinsulin.

20 Alle disse tre S-sulfonater, insulin A-kæde, insulin-B-kæde eller proinsulin, opnås generelt ved den følgende sekvens: (1) Udtrykkelse af et produkt, der indeholder den ønskede 25 peptid-sekvens, som ved amino-terminalen via en methionyl-rest er knyttet til en fremmed peptid-sekvens, (2) spaltning af den ønskede sekvens fra den fremmede del under anvendelse af cyanogenbromid og 30 ~ “ (3) sulfitolyse af peptidets cysteinyl-thiol-grupper til frembringelse af de tilsvarende S-sulfonater.

DK 173414 B1 6

For at gøre processer af denne type kommercielt gennemførlige er det nødvendigt at frembringe metoder, som tillader en fjernelse af slam, salt, organiske opløsningsmidler og andre kontaminanter fra det ønskede pro-5 dukt (uanset om et sådant produkt er et slutprodukt eller et mellemprodukt) under et ringe (eller slet intet) tab af det pågældende produkt.

Man har nu fundet en særdeles fordelagtig proces til for-10 øgelse af renheden af proinsulin-lignende materialer hidrørende fra meget urene råmaterialer, i særdeleshed sadanne, som opnås via rekombinant-DNA-metoder. Processen består i, at man underkaster det urene materiale en rensning i omvendt fase på en makroporøs harpiks-bærer 15 bestående af en acrylatester-copolymer. Ved processen opnås i det væsentlige fuldstændig udvinding af det proinsulin-lignende materiale.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til at sepa-20 rere urenheder fra en uren blanding indeholdende et proinsulin-lignende materiale især udvalgt blandt proinsulin, præcursorer til proinsulin, derivater af proinsulin eller dets præcursorer samt analoge til proinsulin og dets præcursorer, og fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen er ejendommelig ved, at man (1) overfører blandingen til en makroporøs harpiks-bærer i omvendt fase bestående af en acrylatester-copolymer ved en pH-værdi på mellem ca. 7 og ca. 10, hvorefter man 30 (2) eluerer det proinsulin-lignende materiale fra bæreren med et vandigt elueringsmiddel, der har en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 11, og som indeholder fra omkring 10 til omkring 30 vol.-I af et organisk fortyndingsmiddel DK 173414 B1 7 valgt blandt acetone, acetonitril og blandinger af acetone og acetonitril.

Som nævnt ovenfor er fremgangsmåden ifølge opfindelsen 5 rettet imod rensning af stærkt forurenede blandinger, der indeholder et proinsulin-lignende materiale. Betegnelsen "proinsulin-lignende materiale” betyder (1) proinsulin i sig selv af en hvilken som helst art, f. eks. humant proinsulin eller okse- eller svine-proinsulin, (2) 10 præcursorer for proinsulin, såsom reduceret (-SH) proinsulin og S-beskyttet proinsulin, f. eks. proinsulin- S-sulfonat, (3) derivater af proinsulin eller dettes præcursorer, f. eks. strukturer, som er blevet modificeret for at forlænge og/eller afkorte A-kæden, B-15 kæden, C-peptidet eller en kombination af disse tre strukturer, og (4) analoge af proinsulin eller dettes præcursorer, f. eks. strukturer, hvori proinsulinets aminosyresekvens er blevet modificeret gennem udskiftning af en eller flere aminosyrerester.

20

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen involverer anvendelsen af en makroporøs acrylatester-copolymer-harpiks som chro-matografisk bærer. Sådanne copolymer-harpiks-adsorbenter er velkendte for fagmanden. To sådanne bærermaterialer, 25 som er særdeles velegnede til opfindelsens formål, kan fås fra Rohm and Haas Company, og de har betegnelserne XAD-7 og XAD-8. Af disse to materialer er XAD-7 særligt foretrukkent til opfindelsens formål.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opdeles i tre chro-matografiske trin. Imidlertid er kun to af disse trin obligatoriske. Processen må nødvendigvis omfatte et ladnings- og et desorptionstrin, og fortrinsvis omfatter den tillige et mellemliggende udvaskningstrin. Endvidere DK 173414 B1 8 kan processen enten gennemføres batch-vis, eller den kan gennemføres i en kolonne, men af hensyn til en effektiv rensning foretrækker man absolut at gennemføre processen under kolonnebetingelser. Uanset om fremgangsmåden ifølge 5 opfindelsen gennemføres batch-vis eller i kolonne, forbliver de bestemte betingelser, som er grundlæggende for en god gennemførelse af fremgangsmåden, og som danner basis for opfindelsen, konstante.

10 Den komplicerede blanding, som indeholder det proinsulin-lignende materiale, der anvendes i ladningstrinnet ifølge opfindelsen, opnås generelt som et resultat af en række forudgående behandlingstrin, og sluttelig opnås den som et resultat af en udtrykkelse ved rekombinant-DNA-15 metodik. Sædvanligvis udtrykkes et produkt som indeholder en aminosyresekvens, hvoraf i det mindste en del svarer til aminosyresekvensen af proinsulin eller et derivat eller en analog deraf. Udtrykkelsesproduktet vil normalt indeholde et selektivt kløvningssted, som tillader en 20 kemisk eller enzymatisk dannelse af det proinsulin-lignende materiale ud fra det langkædede udtrykkel-sesprodukt. Generelt vil det selektive kløvningssted være repræsenteret af en methionin-rest, og fraspaltningen af en sådan rest ved carboxy-terminalen kan foretages 25 effektivt ved anvendelse af cyanogenbromid og velkendte betingelser. Som et resultat af fermenteringen og den efterfølgende CNBr-spaltning vil den resulterende urene blanding indeholde en lang række peptider sammen med en ledsagende kompliceret blanding af slam og andre 30 materialer samt små mængder reduceret proinsulin-lignende materiale.

Sædvanligvis behandles blandingen derefter under velkendte betingelser i nærværelse af store mængder urinstof i DK 173414 B1 9 (generelt omkring 7 M) til frembringelse af en beskyttende sulfitolyse af de frie sulfhydrylgrupper i de reducerede proinsulin-lignende materialer. Den resulterende blanding, som er fyldt med slam, og som inde-5 holder urinstof, indeholder også beydelige mængder organiske opløsningsmidler og udviser en høj ledningsevne. Blandingen repræsenterer det typiske materiale ("uren blanding"), som overføres til den makroporøse acrylat-ester-copolymer i batch eller kolonne i overensstemmelse 10 med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Når man overfører et materiale af den ovenfor beskrevne art, indstiller man pH i den slam- og urinstof-holdige blanding til mellem ca. 7 og ca. 10, fortrinsvis mellem 15 ca. 8 og ca. 9, hvorefter man bringer den resulterende opløsning i kontakt med den makroporøse acrylatester-copolymer.

Når dette ladningstrin er afsluttet, vaskes harpiksen 20 fortrinsvis med en vandig puffer, der har en pH-værdi påmellem ca. 7 og ca. 8,5, fortrinsvis omkring 8. Man kan anvende en lang række forskellige puffere, herunder eksempelvis Tris, ethylendiamin og lignende. En foretrukken puffer er ethylendiamin." 25 ________ III______

Efter fuldstændig ladning af harpiksen eller efter udvaskning, hvis et sådant trin er inkluderet, elueres det proinsulin-lignende materiale i det væsentlige fuldstændigt fra kolonnen, hvorved det foreligger befriet for 30 slam og i en væsentligt forøget renhed og koncentration.

Ved en i det væsentlige fuldstændig udvinding forstås en udvinding på mellem ca. 30 og ca. 100% af det proinsulin-lignende materiale, som var til stede i den urene udgangsblanding. De obligatoriske betingelser for en DK 173414 B1 10 praktisk eluering af det adsorberede proinsulin-lignende materiale er det foreskrevne pH-område og sammensætningen af elueringsmidlet. Den påkrævede pH-værdi er i området fra omkring 8 til omkring 11, fortrinsvis fra omkring 9,5 5 til omkring 10,5. Det vandige elueringsmiddel skal på volumenbasis indeholde fra omkring 10 til omkring 30% acetone, acetonitril eller en blanding af disse to forbindelser. Mængden af acetone eller acetonitril, som er til stede i elueringsmidlet, er fortrinsvis fra 10 omkring 15 til omkring 25%.

Den samlede proces ifølge opfindelsen kan gennemføres over et bredt temperaturområde, f. eks. ved en hvilken som helst temperatur på mellem ca. 4 og ca. 45 °C. Af 15 bekvemmelighedsgrunde foretrækker man imidlertid, at processen gennemføres ved omgivelsestemperatur.

Den vandige organiske opløsning, der opnås som eluat ved processen ifølge opfindelsen, indeholder et proinsulin-20 lignende materiale, som er uden indhold af kontaminerende slam, urinstof og salte, og som har en væsentligt højere renhed end den oprindelige blanding, der blev overført til den makroporøse acrylatester-copolymer-harpiks. Det resulterende proinsulin-lignende materiale kan udvindes 25 fra eluatet ved rutineteknikker, eller selve opløsningen kan anvendes til yderligere oparbejdning af materialet.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

30 DK 173414 B1 11 EKSEMPEL 1

Rensning af humant proinsulin-S-sulfonat 5 En XAD-7-harpiks med en partikelstørrelse på 20 - 50 mesh (300 - 840 pm) (kan fås fra Rohm and Haas Company) blev befugtet med acetone i en mængde på 10 ml/g i 6 timer ved stuetemperatur. Derefter blev harpiksen vasket ekstensivt med acetone, 0,1 N NaOH, vand, 0,1 N HC1, vand og 100 mM 10 ethylendiamin/7 M urinstof, pH 8,0, i den angivne rækkefølge. Mens harpiksen befandt sig i væsken fra den sidste udvaskning med urinstof, blev den pakket i en 2,2 x 100 cm chromatografisk kolonne ved et konstant tryk på 15 psi (1,05 kg/cnr). Da kolonnen var blevet pakket, 15 udviste den en homogen blanding af harpiks-partikler med forskellig størrelse.

Der fremstilledes et cellelysat, som indeholdt et rekom-binant-DNA-udtrykt chimert protein. Det chimere protein 20 indeholdt en ledersekvens af aminosyrer, som via en me-thionin-rest var knyttet til en aminosyresekvens svarende aminosyresekvens i humant proinsulin. Lysatet blev først behandlet med cyanogenbromid til frembringelse af en kløvning af det chimere protein ved hver methionin-rest 25 med henblik på at frigøre et molekyle, som var bærer af sekvensen for humant proinsulin. Derefter blev lysatet behandlet under sulfitolyse-betingelser til sul-fitolysering af enhver cysteinyl-rest, som var til stede i reaktionsblandingen indeholdende lysatet.

30

En opløsning af 75 mg af denne komplicerede blanding af faste stoffer, som opnåedes ved de ovenfor beskrevne reaktioner, blev opløst i 7 M urinstof ved pH 8,5. Opløsningen blev overført til den tidligere beskrevne chroma- DK 173414 B1 12 tografiske kolonne ved stuetemperatur med en strømningshastighed pa omkring 30 cm/time. Kolonnen blev fyldt med en mængde materiale, der repræsenterede 1 til 2 g proin-sulin-S-sulfonat pr. liter kolonnevolumen.

5

Derefter blev kolonnen vasket med et kolonnevolumen 10 mM ethylendiamin, pH 8,5, hvorpå protein-S-sulfonatet blev elueret med 20 mM ethylendiamin, pH 9,5, indeholdende 20% acetone. Proinsulin-S-sulfonatet blev udvundet i et 10 udbytte på over 90%, og det var fuldstændigt uden indhold af slam og organiske kontaminanter fra CNBr-spaltningen, ligesom det var uden indhold af sulfitolyse-reagenser, herunder urinstof, og havde en renhed, der var omkring 10 gange så høj som normalt.

15 EKSEMPEL 2

Vigtige parametre ved oprensning af humant protein-S-sulfonat fra faste fermenteringsprodukter 20

Idet man anvendte faste fermenteringsprodukter frembragt som beskrevet i eksempel 1, gennemførte man en serie af batch-rensninger. Proceduren ved en sådan batch-rensning involverer en udvaskning af XAD-7-harpiksen med organiske 25 opløsningsmidler, en vandig syre og en vandig base samt en opbevaring af harpiksen i form af en befugtet opslæmning i 10 mM ethylendiamin, pH 8,5, på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Forud for ladningen skylles harpiksen fri for fremmed opløsningsmiddel og vejes i 30 form af våde partikler. Til en på forhånd bestemt mængde harpiks sattes, under forsigtig omrystning, en ladningsopløsning bestående af faste fermenteringsprodukter indeholdende proinsulin-S-sulfonat i en kendt koncentration og renhed. Temperatur, pH, ledningsevne og opløsnings- DK 173414 B1 13 middelsammensætning i ladningsopløsningen blev varieret systematisk. Man overvågede protein-adsortionens kinetik ved analytisk chromatografi i omvendt fase af en prøve af ladningsopløsningen efter centrifugering. Når først den 5 ønskede ladning var blevet opnået, blev harpiksen befriet for det fremmede opløsningsmiddel. En afladning af det adsorberede protein blev iværksat ved at vaske hvert gram af den ladede harpiks med 10 ml 10 mM vandig ethylendiamin ved pH 8,5. Da hapiksen var blevet befriet 10 for fremmed opløsningsmiddel til udvaskning, blev den suspenderet og omrystet med afladningsopløsningen. Opløsningsmiddelsammensætningen af afladningsopløsningen og forholdet imellem vægten af opløsningsmiddel og vægten af harpiks blev varieret systematisk for at maksimere 15 afladningsudbyttet og renheden af det ønskede produkt. Proteinets afladningskinetik blev, ligesom ladningskinetikken bestemt ved analytisk chromatografi i omvendt fase.

20 De efterfølgende tabeller 1-5 viser betydningen af en række forskellige parametre, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, herunder egenskaberne af den anvendte harpiks, ladningsbetingelserne og eluerings-betingelserne. Ved målingerne er anvendt batch-25 metodikken.

Tabel 1 viser, at XAD-7, som er en acrylat-copolymer, er fremragende med hensyn til ladningshastighed og effektivitet i sammenligning med beslægtede polystyren-har-30 pikser.

14 DK 173414 B1

Tabel 1

Harpiks-udvælgelse 5 Tid, proinsulin-S-sulfonat, % adsorberet3 timer Xad~2t Xad-4* Xad-7C HP-20b 0 0 0 0 0 10 1,5 45 37 96 77 6 59 57 97 94 24 98 98 3Proinsulin-S-sulfonatadsorption bestemt ved 15 chromatografisk analyse afsupernatanten i omvendt fase.

bDivinylbenzen-polystyren-copolymer.

:Divinylbenzen-acrylatester-copolymer.

20 øzeSom det fremgår af den ovenstående tabel, er praktisk talt hele mængden af proinsulin-S-sulfonat blevet absorberet på XAD-7 efter 1,5 timer eller derunder, hvorimod den bedste af polystyren-harpikserne var 3 gange så lang tid om at opnå et sammenligneligt niveau.

25

Tabel 2 illustrerer nogle af de pH- og temperaturbetingelser, som er nyttige evd ladningen af kolonnen i overensstemmelse med opfindelsen.

30

Tabel 2 DK 173414 B1 15

Hastighed af proinsulin-S-sulfonatets ladning på XAD-7: Temperatur- og pH-virkning 5 proinsulin-S-sulfonat, % adsorberet

Tid,_pH (ved 25 °C)_Temp., C (ved pH 8) timer 7_8_9_4_25_45 10 0 0 0 0 0 0 0 1 71 66 73 60 66 73 3, 5 91 88 ' 90 78 88 73 5 97 94 96 86 94 97 24 >99 >99 >99 >99 >99 >99 15

Selv om der sker en tilsyneladende ladning ved pH-værdier på under ca. 7, resulterer fænomenet uventet i en tilstand, som gør det ekstremt vanskeligt, om ikke umuligt, at eluere produktet fra kolonnen.

20

Tabel 3 illustrerer det kritiske ved udvælgelse og kontrol af pH til eluering af produktet fra den passende ladede kolonne.

25

Tabel 3 DK 173414 B1 16

Hastighed af proinsulin-S-sulfonat-afladning: pH-virkning 5 Tid,

timer 2,5b 4.5b 6,5b 8,5C 9,5C 10,5C

o o o o 0 0 0 2 0 0 0 35 46 61 106 0 0 0 30 47 60 24 0 0 0 24 49 59 ’Betingelser for desorption: Til 1 g harpiks, som var blevet ladet med en maksimal mængde proinsulin-S-sulfonat 15 under anvendelse af den sulfitolyse-reaktionsopløsning, som opnåedes ved sulfitolyse af et CNBr-behandlet rekombinant-DNA-fermenteringslysat, sattes (ved 4 °C) 5 ml af en vandig puffer med varierende pH indeholdende 30% acetone.

20 r10 mM vandig ammoniumphosphat acetone-puffer '10 mM vandig ethylendiamin acetonepuffer 25 Tabel 4 illustrerer betydningen af et passende valg af det organiske opløsningsmiddel, som anvendes ved afladning af produktet.

Tabel 4 DK 173414 B1 17

Hastighed af proinsulin-S-sulfonatafladning: Virkning af organisk opløsningsmiddel 5

Tid, proinsulin-S-sulfonat, % desorberet* organisk opløsningsmiddel i puffer timer acetonitril acetone 1-propanol ethanol 10 0 0 0 0 0 1,5 37 50 7 10 3 38 55 8 12 5 39 55 8 13 24 36 52 12 9 15 'Betingelse for desorption: Til 1 g harpiks, som var blevet ladet med en maksimal mængde proinsulin-S-sulfonat uner anvendelse af den sulfitolyse-reaktionsopløsning, som opnåedes ved sulfitolyse af et CNBr-behandlet 20 rekombinant-DNA-fermenteringslysat, sattes (ved 4 °C) 6 ml 10 mM ethylendiamin, pH 9,0, der indeholdt 30% organisk opløsningsmiddel i et vandigt medium.

Tabel 5 illustrerer den kritiske betydning af koncentra-25 tionsområdet af det organiske opløsningsmiddel.

DK 173414 B1 18

Tabel 5

Hastighed af proinsulin-S-sulfonat-afladning: Virkning af 5 koncentrationen af organisk opløsningsmiddel

Tid, proinsulin-S-sulfonat, % desorbret3 acetone, 3 elueringspuffer timer_0 5 10 15 20 30 10 0 0 0 0 0 0 o 1,5 25 52 65 70 81 60 6 31 55 70 68 79 60 15 'Betingelse for desorption: De samme angivet for tabel 4 med den undtagelse, at pufferens pH blev forøget til 10,5. De ovenfor angivne tal for den procentvise desorption repræsenterer tilnærmelsesvis de maksimale værdier, som kan opnås ved ikke-kolonne (batch) metodik.

20 i

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til separation af urenheder fra en uren 5 blanding indeholdende et proinsulin-lignende materiale især udvalgt blandt proinsulin, præcursorer til proinsulin, derivater af proinsulin eller dets præcusorer samt analoge til proinsulin og dets præcursorer, kendetegnet ved, at man 10 (1) overfører blandingen ved en pH-værdi på mellem ca. 7 og ca. 10 til en makroporøs bærer i omvendt fase bestående af en acrylatester-copolymer-harpiks, hvorefter man 15 (2) eluerer det proinsulin-lignende materiale fra bæreren med et vandigt elueringsmiddel, der har en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. II, og som indeholder fra omkring 10 til omkring 30 vol.-% af et organisk fortyndingsmiddel valgt blandt acetone, acetonitril og blandinger af 20 acetone og acetonitril.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det proinsulin-lignende materiale har en ami-nosyresekvens, som svarer til aminosyresekvensen af hu- 25 mant proinsulin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det proinsulin-lignende materiale er en præcursor for proinsulin. 30

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det proinsulin-lignende materiale er proinsulin- S-sulfonat. DK 173414 B1

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den makroporøse acrylatester-copolymer-bærer er XAD-7 eller XAD-8. 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den urene blanding, som indeholder et proinsulin-lignende materiale, behandles under batch-betingelser.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den urene blanding, som indeholder et proinsulin-lignende materiale, behandles under betingelser, der modsvarer betingelserne i en chromatografisk kolonne.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendeteg net ved, at den urene blanding, som indeholder et proinsulin-lignende materiale, overføres til den makroporøse acrylatester-copolymer-bærer ved en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 9.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at man efter overføring af den urene blanding til bæreren og forud for elueringen vasker bæreren med en vandig puffer, der har en pH-værdi på mellem ca. 7 og ca. 25 8, 5.

10. fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det proinsulin-lignende materiale elueres fra bæreren ved hjælp af et vandigt elueringsmiddel, der har 30 en pH-værdi på mellem ca. 9,5 og ca. 10,5.