HU205138B - Process for purifying proinsulin and its s-sulfonate - Google Patents

Process for purifying proinsulin and its s-sulfonate Download PDF

Info

Publication number
HU205138B
HU205138B HU861419A HU141986A HU205138B HU 205138 B HU205138 B HU 205138B HU 861419 A HU861419 A HU 861419A HU 141986 A HU141986 A HU 141986A HU 205138 B HU205138 B HU 205138B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
proinsulin
sulfonate
resin
mixture
xad
Prior art date
Application number
HU861419A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT40680A (en
Inventor
Richard Dennis Dimarchi
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT40680A publication Critical patent/HUT40680A/hu
Publication of HU205138B publication Critical patent/HU205138B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány proinzulin és S-szulfonátja tisztítására alkalmas javított eljárásra vonatkozik.
A proteinek biopolimerek, amelyek szerkezeti stabilitásuktól függően látnak el meghatározott feladatokat. Mivel az oldószer-összetételben, a pH-ban, a hőmérsékletben és a sókoncentrációban mutatkozó csekély változás gyakran jelentős és esetenként visszafordíthatatlan változást okozhat a proteinszerkezetben, a kromatográfiás proteintisztítás ideálisnak bizonyult olyan gyanták használata esetén, amelyek a lehető legkisebb nem specifikus bomlasztó kölcsönakciókat okoznak. Rendesen az ilyen gyanták rendkívül hidrofilok és gyakran 80% víztartalommal rendelkeznek. Hidrofil természetük eredményeként a keletkező kromatográfiás gyantarészecskék igen hajlamosak az összeesésre még csekély ellennyomás esetén is. Ezenkívül bármely nem specifikus adszorpció nehezen helyettesíthető amiatt, hogy nem lehet hatékonyan mosni ezeket a hidrofil gyantákat szerves oldószerekkel. Emiatt az ember nehézségekbe ütközik heterogén, természetes forrásokból származó proteinek preparatív tisztításának kezdetén. A legszívesebben használatos hordozóanyagok - hidrofil természetük miatt - alkalmatlanok viszkózus, iszappal terhelt, természetes eredetíí termékelegyek gyors átvitelére. Emiatt azután-jelentős többletköltségek mellett - nem kromatográfiás módszerek használata vált szükségessé kezdeti tisztításra. E hátrányok kiküszöbölését célozza a találmány szerinti eljárás.
Amberlite XAD gyanták polimer makrohálős adszorbensek és kereskedelmi forgalomban vannak. Ezek a gyanták különböző affinitásokon alapuló vegyületek szétválasztására szolgálnak valamely polimer hidrofób felület számára. Ikeguchi és munkatársai [Igaku no Ayumi 1984,128(3), 161-3] például faeces epesavtartalmának meghatározásánál alkalmaz XAD-2 gyantát. Mivel az XAD típusú gyanták (1) nagy részecskeméretűek (20-50 mesh) és (2) rendkívül hidrofóbok, ilyen gyanták a szerkezetileg hasonló peptidek és proteinek komplex biológiai elegyeinek a kromatográfiájában való bármilyen gyakorlati hasznosítása nagyon meglepőlenne.
Valóban nem létezik olyan közlemény, amely részletezné ezeknek a hordozóknak a műveleti paramétereit a proteintisztításnál. Ennek ellenére az XAD típusú gyanták előbb említett két tulajdonsága kivételesen hatásossá teszi ezeket olyan nagyon szennyezett, iszappal terhelt elegyek kezdeti tisztítására, amelyek szerkezetileg különböző és szerkezetileg hasonló proteineket tartalmaznak. Az ember pontosan azt várná, hogy az XAD típusú gyanták nagy és heterogén részecskeméretei lényegében lecsökkentenék ezek kromatográfiás teljesítményét a kölcsönhatás lassú és nem egyenletes alakulása következtében. Emiatt kerülni kellene ilyen gyanták használatát a proteinek és a peptidek tisztításánál. Nem várt módon felismertük azonban, hogy ez a látszólagos hiányosság hasznos a tisztítás céljaira, ha a gyantákat pontosan meghatározott körülmények között nagyon szennyezett, iszappal terhelt proinzulinhoz hasonló anyagot tartalmazó anyagokhoz használjuk. Ezen túlmenően ilyen proinzulinhoz hasonló anyagok tisztításánál további gyakorlati jelentősége van annak, hogy az XAD típusú gyanták (1) mérsékelt áron beszerezhetők, (2) teljesen stabilisak 1-13 pH-tartományban és (3) alkalmasak oszlopban történő regenerálásra vizes detergensekkel és szerves oldószerekkel.
Az irodalomban nem ajánlják az XAD típusú gyanták használatát proteinek és polipeptidek tisztításánál, csak általánosan tesznek említést róluk. Pietrzyk, D. J. és Stodola, J. D. szerzők [Anal. Chem. 53,1822-1828 (1981)] voltak az elsők, akik analitikailag vizsgálták az XAD-4-et, amely polisztirol/divinil-benzol kopolimer, arra nézve, hogy alkalmas-e szintetikus dipeptidekkel való használatra. Egy további tanulmány [Pietrzyk, D.
J., Cahill, W. J., és Stodola, J. D., J. Liquid Chrom. 5, 443-461 (1982)] szintetikus peptidek használata esetén azt mutatta, hogy hatásos preparatív tisztítást lehet végezni XAD-4 gyantán, amelyet előbb felaprítottak és így jóval kisebb részecskéket kaptak. Következésképpen, mivel ezek a tanulmányok és vizsgálatok nem mutatták a kis peptidek kromatográfiáját makropőrusos hidrofób gyantákon, nem merült fel az a kérdés, hogy a jóval nagyobb és sokkal komplexebb proteinek elegyei hatásosan szétválaszthatók-e nagyon szennyezett elegyekből nagy részecskeméretű hordozókon.
A nagyon szennyezett forrásokból származó proteinek tisztításának a nehézségei a rekombináns DNStechnológia megjelenésével és ennek a peptidek és a proteinek ipari, termelésénél való használatával váltak világossá. A termék bármely iparilag lehetséges kifejezése rekombináns DNS-mődszerrel szintén megköveteli a rekombináns DNS-forrásbóI származó termék elkülönítését a kezdeti fermentációs táptalajokban, valamint az ezt követő kémiai és/vagy más kezelésekből származó elegyekben lévő szennyező anyagoktól. így döntő fontosságúvá lett új, ipari méretű proteintisztítási módszereknek a kidolgozása.
Egy még bonyolultabb tényező a rekombináns DNS-forrásból származó proteinek tisztításánál bármilyen ciszteinil-maradék-proteinek jelenlétéből adódik. A legtöbb esetben a císzteintartalmú proteinek rekombinációs kifejezését követően a ciszteinil-szulfhidrileket reverzibilisen védeni kell, általában S-szulfonátokká történő alakítással, még mielőtt hozzákezdenének bármilyen proteintisztításhoz. Ez az átalakítás szükségszerűen nagy mennyiségű további nem kívánt, iszaphoz hasonló szennyező anyagok termeléséhez vezet nagyon viszkózus denaturálószerek jelenlétében, amelyektől a kívánt proteint először el kell különíteni.
Rekombináns DNA-forrásból származó inzulin általában két úton kapható.
Az egyik út esetén az inzulin A-láncot és az inzulin B-láncot külön-külön kifejezik és elkülönítik, majd a láncokat kémiailag kombinálják inzulin termelésére. A másik út szerint egy egyenes láncú prekurzort kifejeznek és elkülönítenek. A terméket ezután renaturálják oxidációs úton proinzulinná és a proinzulint enzimes úton inzulinná alakítják.
A rekombinációs inzulintermelésre szolgáló mindkét módszer hasonló kémiai átalakító és tisztítási folya2
HU 205 138 B maiból áll, és A-lánc-S-szulfonáthoz, valamint B-láncS-szulfonáthoz vezet, amelyek kombinációja inzulinhoz vagy proinzulin S-szulfonáthoz vezet, illetve diszulfid közti cserével proinzulin állítható elő.
A három S-szulfonát bármelyikét, az inzulin-A-láncot, az inzulin-B-láncot vagy a proinzulint, általában a következő műveletsor útján kapják:
(1) A terméket kifejezik, amely a kívánt peptidsort tartalmazza, amely aminocsoportjánál egy metionilmaradékon keresztül egy kívül álló peptidsorhoz kapcsolódik.
(2) A kívánt sort lehasítják a kívül álló részről dicián-bromid segítségével, és (3) a peptid-ciszteinil-tiolokat szulfitokká alakítják ezután a megfelelő S-szulfonátok előállítására.
Ilyen típusú iparilag kivitelezhető eljárások kutatásánál olyan módszerek kidolgozása vált szükségessé, amelyek lehetővé teszik az iszap, a só, a szerves oldószerek és az egyéb szennyező anyagok eltávolítását a kívánt termékből (függetlenül attól, hogy a termék végtermék-e vagy közbensőtermék); az ilyen termék vesztesége nélkül, vagy csak csekély veszteséggel.
Munkánk során előnyös eljárást dolgoztunk ki nagyon szennyezett nyersanyagokból származó (különösen rekombinációs DNS-módszerekkel előállított) proinzulin, illetve S-szulfonátja tisztaságának a fokozására. Az eljárás során a szennyezett nyersanyagot fordított fázisú tisztításának vetjük alá valamely makropórusos akrilát-észter kopolimer gyantahordozón.
A találmány tárgya eljárás szennyező anyagok eltávolítására proinzulint vagy proinzulin-S-szulfonátot tartalmazó szennyezett elegyből, miközben lényegében teljesen kinyerjük a tisztítandó anyagot. Az eljárás abban áll, hogy (1) az elegyet Amberlite XAD-7 vagy XAD-8 gyanta hordozóanyagra visszük rá körülbelül 7-10 pH-tartományban, és (2) a proinzulint vagy S-szulfonátját a hordozóanyagról valamely, körülbelül 8-11 pH-jú és körülbelül 10-30 tf% acetont, acetonitrilt vagy az aceton és az acetonitril elegyét tartalmazó vizes eluálószerrel eluáljuk.
Ahogy említettük, a találmány szerinti eljárás proinzulint vagy S-szulfonátját tartalmazó, nagyon szennyezett elegyek tisztítására irányul. A „proinzulin” megjelölés vonatkozik bármilyen fajta proinzulinra, így például humán, szarvasmarha vagy sertés proinzulinra.
A találmány szerinti eljárásnál használt kromatográfiás hordozóanyag a kereskedelemből beszerezhető és Amberlite XAD-7, valamint XAD-8 néven ismert. A kettő közül az XAD-7 különösen alkalmas a találmány szerinti eljárás céljaira. Mindkét gyanta a Rohm and Haas Company (USA) terméke.
A találmány szerinti eljárást három kromatográfiás lépésre vagy lépcsőre oszthatjuk. Ezek közül azonban csupán kettő szükséges az eljárás megvalósításához, így az eljárásnak rendelkeznie kell egy betáplálást (adszorpciós) és egy deszorpciós lépéssel, ezeken kívül előnyösen egy közbenső mosási lépést is beiktathatunk. Az eljárást egyaránt kivitelezhetjük szakaszosan vagy oszlopkromatográfiás módszerrel. A tisztítás hatásosabb, ha az eljárást az oszlopkromatográfiás módszer körülményei között hajtjuk végre. Akár szakaszosan, akár oszlopkromatográfiás módon végezzük a találmány szerinti eljárást, azok a körülmények amelyek meghatározzák a sikeres végrehajtást és amelyek a találmány alapját képezik, állandóak maradnak.
A találmány szerinti eljárás betáplálást lépésénél használt komplex elegyet általában megelőző kezelési lépések sorozatának elvégzése után, és végül a rekombinációs DNS-módszerrel való kifejezése eredményeként kapjuk. Rendszerint olyan terméket fejezünk ki, amely egy aminosavat tartalmaz, amelynek legalább egy része megfelel a proinzulinnak vagy származékának. A kifejezett termék rendszerint egy szelekíven hasítható oldalt tartalmaz, amely lehetővé teszi a proinzulinhoz hasonló anyag kémiai vagy enzimes úton való előállítását a hosszabb láncú expressziós termékből. Általában a szelektíven hasítható oldalt egy metioninmaradék képviseli, és a hasítást az ilyen maradék karboxi-végcsoportjánál hatásosan cianogon-bromiddal a megszokott körülmények között végezzük. A keletkezett szennyezett elegy, amely a fermentáció és az azt követő CNBr-rel való hasítás eredménye, a peptidek széles skáláját tartalmazza iszap és más anyagok kísérő komplex elegyével és viszonylag kisebb mennyiségű redukált proinzulinnal vagy -származékkal együtt.
Az elegyet ezután szokásos módon kezeljük meghatározott körülmények között, nagy mennyiségű (körülbelül 7 mól) karbamid jelenlétében a redukált proinzulinszármazékok szabad szulfhidrilek védő szulfitolízisének a végrehajtása érdekében. A keletkező, iszappal terhelt, karbamidtartalmú elegy, amely jelentős menynyiségű szerves oldószert tartalmaz és nagy vezetőképességet mutat, képviseli azt a jellegzetes anyagot („szennyezett elegy”), amelyet ráviszünk a gyantára szakaszos vagy oszlopkromatográfiás módszerrel a találmány szerinti eljárásnak megfelelően.
Abban az esetben, ha a fent leírt anyagot betápláljuk, az iszappal terhelt és a karbamidtartalmú anyag pH-ját körülbelül 7-10-es, előnyösen 8-9-es, tartományra állítjuk be, a keletkező oldatot érintkeztetjük a gyantával.
A betáplálást lépés befejezése után a gyantát előnyösen 7-8,5, elsősorban 8 pH-jú vizes pufferoldattalmossuk. Erre a célra számos pufferanyagot használhatunk, így például trisz-etilén-diamint és hasonlókat. Az előnyös pufferanyag az etilén-diamin.
A gyantára való felvitel befejezése vagy mosás után, ha ez utóbbi lépést is beiktattuk, a proinzulint vagy S-szulfonátját lényegében teljesen eluáljuk az iszaptól mentes oszlopból megfelelő tisztaságban és töménységben. Általában a kiindulási szennyezett termékben lévő proinzulin vagy -S-szulfonát körülbelül 30100%-át tudjuk kinyerni a kinyerési lépésben. Az adszorbeált hatóanyag gyakorlati eluálásához szükséges körülményeket az előírt pH-tartomány és a megfelelő eluáló kompozíció elégíti ki. A szükséges pH-tartomány körülbelül 8-11, előnyösen körülbelül 9,5—10,5. A vizes eluálószemek - térfogatalapra számítva - kö3
HU 205 138 Β riilbelül 10-30% acetont, acetonitrilt vagy a kettő kombinációjából készített elegyet kell tartalmaznia. Az eluálószerben jelen lévő aceton vagy acetonitril mennyisége körülbelül 15-25%.
A találmány szerinti eljárást széles hőmérséklet-tartományban vitelezhetjük ki. Az előnyös hőmérséklettartomány körülbelül 4 °C-tól körülbelül 45 °C-ig terjed. Az eljárást a legelőnyösebben szobahőmérsékleten hajtjuk végre.
A találmány szerinti eljárásból eluátumként kapott vizes-szerves oldószeres oldat olyan proinzulint vagy proinzuIin-S-sznlfonátot tartalmaz, amely mentes szennyező iszaptól, karbamidtól, sótól, és lényegében nagyobb tisztaságú, mint a makropórusú akrilát-észter kopolimer-gyantára felvitt eredeti anyag. A keletkező anyagot az eluátumból szokásos módszerekkel kapjuk vagy magát az oldatot használjuk az anyag további feldolgozása során.
A találmány szerinti eljárást a következőkben kiviteli példákon is bemutatjuk.
1. példa
Humán proinzulin-Sszulfonát tisztítása
XAD-7 gyantát, amelynek a részecskemérete 2050 mesh, 10 ml/g arányban acetonnal nedvesítünk 6 óra hosszat szobahőmérsékleten. A gyantát ezután egymás után alaposan mossuk acetonnal, 0,1 normál NaOH-oIdatíal, vízzel, 0,1 normál HCl-oldattal, vízzel és 8,0 pHjú 100 mmőlos etilén-diamin/7 mólos karba-midelegygyel. A gyantát, miközben karbamiddal mossuk, egy
2,2-100 cm méretű kromatográfiás oszlopba töltjük 1 atmoszfératúlnyomáson. Az oszlopban akülönbözőméretű gyantarészecskék homogén elegye helyezkedik el.
Sejtlizátumot állítunk elő, amely rekombináns DNSeljárással kifejezett proteint tartalmaz. A protein olyan aminosavsort tartalmaz, amely metioninmaradék útján olyan aminosavsorhoz kapcsolódik, amely humán proinzulin-aminosavsomak felel meg. A lizátumot először cianogén-bromiddal kezeljük annak érdekében, hogy felhasítsuk a proteint minden egyes metiomnmaradéknál és ezáltal felszabadítsuk azt a molekulát, amely a humán proinzulinsort hordja, és utána a szulfitolízis körülményei között kezeljük avégett, hogy szulfitoEzáljunk minden ciszteinmaradékot, amely a lizátum-reakcióelegyben jelen van.
mg előzőekben kapott szilárd komplexelegyet feloldunk 7 mólos 8,5 pH-jú karbamid-oldatban. Az oldatot az előzőekben leírt kromatográfiás oszlopba visszük szobahőmérsékleten 30 cm/óra átfolyási sebességgel. Az oszlopra ezután ráviszünk olyan anyagot, amely 1-2 g proinzulin-S-szulfonátot képvisel egy Éter oszloptérfogatra számítva. Az oszlopot ezután egy oszloptérfogatnyi 10 mmőlos, 8,5 pH-ás etilén-diaminnal mossuk és az eluálást mmólos olyan etilén-diamin-oldattal végezzük, amely 20% acetont tartalmaz és a pH-ja 9,5.
A proinzulin-S-szulfonátot 90%-nál nagyobb mennyiségben kinyerjük és kimossuk, így a tennék mentes a CNBr-hasításnál keletkező szennyező anyagoktól, mentes továbbá a szulfitolízisnél használt reagensektől és körülbelül tízszer nagyobb tisztaságú.
2. példa
Fontos paraméterek a humán proinzulin-Sszulfonát tisztításánál, amely fermentációs szilárd anyagokból történik
Az 1. példa szerint előáUított fermentációs szilárd anyagokat használjuk és szakaszos tisztítást végzünk. A szakaszos tisztításnál az XAD-7 gyantát szerves oldószerekkel és vizes bázissal mossuk és az 1. példában megadott módon 10 mmólos, 8,5 pH-jú etilén-diaminnal kezeljük, majd nedves iszapként tároljuk. Betöltés előtt külső oldószertől mentesítjük és nedves részecskékként mérjük. Előre meghatározott mennyiségű gyantához gyenge rázás közben hozzáadjuk az oldatot, amely fermentációs szilárd anyagot tartalmaz és proinzulin-S-szulfonátot foglal magában ismert koncentrációban és tisztaságban. Az elegy pH-ját, hőmérsékletét, vezetőképességét és a betáplált oldat oldószerösszetételét meghatározott módon változtatjuk. A protein-adszorpció kinetikáját anaEtikai fordított fázisú kromatográfiával követjük, amelyhez egyenértéknyi mennyiségű betáplált oldatot használunk centrifugálás után. Abban az esetben, ha a kívánt betöltés megtörtént, a gyantát megszabadítjuk a külső oldószertől.
Az adszorbeált protein deszorpcióját úgy indítjuk meg, hogy a bevitt gyanta minden grammját 10 ml 8,5 pH-jú 10 mmólos vizes etilén-diamin-oldattal mossuk. A gyantát a külső oldószertől való megtisztítás után a deszorbeáló oldattal együtt rázzuk szuszpendálás után. A deszorbeáló oldat oldószer-összetételét és arányát a gyanta súlyára számítva, előre meghatározott rendszer szerint változtatjuk annak érdekében, hogy a kívánt terméket meghatározott mennyiségben és tisztaságban kapjuk. A protein deszorpciós kinetikáját anaEtikai fordított fázisú kromatográfiával határozzuk meg.
Amennyiben a szakaszos módszert használjuk, az
1-5. táblázat mutatja a találmány szerinti eljárás paraméterei változásainak a fontosságát, ide számítva az alkalmazott gyanta, a betáplálás! (adszorpciós) körülmények és az eluálási viszonyok jeUemzőit.
Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az XAD-7 gyanta, amely egy akrilátkopolimer, előnyösebb, mind az adszorpciós arány, mind a hatásosság tekintetében, mint a közel álló poEsztirol gyanták.
1. táblázat Gyantafajták
Idő, óra Proinzulin-S-szulfonát, Százalékos adszorpció1
XAD-2b XAD-4b XAD-7C HP^Qh
0 0 0 0 0
1,5 45 37 96 77
6 59 57 97 94
24 - - 98 98
1 Proinzulin-S-szulfonát adszorpció, amelyet a felülúszó anyag fordított fázisú kromatográfiás analízisével határozunk meg b DivinE-benzol-polisztirol-kopolimer cDivinil-benzoI-akrilát-észter-kopolimer
HU 205 138 Β
Ahogy a fentiekből látható, az XAD-7-en lényegében az összes proinzulin-S-szulfonát adszorbeálódik 1,5 óra alatt vagy ennél rövidebb idő alatt, míg a polisztriol gyanták legjobbika is háromszor annyi idő alatt éri el ugyanazt a szintet.
A 2. táblázat a pH és hőmérsékleti körülményeket tünteti fel, amelyeket a találmány szerinti eljárásnál alkalmazunk az oszlop töltésénél.
2. táblázat
Proinzulin-S-szulfonát betáplálás XAD-7-en; hőmérséklet és pH-hatás
Proinzulin-S-szulfonát, . Százalékos adszorpció Idő, pH (25 °C-on) Hőmérséklet °C (8-as pH)
óra 7 8 9 4 25 45
0 0 0 0 0 0 o ·
1 71 66 73 60 66 73
3,5 91 88 90 78 88 93
5 97 94 96 86 94 97
24 >99 >99 >99 >99 >99 >99
Jóllehet láthatóan végbemegy az adszorpció körülbelül 7 alatti pH-η, a jelenség váratlanul olyan körülményeket eredményez, amelyek megnehezítik, sőt lehetetlenné teszik a termék eluálását az oszlopról.
A 3. táblázat a pH megválasztásának a fontosságát és a termék egy jól telített oszlopról való eluálásának a szabályozását szemlélteti.
3. táblázat
Adszorbeálatlan proinzulin-S-szulfonát aránya, pH-hatása
Idő, óra 2,5b 4,5b 6,5b 8,5C 9,5C 10,5C
0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 35 46 61 ·
6 0 0 0 30 47 60
24 0 0 0 24 49 59
a Állapotok a deszorpció számára: Egy gramm gyantára számítva, amelyre maximális mennyiségű proinzulin-S-szulfonátot viszünk rá és ehhez a CNBrrel kezelt szulfitolízisből kapott szulfitolízis reakcióoldatot használjuk, rekombinációs DNA fermentációs lizátot adagolunk 4 ’C-on, 5 ml változó pH-jú vizes pufferoldat alkalmazása mellett, amely 30% acetont tartalmaz b 10 mmólos ammónium-foszfát vizes-acetonos pufferoldat c 10 mmólos etilén-diamin vizes-acetonos pufferoldat
A 4. táblázat azt mutatja be, hogy milyen fontos a termék-deszorpciónál használatos szerves oldószer megfelelő megválasztása.
4. táblázat
Proinzulin-S-szulfonát deszorpció: szerves oldószerhatás
Proinzulin-S-szulfonát, Százalékos deszorpció3 Idő, Szerves oldószer az eluáló pufferben óra Acetonitril Aceton 1-propanol Etanol
0 0 0 0 0
1,5 37 50 7 10
3 38 55 8 12
5 39 55 . 8 13
24 36 52 12. 9
3 Deszorpciós körülmények: Egy gramm gyantára számítva, amelyre maximális mennyiségű proinzulinS-szulfonátot viszünk rá és ehhez a CNBr-rel kezelt szulfitolízisből kapott szulfitolízis reakcióoldatot használjuk, rekombinációs DNA fermentációs lizátot adagolunk 4 ’C-on, 6 ml 10 mmólos etilén-diamin, 9,0-es pH-jú vizes oldat alkalmazása mellett, amely 30% szerves oldószert tartalmaz.
Az 5. táblázat azt mutatja be, hogy milyen döntő jelentőségű a szerves oldószer koncentrációtartománya.
5. táblázat
Proinzulin-S-szulfonát deszorpció: Szerves oldószer koncentrációjának a hatása
Proinzulin-S-szulfonát, Százalékos deszorpció8 Idő, Az eluáló pufferoldat aceton%-a
óra 0 5 10 15 20 30
Ö 0 0 0 0 0 0
1,5 25 52 65 70 81 60
6 21 55 70 68 79 60
a Deszorpciós körülmények: ugyanazok, mint a 4. táblázatnál, azzal az eltéréssel, hogy a pufferoldat pHját 10,5-re növeljük. A fenti százalékos deszorpciók körülbelül a maximumot jelölik, amely elérhető nem oszlopos (szakaszos) módszer szerint.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás szennyező anyagok eltávolítására proinzulint vagy proinzulin-S-szulfonátot tartalmazó szennyezett elegyből, azzal jellemezve, hogy (1) az elegyet Amberiite XAD-7 vagy XAD-8 gyanta hordozóanyagra visszük rá 7-10 pH-tartományban, adott esetben a hordozót vizes pufferral mossuk, és (2) a proinzulint vagy proinzulin-S-szulfonátot a gyantáról valamely 8-11 pH-jú és 10-30 tf% acetont, acétonitrilt vagy acetont és az acétonitrilt tartalmazó vizes eluálószerrel eluáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proinzulin-S-szulfonátot tartalmazó elegyből indulunk ki.
    HU 205 138 Β
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szennyezett elegyet szakaszos körülmények között kezeljük.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szennyezett elegyet oszlop-kromatográfiás kő- 5 rülmények között kezeljük.
  5. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szennyezett elegyet 8-9 pH-η visszük rá a gyantára.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szennyezett elegynek a hordozóanyagra való felvitelét követően és az eluálás előtt a gyantát 7-8,5 pH-jú vizes pufferoldattal mossuk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proinzulint vagy proinzulin-S-szulfonátot a gyantáról 9,5-10,5 pH-jú vizes eluálószerrel eluáljuk.
HU861419A 1985-04-08 1986-04-03 Process for purifying proinsulin and its s-sulfonate HU205138B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/720,641 US4616078A (en) 1985-04-08 1985-04-08 Process for purifying proinsulin-like materials

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT40680A HUT40680A (en) 1987-01-28
HU205138B true HU205138B (en) 1992-03-30

Family

ID=24894751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU861419A HU205138B (en) 1985-04-08 1986-04-03 Process for purifying proinsulin and its s-sulfonate

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4616078A (hu)
EP (1) EP0197764B1 (hu)
JP (1) JPH0796559B2 (hu)
KR (1) KR890001243B1 (hu)
AT (1) ATE91690T1 (hu)
AU (1) AU593242B2 (hu)
CA (1) CA1284249C (hu)
DE (1) DE3688712T2 (hu)
DK (1) DK173414B1 (hu)
HU (1) HU205138B (hu)
IE (1) IE60570B1 (hu)
IL (1) IL78373A (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3738541A1 (de) * 1987-11-13 1989-05-24 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin
US4764592A (en) * 1987-04-23 1988-08-16 Eli Lilly And Company Crystalline human proinsulin and process for its production
DK340189D0 (da) * 1989-07-10 1989-07-10 Jens Villadsens Fabrikker A S Fremgangsmaade til fremstilling af en fuldklaebet belaegning paa et underlag
US5071560A (en) * 1989-07-17 1991-12-10 Uop Process for purifying phenylalanine
US6001604A (en) * 1993-12-29 1999-12-14 Bio-Technology General Corp. Refolding of proinsulins without addition of reducing agents
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
US7741536B2 (en) 1997-08-07 2010-06-22 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Expression of human serum albumin in plastids
US20030204864A1 (en) * 2001-02-28 2003-10-30 Henry Daniell Pharmaceutical proteins, human therapeutics, human serum albumin, insulin, native cholera toxic b submitted on transgenic plastids
KR100253916B1 (ko) * 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
DK1071955T4 (da) * 1998-04-17 2009-06-15 Innogenetics Nv Forbedrede immundiagnostiske assays, som anvender reduktionsmidler
US20100251425A9 (en) 1998-05-15 2010-09-30 University Of Central Florida Expression of human interferon in transgenic chloroplasts
DE19838097A1 (de) * 1998-08-24 2000-03-02 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen
CA2402066C (en) * 2000-03-01 2015-09-29 Auburn University Plastid transformation vectors for expressing human proteins in plants

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3649456A (en) * 1969-09-08 1972-03-14 Rohm & Haas Separation of polypeptide substances with macroreticular resins
US3907676A (en) * 1970-07-28 1975-09-23 Novo Terapeutisk Labor As Process for purifying insulin
US3876623A (en) * 1973-05-09 1975-04-08 Lilly Co Eli Process for purifying insulin
AU5397579A (en) * 1978-12-26 1980-07-03 Eli Lilly And Company Purifying insulin
US4430266A (en) * 1980-11-28 1984-02-07 Eli Lilly And Company Process for producing an insulin precursor

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0796559B2 (ja) 1995-10-18
AU593242B2 (en) 1990-02-08
KR890001243B1 (ko) 1989-04-28
JPS61236796A (ja) 1986-10-22
DE3688712T2 (de) 1993-11-25
KR860008277A (ko) 1986-11-14
IE860887L (en) 1986-10-08
EP0197764A3 (en) 1988-08-31
CA1284249C (en) 1991-05-14
DK150586D0 (da) 1986-04-03
EP0197764B1 (en) 1993-07-21
IL78373A0 (en) 1986-07-31
EP0197764A2 (en) 1986-10-15
ATE91690T1 (de) 1993-08-15
AU5565586A (en) 1986-10-16
DK173414B1 (da) 2000-10-02
US4616078A (en) 1986-10-07
IL78373A (en) 1990-07-12
DE3688712D1 (de) 1993-08-26
DK150586A (da) 1986-10-09
IE60570B1 (en) 1994-07-27
HUT40680A (en) 1987-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU205138B (en) Process for purifying proinsulin and its s-sulfonate
Rivier et al. Total synthesis and further characterization of the. gamma.-carboxyglutamate-containing" sleeper" peptide from Conus geographus venom
JP4975895B2 (ja) 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法
AU637255B2 (en) A process for the purification of insulins by chromatography
JPH07116230B2 (ja) 糖ペプチド抗生物質の回収方法
Carty et al. Modification of Bovine Pancreatic Ribonuclease A with 4-Sulfonyloxy-2-nitrofluorobenzene: Isolation and Identification of Modified Proteins
KR890001244B1 (ko) 성장 호르몬-양 물질의 정제방법
US4584400A (en) Refining phenylalanine
US4677192A (en) Process for the separation of mixtures of insulin, insulin derivatives and, where appropriate, impurities
US4745178A (en) Process for selective peptide bond cleavage using sulfoxides and CF3 CO
US4835254A (en) Process for reducing methionine sulfoxide residues in peptides or proteins
CN114478749A (zh) 一种阿巴帕肽的纯化方法
IE66390B1 (en) Process for reducing the aggregate content of growth hormone-like materials
EP0262941A2 (en) Affinity purification process for glycopeptide antibiotics
CAO et al. Comparison of reaction rates in trypsin-catalysed transamidation of porcine insulin and its B29-arginine analogue
WO2000032621A1 (en) PROCESS FOR PURIFICATION OF N- [N-(3,3-DIMETHYLBUTYL) -L-α-ASPARTYL] -L-PHENYLALANINE 1-METHYL ESTER
JPH0578369A (ja) ｄ−ビオチンの分離回収方法
Rose et al. Affinity technique for the isolation of polypeptides containing arginine modified with cyclohexane-1, 2-dione, and their analysis by combined gas-liquid chromatography-mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee