JPS61236796A - プロインシユリン様物質の改良精製法 - Google Patents
プロインシユリン様物質の改良精製法Info
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- JPS61236796A JPS61236796A JP61080975A JP8097586A JPS61236796A JP S61236796 A JPS61236796 A JP S61236796A JP 61080975 A JP61080975 A JP 61080975A JP 8097586 A JP8097586 A JP 8097586A JP S61236796 A JPS61236796 A JP S61236796A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
タンパクは、構造上の安定性に依存してその特異的機能
を働かせる生体高分子である。溶媒組成、ｐＨ１温度お
よび塩濃度における小さな変化が、しばしばタンパク構
造における重大な、時折不可逆的な変化を生じさせるこ
とがあるので、クロマトグラフィーによるタンパク精製
は、原則として非特異的で変性作用が最小である樹脂を
使用して行なわれてきた。従来このような樹脂は非常に
親水性であり、しばしば８０％以上の水分含有率を有し
ている。これらの親水的性質のために、得られるクロマ
トグラフィー用樹脂粒子は、適度な反圧下でも非常につ
ぶれやすい。また、これらの親水性樹脂を有機溶媒で効
果的に洗浄することができないため、非特異的吸着を全
て排除することは困難である。従って作業者は、不均質
な天然供給源から得られるタンパクの処理精製の初期工
程で問題に直面することになる。より望ましい担体は、
その親水的性質のために、粘性の、スラッジ含有天然産
物混合物の迅速処理には不適当である。その結果、かな
りの追加経費をかけて初期精製にクロマトグラフィー以
外の方法を使用することが必要であった。
を働かせる生体高分子である。溶媒組成、ｐＨ１温度お
よび塩濃度における小さな変化が、しばしばタンパク構
造における重大な、時折不可逆的な変化を生じさせるこ
とがあるので、クロマトグラフィーによるタンパク精製
は、原則として非特異的で変性作用が最小である樹脂を
使用して行なわれてきた。従来このような樹脂は非常に
親水性であり、しばしば８０％以上の水分含有率を有し
ている。これらの親水的性質のために、得られるクロマ
トグラフィー用樹脂粒子は、適度な反圧下でも非常につ
ぶれやすい。また、これらの親水性樹脂を有機溶媒で効
果的に洗浄することができないため、非特異的吸着を全
て排除することは困難である。従って作業者は、不均質
な天然供給源から得られるタンパクの処理精製の初期工
程で問題に直面することになる。より望ましい担体は、
その親水的性質のために、粘性の、スラッジ含有天然産
物混合物の迅速処理には不適当である。その結果、かな
りの追加経費をかけて初期精製にクロマトグラフィー以
外の方法を使用することが必要であった。
アンバーライト”ＸＡＤ樹脂類は、高分子マクロ網（目
）状吸着剤であり、ローム・アンド・ハースＯカンパニ
ー（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に
よって市販品として生産されている。これらの樹脂は、
重合体の疎水性表面に対する親和力の違いによって化合
物が分離されるように設計されている。ＸＡＤ型樹脂は
（１）粒子サイズが大きく（２０〜５０メツシユ）、（
２）非常に疎水的であるため、構造的に類似しているペ
プチドおよびタンパクの複合生物学的混合物のクロマト
グラフィーにこれらの樹脂を実際に使用することは驚く
べきことであった。実際、タンパク精製におけるこれら
の担体の作業パラメーターを詳述している報告はない。
）状吸着剤であり、ローム・アンド・ハースＯカンパニ
ー（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に
よって市販品として生産されている。これらの樹脂は、
重合体の疎水性表面に対する親和力の違いによって化合
物が分離されるように設計されている。ＸＡＤ型樹脂は
（１）粒子サイズが大きく（２０〜５０メツシユ）、（
２）非常に疎水的であるため、構造的に類似しているペ
プチドおよびタンパクの複合生物学的混合物のクロマト
グラフィーにこれらの樹脂を実際に使用することは驚く
べきことであった。実際、タンパク精製におけるこれら
の担体の作業パラメーターを詳述している報告はない。
しかしながらＸＡＤ型樹脂の上記２特性のために、驚く
べきことに、これらの樹脂は、構造上具なりていたり構
造上類似している両タンパクを含有している非常に不純
な、スラッジ含有混合物の初期精製工程に非常に効果的
である。ＸＡＤ型樹脂は粒子サイズが大きく不均一であ
るので、緩慢で等しくない相互作用の力学のために、実
質上そのクロマトグラフィーの性能を低下させるであろ
うと予想するのが正しい。従って、タンパクおよびポリ
ペプチドの精製に、このような樹脂を使用することは避
けられてきた。しかしながら、本発明者らは、プロイン
シュリン様物質を含有している非常に不純な、スラッジ
含有の物質に対して予め限定された条件下で使用される
場合は、この見かげ上の欠陥が、予想に反して精製目的
に好都合であることを見い出した。
べきことに、これらの樹脂は、構造上具なりていたり構
造上類似している両タンパクを含有している非常に不純
な、スラッジ含有混合物の初期精製工程に非常に効果的
である。ＸＡＤ型樹脂は粒子サイズが大きく不均一であ
るので、緩慢で等しくない相互作用の力学のために、実
質上そのクロマトグラフィーの性能を低下させるであろ
うと予想するのが正しい。従って、タンパクおよびポリ
ペプチドの精製に、このような樹脂を使用することは避
けられてきた。しかしながら、本発明者らは、プロイン
シュリン様物質を含有している非常に不純な、スラッジ
含有の物質に対して予め限定された条件下で使用される
場合は、この見かげ上の欠陥が、予想に反して精製目的
に好都合であることを見い出した。
更に、このようなプロインシュリン様物質の精製におい
て付加される実用上の意義は、ＸＡＤ型樹脂は（り低価
格で容易に入手でき、（２）Ｉ−１３のｐ）（範囲で十
分に安定であり、（３）水性洗浄剤および有機溶媒を使
用してカラム内再生が容易であることである。
て付加される実用上の意義は、ＸＡＤ型樹脂は（り低価
格で容易に入手でき、（２）Ｉ−１３のｐ）（範囲で十
分に安定であり、（３）水性洗浄剤および有機溶媒を使
用してカラム内再生が容易であることである。
文献には、一般的な方法以外にはタンパクおよびポリペ
プチドの精製におけるＸＡＤ型樹脂の使用は報告されて
いない。ピエトルジク（Ｐ １ｅｔｒｚｙｋ。
プチドの精製におけるＸＡＤ型樹脂の使用は報告されて
いない。ピエトルジク（Ｐ １ｅｔｒｚｙｋ。
Ｄ、Ｊ、）およびストドラ（Ｓ ｔｏｄｏｌａ、 Ｊ
、Ｄ 、）、アナリティカル・ケミ゛ストリー（Ａｎａ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）、５３．１８２２−１８２８（１９
８１）は、合成ジペプチドに利用するために、ＸＡＤ−
４即ちポリスチレン−ジビニルベンゼンのコポリマーを
分析的に調べた最初の研究者であった。５残基の大きさ
の合成ペプチドについての後続の研究［ピエトルジク（
Ｐｔｅｔｒｚｙｋ、ＤＪ 、）、カーヒル（Ｃａｈｉｌ
ｌ、Ｗ、 Ｊ 、）およびストドラ（Ｓ ｔｏｄｏｌａ
、 Ｊ 、Ｄ 、）ジャーナル・オブ・リキッド・クロ
マトグラフィー（Ｊ、ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍ、）、５
，４４３−４６１［１９８２）］は、初めて、粉砕して
著しく小さな粒子にしておいたＸＡＤ−４樹脂を用いて
かなり効果的な処理精製を行なうことができることを示
した。従ってこれらの研究は、マクロポーラスな疎水性
樹脂による小ペプチドのクロマトグラフィーを呈示した
ものであるが、粒子サイズの大きな担体を使用して、実
質上より大きく、非常に多くの複合タンパクの混合物を
、非常に不純な混合物から効果的に分離し得るかどうか
という疑問に答えるものではなかっ゛た。
、Ｄ 、）、アナリティカル・ケミ゛ストリー（Ａｎａ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）、５３．１８２２−１８２８（１９
８１）は、合成ジペプチドに利用するために、ＸＡＤ−
４即ちポリスチレン−ジビニルベンゼンのコポリマーを
分析的に調べた最初の研究者であった。５残基の大きさ
の合成ペプチドについての後続の研究［ピエトルジク（
Ｐｔｅｔｒｚｙｋ、ＤＪ 、）、カーヒル（Ｃａｈｉｌ
ｌ、Ｗ、 Ｊ 、）およびストドラ（Ｓ ｔｏｄｏｌａ
、 Ｊ 、Ｄ 、）ジャーナル・オブ・リキッド・クロ
マトグラフィー（Ｊ、ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍ、）、５
，４４３−４６１［１９８２）］は、初めて、粉砕して
著しく小さな粒子にしておいたＸＡＤ−４樹脂を用いて
かなり効果的な処理精製を行なうことができることを示
した。従ってこれらの研究は、マクロポーラスな疎水性
樹脂による小ペプチドのクロマトグラフィーを呈示した
ものであるが、粒子サイズの大きな担体を使用して、実
質上より大きく、非常に多くの複合タンパクの混合物を
、非常に不純な混合物から効果的に分離し得るかどうか
という疑問に答えるものではなかっ゛た。
非常に不純な供給源から得たタンパクの精製の困難さは
、組換えＤＮＡ技術の出現およびそれを利用したペプチ
ドとタンパクの商業ベースでの生産において特に明白に
なってきた。組換えＤＮＡ法により、商業用として適切
な産物を発現させる場合も、出発発酵ブロス中並びに、
その後の化学的処理および／またはその他の処理で生成
する混合物中に含まれている不純物から、組換えＤＮＡ
−起源の産物を単離することが必要である。このように
、新しい、商業規模のタンパク精製技術の必要性はきわ
めて重要な問題となってきた。
、組換えＤＮＡ技術の出現およびそれを利用したペプチ
ドとタンパクの商業ベースでの生産において特に明白に
なってきた。組換えＤＮＡ法により、商業用として適切
な産物を発現させる場合も、出発発酵ブロス中並びに、
その後の化学的処理および／またはその他の処理で生成
する混合物中に含まれている不純物から、組換えＤＮＡ
−起源の産物を単離することが必要である。このように
、新しい、商業規模のタンパク精製技術の必要性はきわ
めて重要な問題となってきた。
組換えＤＮＡ−起源のタンパクの精製をよりいっそう困
難にしている要素は、システィン残基を有する多数のタ
ンパクの存在にある。はとんどの場合、システィン含有
タンパクの組換え発現後、タンパク精製の開始前に、シ
ステイニルスルフヒドリルを通常、Ｓ−スルホネートに
変換して可逆的に保護しなければならない。この変換は
、必然的に望ましくないスラッジ様不純物を更に生成す
ることになり、非常に粘性の変性剤が存在するため、先
ずこれから所望のタンパクを分離しなければならない。
難にしている要素は、システィン残基を有する多数のタ
ンパクの存在にある。はとんどの場合、システィン含有
タンパクの組換え発現後、タンパク精製の開始前に、シ
ステイニルスルフヒドリルを通常、Ｓ−スルホネートに
変換して可逆的に保護しなければならない。この変換は
、必然的に望ましくないスラッジ様不純物を更に生成す
ることになり、非常に粘性の変性剤が存在するため、先
ずこれから所望のタンパクを分離しなければならない。
具体的には、組換えＤＮＡ起源のインシュリンは通常、
２つの方法のいずれかによって手に入れることができる
。１つの方法では、インシュリンＡ−鎖とインシュリン
Ｂ−鎖を別々に発現させて単離し、次いでこれらの鎖を
化学的に結合させてインシュリンを生成する。もう１つ
の方法では、直鎖状プロインシュリン前駆体を発現させ
て単離し、次ぎに、この産物を酸化により変性させてプ
ロインシュリンとし、このプロインシュリンを酵素的に
インシュリンに変換する。
２つの方法のいずれかによって手に入れることができる
。１つの方法では、インシュリンＡ−鎖とインシュリン
Ｂ−鎖を別々に発現させて単離し、次いでこれらの鎖を
化学的に結合させてインシュリンを生成する。もう１つ
の方法では、直鎖状プロインシュリン前駆体を発現させ
て単離し、次ぎに、この産物を酸化により変性させてプ
ロインシュリンとし、このプロインシュリンを酵素的に
インシュリンに変換する。
組換えインシュリンを生産するための両方法は、組み合
わせてインシュリンに導き得るインシュリンＡ−鎖Ｓ−
スルホネートおよびインシュリンロー鎖Ｓ−スルホネー
ト、またはジスルフィド変換してプロインシュリンに導
き得るプロインシュリンＳ−スルホネートを得るための
類似した順序の化学変換および精製工程を含んでいる。
わせてインシュリンに導き得るインシュリンＡ−鎖Ｓ−
スルホネートおよびインシュリンロー鎖Ｓ−スルホネー
ト、またはジスルフィド変換してプロインシュリンに導
き得るプロインシュリンＳ−スルホネートを得るための
類似した順序の化学変換および精製工程を含んでいる。
３種のＳ−スルホネート、即ちインシュリンＡ−鎖、イ
ンシュリンＢ−鎖またはプロインシュリンのＳ−スルホ
ネートは、いずれも通常以下の順序で製造される： （１）アミノ末端のメチオニル残基によって外来のペプ
チド配列に結釡している所望のペプチド配列を含有して
いる産物の発現、 （２）臭化シアンによる、外来部分からの所望の配列の
切断および （３）対応するＳ−スルホネートを生成させるための、
ペプチドシステイニルチオールのスルフィトリシス（ｓ
ｕｌｆｔｔｏｌｙｓｉｓ）。
ンシュリンＢ−鎖またはプロインシュリンのＳ−スルホ
ネートは、いずれも通常以下の順序で製造される： （１）アミノ末端のメチオニル残基によって外来のペプ
チド配列に結釡している所望のペプチド配列を含有して
いる産物の発現、 （２）臭化シアンによる、外来部分からの所望の配列の
切断および （３）対応するＳ−スルホネートを生成させるための、
ペプチドシステイニルチオールのスルフィトリシス（ｓ
ｕｌｆｔｔｏｌｙｓｉｓ）。
このタイプの方法を商業ベースに適合するように行なう
には、所望の生成物をわずかしか、または全く損失せず
に、所望の生成物（この生成物が最終産物であるか中間
産物であるかにかかわらず）からスラッジ、塩、有機溶
媒およびその他の不純物を除去することができるような
方法を見い出すことが必要である。
には、所望の生成物をわずかしか、または全く損失せず
に、所望の生成物（この生成物が最終産物であるか中間
産物であるかにかかわらず）からスラッジ、塩、有機溶
媒およびその他の不純物を除去することができるような
方法を見い出すことが必要である。
本発明者らは、非常に不純な原料、特に組換えＤＮＡ法
によって得られた非常に不純な原料から、プロインシュ
リン様物質の純度を高めるための非常に有利な方法を見
い出した。この方法は、不純な原料をマクロポーラスア
クリレートエステルコポリマー樹脂製担体による逆相精
製にかけることである。
によって得られた非常に不純な原料から、プロインシュ
リン様物質の純度を高めるための非常に有利な方法を見
い出した。この方法は、不純な原料をマクロポーラスア
クリレートエステルコポリマー樹脂製担体による逆相精
製にかけることである。
本発明は、プロインシュリン様物質を含有している不純
な混合物から不純物を分離し、プロインシュリン様物質
を実質上完全に回収する方法であって、 （１）該混合物を約７〜約ＩＯのｐ）（で逆相マクロポ
ーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸
着させ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約ｌＯ容量％〜約３０容量％含有しているｐＨ
約８〜約１１の水性溶出剤を使用して、該プロインシュ
リン様物質を担体から溶出することからなる方法を提供
するものである。
な混合物から不純物を分離し、プロインシュリン様物質
を実質上完全に回収する方法であって、 （１）該混合物を約７〜約ＩＯのｐ）（で逆相マクロポ
ーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸
着させ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約ｌＯ容量％〜約３０容量％含有しているｐＨ
約８〜約１１の水性溶出剤を使用して、該プロインシュ
リン様物質を担体から溶出することからなる方法を提供
するものである。
上記の様に本発明の方法は、プロインシュリン様物質を
含有している非常に不純な混合物の精製を目的とするも
のである。「プロインシュリン様物質」という用語は、
（１）例えばヒト、ウシまたはブタのような全ての種類
のプロインシュリン自体、（２）還元された（−Ｓ Ｈ
）プロインシュリン、およびプロインシュリンＳ−スル
ホネート等のＳ−保護プロインシュリンのようなプロイ
ンシュリンの前駆体、（３）例えばＡ−鎖、Ｂ−鎖、Ｃ
−ペプチドまたはこれらの３種の内のいずれかの組み合
わせを長くおよび／または短くするように修飾されてい
る構造のような、プロインシュリンの誘導体またはその
前駆体および（４）例えばプロインシュリンアミノ酸配
列が１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換によって修
飾されている構造のようなプロインシュリンの類似体お
よびその前駆体を意味する。
含有している非常に不純な混合物の精製を目的とするも
のである。「プロインシュリン様物質」という用語は、
（１）例えばヒト、ウシまたはブタのような全ての種類
のプロインシュリン自体、（２）還元された（−Ｓ Ｈ
）プロインシュリン、およびプロインシュリンＳ−スル
ホネート等のＳ−保護プロインシュリンのようなプロイ
ンシュリンの前駆体、（３）例えばＡ−鎖、Ｂ−鎖、Ｃ
−ペプチドまたはこれらの３種の内のいずれかの組み合
わせを長くおよび／または短くするように修飾されてい
る構造のような、プロインシュリンの誘導体またはその
前駆体および（４）例えばプロインシュリンアミノ酸配
列が１またはそれ以上のアミノ酸残基の置換によって修
飾されている構造のようなプロインシュリンの類似体お
よびその前駆体を意味する。
本発明の方法は、クロマトグラフィー用担体としてマク
ロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂を使用
することを包含する。このようなコポリマー樹脂製吸着
剤は当業者に周知のものである。本発明の目的に非常に
適切な２種の担体は、ローム・アンド・ハース・カンパ
ニーから入手することができ、ＸＡＤ−７およびＸＡＤ
−８の名称を有している。２種の内、ＸＡＤ−７が本発
明の目的にとって特に好ましい。
ロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂を使用
することを包含する。このようなコポリマー樹脂製吸着
剤は当業者に周知のものである。本発明の目的に非常に
適切な２種の担体は、ローム・アンド・ハース・カンパ
ニーから入手することができ、ＸＡＤ−７およびＸＡＤ
−８の名称を有している。２種の内、ＸＡＤ−７が本発
明の目的にとって特に好ましい。
本発明の方法は、３つのクロマトグラフィ一工程または
段階に分けることができる。しかしながら、これらの内
２工程だけが必要である。このように、本方法は吸着お
よび脱着工程を含まなければならず、中間の洗浄工程を
含むことができ、含むことが好ましい。更に本方法は、
バッチ式またはカラム方式のいずれによって行なっても
よいが、精製効率のためにはカラム条件下で本方法を行
なうのがはるかに好ましい。本発明の方法は、バッチ式
またはカラム式のいずれで行なわれる場合でも、その成
功への基礎となり、本発明の基本を構成する特定の条件
は変わらない。
段階に分けることができる。しかしながら、これらの内
２工程だけが必要である。このように、本方法は吸着お
よび脱着工程を含まなければならず、中間の洗浄工程を
含むことができ、含むことが好ましい。更に本方法は、
バッチ式またはカラム方式のいずれによって行なっても
よいが、精製効率のためにはカラム条件下で本方法を行
なうのがはるかに好ましい。本発明の方法は、バッチ式
またはカラム式のいずれで行なわれる場合でも、その成
功への基礎となり、本発明の基本を構成する特定の条件
は変わらない。
本発明の吸着工程に使用される、プロインシュリン様物
質を含有している複合混合物は、通常光の処理工程の順
序に従った結果として、即ち本質的には組換えＤＮＡ法
による発現の結果、得られる。通常、少なくとも１部が
プロインシュリン、その誘導体またはその類似体のアミ
ノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含有している生産物
が発現される。発現産物は通常、プロインシュリン様物
質が、それより長い鎖の発現産物から化学的または酵素
的作用により生成し得るように選択的切断部位を含んで
いる。通常この選択的切断部位はメチオニン残基で表わ
され、この残基のカルボキシ末端での切断は、臭化シア
ンおよび周知の条件の使用によって効果的に行なわれる
。発酵に次ぐＣＮＢｒ切断の結果得られる不純な混合物
は、広範なペプチド類と一緒に、スラッジ、その他の物
質およびそれに比較して少量の還元されたプロインシュ
リン様物質を含有する。
質を含有している複合混合物は、通常光の処理工程の順
序に従った結果として、即ち本質的には組換えＤＮＡ法
による発現の結果、得られる。通常、少なくとも１部が
プロインシュリン、その誘導体またはその類似体のアミ
ノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含有している生産物
が発現される。発現産物は通常、プロインシュリン様物
質が、それより長い鎖の発現産物から化学的または酵素
的作用により生成し得るように選択的切断部位を含んで
いる。通常この選択的切断部位はメチオニン残基で表わ
され、この残基のカルボキシ末端での切断は、臭化シア
ンおよび周知の条件の使用によって効果的に行なわれる
。発酵に次ぐＣＮＢｒ切断の結果得られる不純な混合物
は、広範なペプチド類と一緒に、スラッジ、その他の物
質およびそれに比較して少量の還元されたプロインシュ
リン様物質を含有する。
次いで、通常、既知の条件下、大量の尿素（通常７Ｍ）
の存在の下でこの混合物を処理して、還元されたプロイ
ンシュリン様物質の遊離スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙ
ｄｒｙｌｓ）の保護的スルフィトリシス（Ｓｕｌｆ １
ｔｏｌｙｓ ｉｓ）を行なう。この様にして得られる、
適当な濃度の有機溶媒を含んだ、伝導性の高い、スラッ
ジ含有の尿素を含む混合物が、本発明の方法に従ってバ
ッチ式またはカラム式でマクロポーラスアクリレートエ
ステルコポリマーに吸着させる典型的な原料（「不純な
混合物」）に相当する。
の存在の下でこの混合物を処理して、還元されたプロイ
ンシュリン様物質の遊離スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙ
ｄｒｙｌｓ）の保護的スルフィトリシス（Ｓｕｌｆ １
ｔｏｌｙｓ ｉｓ）を行なう。この様にして得られる、
適当な濃度の有機溶媒を含んだ、伝導性の高い、スラッ
ジ含有の尿素を含む混合物が、本発明の方法に従ってバ
ッチ式またはカラム式でマクロポーラスアクリレートエ
ステルコポリマーに吸着させる典型的な原料（「不純な
混合物」）に相当する。
上記のような物質を吸着さ”仕る場合は、スラッジ含有
の尿素を含む混合物のｐＨを約７〜約１０の範囲、好ま
しくは約８〜約９に調節し、得られる溶液をマクロポー
ラスアクリレートエステルコポリマー樹脂に接触させ、
る。
の尿素を含む混合物のｐＨを約７〜約１０の範囲、好ま
しくは約８〜約９に調節し、得られる溶液をマクロポー
ラスアクリレートエステルコポリマー樹脂に接触させ、
る。
吸着工程の終了後、約７〜約８．５、好ましくは約８の
ｐＨの水性緩衝液で樹脂を洗浄するのが好ましい。広範
な緩衝剤のいずれを使用してもよく、例えばトリス、エ
チレンジアミン等が包含される。好ましい緩衝剤はエチ
レンジアミンである。
ｐＨの水性緩衝液で樹脂を洗浄するのが好ましい。広範
な緩衝剤のいずれを使用してもよく、例えばトリス、エ
チレンジアミン等が包含される。好ましい緩衝剤はエチ
レンジアミンである。
樹脂への吸着または洗浄（この工程が含まれていれば）
が終了した後、プロインシュリン様物質は、実質上完全
にスラッジを含まないでカラムから溶出され、実質上純
度および濃度が高められる。実質上完全な回収とは、出
発不純混合物中に存在しているプロインシュリン様物質
の約３０ｃｚ／１００％の回収を意味する。吸着された
プロインシュリン様物質の実際の溶離のために必要な条
件は、前記のｐＨ範囲および溶離剤の組成である。ｐＨ
は約８〜約１１．好ましくは約９．５〜約１Ｏ１５の範
囲になければならない。水性溶離剤は容量基準で約１０
％〜約３０％のアセトン、アセトニトリルまたはこの２
種の組み合わせ物を含有していなければならない。溶離
剤中のアセトンまたはアセトニトリルの範囲は約１５％
〜約２５％となることが好ましい。
が終了した後、プロインシュリン様物質は、実質上完全
にスラッジを含まないでカラムから溶出され、実質上純
度および濃度が高められる。実質上完全な回収とは、出
発不純混合物中に存在しているプロインシュリン様物質
の約３０ｃｚ／１００％の回収を意味する。吸着された
プロインシュリン様物質の実際の溶離のために必要な条
件は、前記のｐＨ範囲および溶離剤の組成である。ｐＨ
は約８〜約１１．好ましくは約９．５〜約１Ｏ１５の範
囲になければならない。水性溶離剤は容量基準で約１０
％〜約３０％のアセトン、アセトニトリルまたはこの２
種の組み合わせ物を含有していなければならない。溶離
剤中のアセトンまたはアセトニトリルの範囲は約１５％
〜約２５％となることが好ましい。
本発明の全工程は、例えば約４６Ｃ〜約４ｃ４Ｌ’Ｃの
ような広範な温度で行なうことができる。しかしながら
本方法は、周囲温度で行なわれるのが好ましいし、都合
がよい。
ような広範な温度で行なうことができる。しかしながら
本方法は、周囲温度で行なわれるのが好ましいし、都合
がよい。
本発明の方法によって溶出液として得られる水性−有機
溶液は、不純物質であるスラッジ、尿素、塩を含んでお
らず、マクロポーラスアクリレートエステルコポリマー
樹脂にかけられた最初の混合 。
溶液は、不純物質であるスラッジ、尿素、塩を含んでお
らず、マクロポーラスアクリレートエステルコポリマー
樹脂にかけられた最初の混合 。
物より実質上純度が高いプロインシュリン様物質を含有
している。得られたプロインシュリン様物質は、常法に
よって溶出液から回収してもよいし、溶液自体を、この
物質をさらに処理するのに使用してもよい。
している。得られたプロインシュリン様物質は、常法に
よって溶出液から回収してもよいし、溶液自体を、この
物質をさらに処理するのに使用してもよい。
以下の実施例は、本発明を更に詳しく説明するものであ
るが、本発明の範囲を制限するものではない。
るが、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１ ヒトプロインシュリンＳ−スルホネートの精
製 ２０〜５０メツシユサイズのＸＡＤ−７樹脂［ザ・ロー
ム・アンド・ハース・カンパニー（ｔｈｅ Ｒ。
製 ２０〜５０メツシユサイズのＸＡＤ−７樹脂［ザ・ロー
ム・アンド・ハース・カンパニー（ｔｈｅ Ｒ。
ｈａ＋ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手
］を、ｔｏｊＩｅ／ｇ友のアセトンで、室温にて６時間
湿潤させた。次いで、アセトン、０．ＩＮ ＮａＯＨ，
水、０．１ＮＨＣ１２，水および１００ｍＭエチレンジ
アミン／７Ｍ尿素（ｐＨ８、０）を使用して樹脂を徹底
的に、かつこの順序で洗浄した。最後の尿素洗液に入っ
ている樹脂を、１５ｐｓｉの一定圧で２．２Ｘ１００ｃ
ｍクロマトグラフィー用カラムに充填した。充填した時
、カラム内の種々のサイズの樹脂粒子は、均等に混じり
合っていた。組換えＤＮＡによって発現されたキメラタ
ンパクを含有している細胞リゼイトを調製した。このキ
メラタンパクは、ヒトプロインシュリンのアミノ酸配列
に対応しているアミノ酸配列にメチオニン残基を介して
結合しているアミノ酸のリーダー配列を含むものであっ
た。
］を、ｔｏｊＩｅ／ｇ友のアセトンで、室温にて６時間
湿潤させた。次いで、アセトン、０．ＩＮ ＮａＯＨ，
水、０．１ＮＨＣ１２，水および１００ｍＭエチレンジ
アミン／７Ｍ尿素（ｐＨ８、０）を使用して樹脂を徹底
的に、かつこの順序で洗浄した。最後の尿素洗液に入っ
ている樹脂を、１５ｐｓｉの一定圧で２．２Ｘ１００ｃ
ｍクロマトグラフィー用カラムに充填した。充填した時
、カラム内の種々のサイズの樹脂粒子は、均等に混じり
合っていた。組換えＤＮＡによって発現されたキメラタ
ンパクを含有している細胞リゼイトを調製した。このキ
メラタンパクは、ヒトプロインシュリンのアミノ酸配列
に対応しているアミノ酸配列にメチオニン残基を介して
結合しているアミノ酸のリーダー配列を含むものであっ
た。
先ず臭化シアンでリゼイトを処理して各メチオニン残基
におけるキメラタンパクの切断を行ない、それによって
ヒトプロインシュリン配列を有している分子を遊離させ
、次いでスルフィトリシス条件下で処理してリゼイトの
反応混合物中に存在する各システイニル残基をスルフィ
トライズした。
におけるキメラタンパクの切断を行ない、それによって
ヒトプロインシュリン配列を有している分子を遊離させ
、次いでスルフィトリシス条件下で処理してリゼイトの
反応混合物中に存在する各システイニル残基をスルフィ
トライズした。
上記によって生じた固形物の複合混合物７５Ｍ９を含ん
でいる溶液を７Ｍ尿素（ｐＨ８，５）に溶解した。この
溶液を前記のクロマトグラフィー用カラムに室温、約３
０ｃｚ／時の流速で流しｋ。カラム容量１ρ当たり、プ
ロインシュリンＳ−スルホネート１〜２Ｈに相当する量
の物質をカラムに吸着させた。
でいる溶液を７Ｍ尿素（ｐＨ８，５）に溶解した。この
溶液を前記のクロマトグラフィー用カラムに室温、約３
０ｃｚ／時の流速で流しｋ。カラム容量１ρ当たり、プ
ロインシュリンＳ−スルホネート１〜２Ｈに相当する量
の物質をカラムに吸着させた。
次いで、カラム容量の１０ｍＭエチレンジアミン（ｐＨ
８，５）でカラムを洗浄し、その後２０％のアセトンを
含ん°でいる２０ｍＭエチレンジアミン（ｐＨ９，５）
でプロインシュリンＳ−スルホネートを溶出した。プロ
インシュリンＳ−スルホネートは、９０％以上の収率で
回収され、完全に脱スラッジされており、ＣＮＢｒ切断
による有機不純物を含まず、尿素を包含するスルフィト
リシス試薬を含まず、約１０倍高い純度であった。
８，５）でカラムを洗浄し、その後２０％のアセトンを
含ん°でいる２０ｍＭエチレンジアミン（ｐＨ９，５）
でプロインシュリンＳ−スルホネートを溶出した。プロ
インシュリンＳ−スルホネートは、９０％以上の収率で
回収され、完全に脱スラッジされており、ＣＮＢｒ切断
による有機不純物を含まず、尿素を包含するスルフィト
リシス試薬を含まず、約１０倍高い純度であった。
実施例２ 発酵固形物からのヒトプロインシュリンＳ−
スルホネートの精製における重要なパラメーター 実施例！の記載に従って調製された発酵固形物を使用し
て、一連のバッチ式精製を行なった。バッチ式精製のた
めの方法には、実施例１に記載の方法と同様、有機溶媒
、水性の酸および水性の塩基によってＸＡＤ−７樹脂を
洗浄すること、およびそれを１０ｍＭエチレンジアミン
（ｐＨ８，５）中で湿ったスラリーとして貯蔵しておく
ことが含まれる。試料の添加に先立ち、余分な溶媒を除
去して、湿った粒子として秤量する。穏やかに振盪しな
がら、予め秤量された量の樹脂に、既知の濃度および純
度のプロインシュリンＳ−スルホネートを含有している
発酵固形物からなる吸着溶液を加えた。
スルホネートの精製における重要なパラメーター 実施例！の記載に従って調製された発酵固形物を使用し
て、一連のバッチ式精製を行なった。バッチ式精製のた
めの方法には、実施例１に記載の方法と同様、有機溶媒
、水性の酸および水性の塩基によってＸＡＤ−７樹脂を
洗浄すること、およびそれを１０ｍＭエチレンジアミン
（ｐＨ８，５）中で湿ったスラリーとして貯蔵しておく
ことが含まれる。試料の添加に先立ち、余分な溶媒を除
去して、湿った粒子として秤量する。穏やかに振盪しな
がら、予め秤量された量の樹脂に、既知の濃度および純
度のプロインシュリンＳ−スルホネートを含有している
発酵固形物からなる吸着溶液を加えた。
吸着溶液の９Ｈ，温度、伝導率および溶媒組成を系統的
に変化させた。タンパク吸着の動力学は、吸着させる溶
液の１部を遠心した後、分析用逆相クロマトグラフィー
にかけることでモニターした。
に変化させた。タンパク吸着の動力学は、吸着させる溶
液の１部を遠心した後、分析用逆相クロマトグラフィー
にかけることでモニターした。
目的とする仕込みが終了した後、樹脂から余分な仕込み
溶媒を除去した。吸着させた樹脂１部当たり、１０ｍＭ
水性エチレンジアミン（ｐＨ８、５） １０ｘＱで洗浄
して、吸着されているタンパクの脱着を開始した。余分
な洗浄溶媒を除去した後、樹脂を脱着溶液に懸濁して振
盪した。脱着溶液の溶媒組成および樹脂重量に対するそ
の割合を、所望の生成物の脱着収率および純度を最大に
するように系統的に異ならせた。吸着時と同様に分析用
逆相クロマトグラフィーによってタンパクの脱着力学を
調べた。
溶媒を除去した。吸着させた樹脂１部当たり、１０ｍＭ
水性エチレンジアミン（ｐＨ８、５） １０ｘＱで洗浄
して、吸着されているタンパクの脱着を開始した。余分
な洗浄溶媒を除去した後、樹脂を脱着溶液に懸濁して振
盪した。脱着溶液の溶媒組成および樹脂重量に対するそ
の割合を、所望の生成物の脱着収率および純度を最大に
するように系統的に異ならせた。吸着時と同様に分析用
逆相クロマトグラフィーによってタンパクの脱着力学を
調べた。
以下の表１〜５は、バッチ法を使用する場合の、具体的
な樹脂の特性、吸着条件および溶出条件を包含する本発
明の方法の種々の重要なパラメーターを示している。
な樹脂の特性、吸着条件および溶出条件を包含する本発
明の方法の種々の重要なパラメーターを示している。
表１は、類似のポリスチレン樹脂に比較した場合、吸着
割合および効率においてＸＡＤ−７、アクリレートコポ
リマーが優れていることを示している。
割合および効率においてＸＡＤ−７、アクリレートコポ
リマーが優れていることを示している。
ａ：上澄液の逆相クロマトグラフィー分析によって求め
たプロインシュリンＳ−スルホネートの吸着 ｂ：ジビニルベンゼンーボリスチレンコボリマーＣ：ジ
ビニルベンゼンーアクリレートエステルコボリマー 上の表かられかるように、ＸＡＤ−７では実質上全ての
プロインシュリンＳ−スルホネートは、■。
たプロインシュリンＳ−スルホネートの吸着 ｂ：ジビニルベンゼンーボリスチレンコボリマーＣ：ジ
ビニルベンゼンーアクリレートエステルコボリマー 上の表かられかるように、ＸＡＤ−７では実質上全ての
プロインシュリンＳ−スルホネートは、■。
５時間またはそれ以下の時間で吸着されていたが、ポリ
スチレン樹脂の内置もよいものが同様のレベルに達する
のに３倍の時間を要した。
スチレン樹脂の内置もよいものが同様のレベルに達する
のに３倍の時間を要した。
表２は、本発明に係るカラム吸着に有用なｐＨおよび温
度条件を表わしたものである。
度条件を表わしたものである。
ｉ ２ ＸＡＤ−７によるプロインシュリンＳ−ス
ルホネートは明らかに約７以下のｐＨで起こるが、この
ような条件ではカラムから生成物を溶出することを、不
可能ではないにしても、非常に困難にする予期しない現
象が起こる。
ルホネートは明らかに約７以下のｐＨで起こるが、この
ような条件ではカラムから生成物を溶出することを、不
可能ではないにしても、非常に困難にする予期しない現
象が起こる。
表３は、適切に吸着されたカラムから生成物を溶出する
ためのｐＨの選択および制御の限界を表わしたものであ
る。
ためのｐＨの選択および制御の限界を表わしたものであ
る。
１３− プロインシュリンＳ−スルホネートの脱着の割
合： ｐＨの影響 ａ 脱着条件： ＣＮＢｒ処理された組換えＤＮＡの発
酵リゼイトをスルフィトリシスして得たスルフィトリシ
ス反応溶液を使用して最大量のプロインシュリンＳ−ス
ルホネートを吸着している樹脂１９に４℃で３０％のア
セトンを含有している種々のｐＨの水性緩衝液５ｍ（を
加えた。
合： ｐＨの影響 ａ 脱着条件： ＣＮＢｒ処理された組換えＤＮＡの発
酵リゼイトをスルフィトリシスして得たスルフィトリシ
ス反応溶液を使用して最大量のプロインシュリンＳ−ス
ルホネートを吸着している樹脂１９に４℃で３０％のア
セトンを含有している種々のｐＨの水性緩衝液５ｍ（を
加えた。
ｂｌＯｍＭリン酸アンモニウム水性−アセトン緩衝液
０１０１１１Ｍエチレンジアミン水性−アセトン緩衝液
表４は、生成物の脱着に使用される有機溶媒の適切な選
択の重要性を表わしたものである。
択の重要性を表わしたものである。
表４ プロインシュリンＳ−スルホネートの脱着の割合
： 有機溶媒の影響 ａ 脱着条件： ＣＮＢｒ処理された組換えＤＮＡの発
酵リゼイトをスルフィトリシスして得たスルフィトリシ
ス反応溶液を使用して最大量のプロインシュリンＳ−ス
ルホネートを吸着している樹脂１９に、４℃で３０％の
有機溶媒を含有している水性溶媒に１０ｍＭエチレンジ
アミンを加えた溶液（ｐＨ９，０）の６ｊＩＱを加えた
。
： 有機溶媒の影響 ａ 脱着条件： ＣＮＢｒ処理された組換えＤＮＡの発
酵リゼイトをスルフィトリシスして得たスルフィトリシ
ス反応溶液を使用して最大量のプロインシュリンＳ−ス
ルホネートを吸着している樹脂１９に、４℃で３０％の
有機溶媒を含有している水性溶媒に１０ｍＭエチレンジ
アミンを加えた溶液（ｐＨ９，０）の６ｊＩＱを加えた
。
表５は、有機溶媒の濃度範囲の臨界的重要性を表わした
ものである。
ものである。
青−晃 プロインシュリンＳ−スルホネートの脱着の
割合： 有機溶媒の濃度の影響 ａ 脱着条件：緩衝液のｐＨが１０．５に高められたこ
とを除いては表４に示したものと同じである。上記の脱
着パーセントの数字は、非カラム（バッチ）法によって
得られたほぼ最大の値である。
割合： 有機溶媒の濃度の影響 ａ 脱着条件：緩衝液のｐＨが１０．５に高められたこ
とを除いては表４に示したものと同じである。上記の脱
着パーセントの数字は、非カラム（バッチ）法によって
得られたほぼ最大の値である。
特許出願人 イーライ・リジー・アンド・カンパニー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、プロインシュリン様物質を含有している不純な混合
物から不純物を分離するための方法であって、 （１）該混合物を約７〜約１０のｐＨで逆相マクロポー
ラスアクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸着
させ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約１０容量％〜約３０容量％含有しているｐＨ
約８〜約１１の水性溶出剤を使用して、該プロインシュ
リン様物質を担体から溶出することからなる方法。 ２、プロインシュリン様物質が、ヒトプロインシュリン
のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有している第
１項に記載の方法。 ３、プロインシュリン様物質がプロインシュリンの前駆
体である第１項または第２項に記載の方法。 ４、プロインシュリン様物質がプロインシュリン５−ス
ルホネートである第３項に記載の方法。 ５、マクロポーラスアクリレートエステルコポリマー製
担体がＸＡＤ−７またはＸＡＤ−８である第１項〜第４
項のいずれかに記載の方法。 ６、プロインシュリン様物質を含有している不純な混合
物をバッチ条件下で処理する第５項に記載の方法。 ７、プロインシュリン様物質を含有している不純な混合
物をクロマトグラフィー用カラム条件下で処理する第５
項に記載の方法。 ８、プロインシュリン様物質を含有している不純な混合
物を、約８〜約９のｐＨで→クロポーラスアクリレート
エステルコポリマー製担体に吸着させる第６項または第
７項に記載の方法。 ９、不純な混合物を担体に吸着させた後であって溶出を
行なう前に、約７〜約８．５のｐＨの水性緩衝液で担体
を洗浄する第８項に記載の方法。 １０、約９．５〜約１０．５のｐＨの水性溶出剤を使用
してプロインシュリン様物質を担体から溶出する第９項
に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/720,641 US4616078A (en) | 1985-04-08 | 1985-04-08 | Process for purifying proinsulin-like materials |
| US720641 | 1985-04-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61236796A true JPS61236796A (ja) | 1986-10-22 |
| JPH0796559B2 JPH0796559B2 (ja) | 1995-10-18 |
Family
ID=24894751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61080975A Expired - Lifetime JPH0796559B2 (ja) | 1985-04-08 | 1986-04-07 | プロインシユリン様物質の改良精製法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4616078A (ja) |
| EP (1) | EP0197764B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0796559B2 (ja) |
| KR (1) | KR890001243B1 (ja) |
| AT (1) | ATE91690T1 (ja) |
| AU (1) | AU593242B2 (ja) |
| CA (1) | CA1284249C (ja) |
| DE (1) | DE3688712T2 (ja) |
| DK (1) | DK173414B1 (ja) |
| HU (1) | HU205138B (ja) |
| IE (1) | IE60570B1 (ja) |
| IL (1) | IL78373A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| US4764592A (en) * | 1987-04-23 | 1988-08-16 | Eli Lilly And Company | Crystalline human proinsulin and process for its production |
| DK340189D0 (da) * | 1989-07-10 | 1989-07-10 | Jens Villadsens Fabrikker A S | Fremgangsmaade til fremstilling af en fuldklaebet belaegning paa et underlag |
| US5071560A (en) * | 1989-07-17 | 1991-12-10 | Uop | Process for purifying phenylalanine |
| US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| US7741536B2 (en) | 1997-08-07 | 2010-06-22 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Expression of human serum albumin in plastids |
| US20030204864A1 (en) * | 2001-02-28 | 2003-10-30 | Henry Daniell | Pharmaceutical proteins, human therapeutics, human serum albumin, insulin, native cholera toxic b submitted on transgenic plastids |
| KR100253916B1 (ko) * | 1997-12-29 | 2000-05-01 | 김충환 | 사람 인슐린 전구체의 제조방법 |
| DK1071955T4 (da) * | 1998-04-17 | 2009-06-15 | Innogenetics Nv | Forbedrede immundiagnostiske assays, som anvender reduktionsmidler |
| US20100251425A9 (en) | 1998-05-15 | 2010-09-30 | University Of Central Florida | Expression of human interferon in transgenic chloroplasts |
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
| CA2402066C (en) * | 2000-03-01 | 2015-09-29 | Auburn University | Plastid transformation vectors for expressing human proteins in plants |
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|---|---|---|---|---|
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| US3907676A (en) * | 1970-07-28 | 1975-09-23 | Novo Terapeutisk Labor As | Process for purifying insulin |
| US3876623A (en) * | 1973-05-09 | 1975-04-08 | Lilly Co Eli | Process for purifying insulin |
| AU5397579A (en) * | 1978-12-26 | 1980-07-03 | Eli Lilly And Company | Purifying insulin |
| US4430266A (en) * | 1980-11-28 | 1984-02-07 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin precursor |
-
1985
- 1985-04-08 US US06/720,641 patent/US4616078A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-03-31 IL IL78373A patent/IL78373A/xx unknown
- 1986-04-01 CA CA000505536A patent/CA1284249C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-03 AT AT86302461T patent/ATE91690T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-04-03 DE DE86302461T patent/DE3688712T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1986-04-03 HU HU861419A patent/HU205138B/hu not_active IP Right Cessation
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- 1986-04-04 AU AU55655/86A patent/AU593242B2/en not_active Ceased
- 1986-04-07 JP JP61080975A patent/JPH0796559B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-07 KR KR1019860002611A patent/KR890001243B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
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