CS261994B1

CS261994B1 - Způsob izolace insulnu z vodných roztoků

Info

Publication number: CS261994B1
Application number: CS87657A
Authority: CS
Inventors: Jaromir Ing Klancik; Zdenek Cihak; Vaclav Ing Csc Bartl; Tomas Ing Buchvaldek; Olga Hedrlinova; Vladimir Rndr Csc Prochazka; Zdenek Barta; Milena Rndr Braunsteinova
Original assignee: Jaromir Ing Klancik; Zdenek Cihak; Vaclav Ing Csc Bartl; Buchvaldek Tomas; Olga Hedrlinova; Prochazka Vladimir; Zdenek Barta; Milena Rndr Braunsteinova
Priority date: 1987-02-03
Filing date: 1987-02-03
Publication date: 1989-02-10
Also published as: CS65787A1

Abstract

Řešení se týká izolace insulinu z přírodního materiálu, z vodných, roztoků po odstranění ethanolu a hlavního podílu lipidů. Podstata je v tom, že se vodný koncentrát surového insulinu o minimální koncentraci 100 ^g/cm3 upraví hází na hodnotu pH 6,9 ,až 10,5, potom se zvýší měrná vodivost roztoku na hodnotu 50 až 120 mS/cm buď solí alkalického kovu, nebo solí amonnou, nebo přídavkem vysoleného surového insulinu, načež se pevná fáze oddělí, promyje organickým rozpouštědlem nebo směsí organických rozpouštědel mísitelných s vodou. Ze získané pevné fáze se připraví farmaceuticky čistý insulin buď přímo krystalizací v přítomnosti zinečnatých lontů, anebo po předchozím chromatografickém nebo elektrochemickém přečištění. Řešení přináší zvýšení výroby žádaného· léku při současné úspoře surovin a energie a zjednodušuje celou izolaci insulinu.

Description

Vynález se týká způsobu izolace insulinu z pankreatu jatečních zvířat.

Výroba insulinu spočívá v desintegraci zmražených žláz, extrakcí vodným okyseleným ethanolem, vyčeření extraktu a následném odloučení aniontu kyseliny přítomné při extrakci, spolu s některými balastními látkami organického původu. Potom se ethanol oddestiluje za sníženého tlaku a z vodného odparku se vysolí surový insulin (vysolenina). Do tohoto základního schématu bývají často vkládány další operace s cílem zlepšení zpracovatelnosti meziproduktů, snížení ztrát a zvýšení kvality finální substance (např. čs. AO č. 187 784).

Surový vysolený Insulin se po rozpuštění zbaví dalších bílkovinných příměsí úpravou pH a filtrací. Z čirého filtrátu se sráží amorfní insulin obvykle v přítomnosti zinečnatých iontů (tzv. Zn-amorfní insulin), často 1 pomocí přídavku organických s vodou mísitelných rozpouštědel. Z rozteku amorfního Zn-insulinu se postupným srážením při různých hodnotách pH (např. podle čs. pat. č. 131144) odstraní další průvodní látky bílkovinné povahy, načež je insulin krystalován za přítomnosti zinečnatých iontů.

Takto připravená substance se používá pro výrobu běžných insulinových přípravků. Pro výrobu přípravků o vyšší čistotě se insulin dále čistí např. chromatografií na molekulových sítech (např. čs. AO č. 186 988). Při chromatografickém přečištění by měl mít Insulin maximálně 10 % průvodních nečistot, ale nověji bylo zjištěno, že chromatografie probíhá se stejnou účinností i při 40 % znečištění insulinu, v závislosti na povaze průvodních nečistot.

Každou čisticí operací však dochází ke ztrátám žádaného produktu a k velké spotřebě rozpouštědel. Nevýhodou většiny známých postupů je nutnost odstraňování krevních barvlv· v některých stupních izolace adsorpcí na sorbentech s velkým aktivním povrchem (viz čs. AO č. 187 784). Současnými klasickými postupy je insulin průmyslově vyráběn v celosvětovém měřítku od počátku padesátých let. Na více pracovištích byl proto hledán jednodušší a racionálnější postup, avšak zatím bez prakticky použitelného výsledku.

Výjimku činí způsob izolace insulinu podle USA pat. spis. č. 3 719 055, který využívá krystalizace insulinu z bazických roztoků za přítomnosti iontů alkalických kovů nebo iontů amonných. Tento postup je však prakticky obtížně využitelný pro méně čisté meziprodukty, jako je například vysolený surový insulin (salt cákej a ve finálních stupních výroby postrádá význam. Příčinou je značná obtížnost nastavení optimální koncentrace iontů, což má za následek špatnou reprodukovatelnost výtěžků i čistoty izolovaného insulinu.

V řadě případů, kdy je jako výchozí materiál používán vysolený surový insulin nebo vodný koncentrát z odparky, vylučuje se spolu s insulinem značné množství nepolárních látek, pocházejících z pankreatu, které mnohdy činí další zpracování téměř nemožným či značně ztrátovým.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob izolace insulinu z vodných roztoků po odstranění ethanolu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se vodný koncentrát surového insulinu o minimální koncentraci 100 gg/cm³ upraví bází na hodnotu pH 6,9 až 10,5. Potom se zvýší měrná vodivost roztoku na hodnotu 50 až 120 mS/cm, načež se pevná fáze oddělí, promyje organickým rozpouštědlem nebo směsí organických rozpouštědel mísitelných s vodou a ze získané pevné fáze se připraví farmaceuticky čistý insulin buď přímou krystalizaci ιν· přítomnosti zinečnatých iontů, anebo po předchozím chromatografickém nebo elektrochemickém přečištění.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se vodný koncentrát surového insulinu upraví přídavkem hydroxidu alkalického kovu nebo hydroxidu amonného na hodnotu pH 7,8 až 8,2.

Měrná vodivost roztoku se zvýší způsobem podle vynálezu na hodnotu 60 až 90 mS/cm přídavkem sodných nebo amonných solí, zejména síranů, chloridů, fosfátů nebo jejich směsí, popřípadě přídavkem vysoleného surového insulinu.

Způsobem podle vynálezu se pevná fáze promývá alkanolem s 1 až 3 atomy uhlíku nebo acetonem, případně jejich směsí.

Způsobem podle vynálezu se ze získané pevné fáze připraví čistý Insulin.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se vodný roztok insulinu o koncentraci větší než 100 ^íg/cm³ zbaví hrubě dispergovaných částic, případně se vyčeří zcela, a to filtrací či centrifugách Potom se podrobí úpravě pH na hodnotu 7,8 až 8,2 pomocí hydroxidu alkalického kovu nebo hydroxidu amonného. Měrná vodivost roztoku se zvýší na hodnotu 60 až 90 mS/cm přídavkem soli alkalického kovu nebo soli amonné, kde aniontem může být síran, fosfát anebo chlorid.

Pro průmyslové využití je výhodné používat při všech úpravách ionty téhož druhu. Pevná fáze obsahující insulin se z roztoku vyloučí zpravidla do 40 hodin. Potom se separuje například tak, že se ponechá 8 až 14 hodin sedimentovat, supernatant se odsaje a sediment se zbaví zbytků matečného louhu vakuovou filtrací na frltě č. 4. Z pevné fáze se odstraní rezidua nepolárních látek opakovanou extrakcí acetonem a potom se dosuší promytím etherem, Po rozpuštění a odfiltrování halastních látek nerozpustných při pH 2,0 až 2,8 je insulin krystalizován v přítomnosti zinečnatých iontů buď přímo, anebo po předchozím chromatografickém přečištění.

Způsob podle vynálezu lze s výhodou použít při čištění surového vysoleného insulinu

S (vysoleniny) vg finální části výroby. Postup umožňuje rychlou izolací insulinu z roztoků obsahujících značné množství průvodních látek, jako jsou například krevní barviva, zbytky látek lipidícké povahy, aciproteiny, bílkovinné příměsi o molekulové hmotnosti větší nc-ž asi 20 000 apod., čímž přináší zjednodušení, případně vynechání některých předřazených či následných čisticích operací.

•Způsob podle vynálezu dále umožňuje přípravu insulinu o vyšší čistotě přímo bez izolace krystalického Zn-insulinu před chromatograíii. Tím se raprodukové.telně získává již z vysoleného meziproduktu relativně vysoce čistý insulin, v průmyslovém měřítku zpracovatelný na finální substanci s minimálními ztrátami, cež se projevuje významným zvýšením výtěžku žádaného produktu při sončnsném snížení nároků -na pracnost, zařízení a spotřebu surovin i energií.

Autory vynálezu bylo prokázáno, že postupem podlí; vynálezu dojde k zvýšení výtěžku insulinu, o 4 až 20 %.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.

Příklady provedení

Příklad 1 .35,9 g vysoleniny, pocházející z 10 0 kg vepřového pankreatu, vysolené pomocí chloridu sodného, bylo rozpuštěno v 100 cra^sdestilované vody při pH 6,9 nastaveném pomocí 5 M hydroxidu amonného. Hodnota měrné vodivosti byla upravena přídavkem chloridu sodného na 85 mS/cm a· konečná hodnota pil byla. nastavena na 7,7. Po třech hodinách míchání při teplotě 16 až 18 °C byla vyloučená pevná fúze odfiltrována, třikrát rozmíchána s celkem 300 cm³ ethanolu, který byl vždy po pěti minutách míchání odsát.

Čistá sraženina, lu/la rozpuštěna v 10,0 cm³destilované vody při pil 2,1 nastaveném pomocí 1,5 M kyseliny chlorovodíkové a roztok byl podroben gelové filtraci na sloupci 5 X 100 cm polydex trámového molekulového síta při eluci 0,01 M kyselinou chlorovodíkovou. Z eluátu byl nejprve vysrážen amorfní insulin 5 % obj. přídavkem, 10' % roztoku octanu zinečnatého a 10 % obj. acetonu při pH 6,4.

Amorfní insulin byl po odstředění rozpuštěn v roztoku 1 g kyseliny citrónové v 60 cm³ destilované vody. Po přídavku 1,6 cm³'5 % roztoku chloridu zinečnatého a 12 cm³acetonu byla provedena krystahza.ee úpravou pH na 5,8 pomocí 5 M hydroxidu amonného. Vyloučený krystalický insulin byl separován filtrací, odvodněn promytím acetonem s etherem a dosušen v exsikáloru nad •oxidem fosforečným. Bylo izolováno 1,1370 gramu insulinu o biologické aktivitě 24,89 j/mg.

Příklad 2

Postupem podle příkladu 1 bylo zpracováno 38,2 g vysoleniny pocházející z 10,0 kg vepřové;.; o pankreatu a měrná vodivost roztoku byla nastavena na 70 mS/cm přídavkem 14,6 g vysoleniny pocházející z 3,8 kg vepřového pankreatu, přičemž byla průběžně udržována hodnota pH 6,7 až 8,1 pomocí 5 M hydroxidu amonného. Konečná hodnota píl byla nastavena na 8,0. Pevná fáze byla vyloučena po 30 minutách a po rozpuštění a filtraci běžným způsobem zkrystalizována v citrátovém pufru. na Zn-krystalický insulin. Bylo Izolováno 1,7931 g Insulinu o biologické účinnosti 23,92 j/mg.

Příklad 3

50,2 g vysoleniny pocházející z 10 g hovězího pankreatu vysolené síranem amonným z hrubě předčištěného vodného odparku se zbytky balastních látek bílkovinné a lipidícké povahy bylo rozpuštěno v 1 000 cm³demineralizované vody při pH 8,0 upraveném pomocí 5 M hydroxidu sodného. Po filtraci byla hodnota měrné vodivosti roztoku upravena přídavkem chloridu sodného na 63 mS/cm. Po 40 hodinách míchání byla vyloučena pevná fáze ponechána 5 hodin sedimentovat, matečný louh byl vakuově odsků:, sediment se zbytky matečného· louhu byl oddělen na fritě č. 4 a dále zpracován jako v příkladě 1 s tím, že k extrakci balastních látek byl místo ethanolu použit ve stejném objemu aceton. Bylo izolováno 0,9803 g insulinu o biologické aktivitě 26,43 j/mg.

P ř í k 1 a d 4

Stejným postupem jako v příkladě 3 bylo zpracováno 50,2 g vysoleniny a hodnota měrné vodivosti roztoku 90 mS/cm byla nastavena pomocí síranu sodného. Bylo izolováno 0,9956 g insulinu o biologické aktivitě 25,04 j/mg.

P ř í k 1 a d 5

Podle příkladu 3 bylo zpracováno 50,2 g vysoleniny e hodnota měrné vodivosti roztoku 100 mS/cm byla nastavena pomocí síranu amonného. Bylo izolováno 0,9495 g Insulinu o· biologické aktivitě 25,51 j/mg.

P ř í klade

3,2,1 g vysoleniny pocházející ze směsi 7 kg vepřového a 3 kg hovězího pankreatu, vysolené chloridem sodným bylo rozpuštěno 1 500 cm³ destilované vody při pH 2,3 nastaveném přídavky kyseliny octové. Po filtraci byla nastavena hodnota pH 7,9 pomocí 5 M hydroxidu sodného a měrná vodivost roztoku 75 mS/cní pomocí chloridu sod7 ného. Po 60 hod. míchání byla vyloučená ipevná fáze ponechána sedimentovat 5 hodin. Sediment byl zbaven zbytků kapalné fáze filtrací na fritě č. 4 a přečištěn pro-mytím 3 X 150 -cm³ methanolu. Po dosušení etherem a v exsikátoru nad oxidem fosforečným zpracován dále jako v příkladě 1. Bylo izolováno 1,10123 g insulinu o biologické účinnosti '25,51 j/mg.

P ř í k 1 a d 7

Podle postupu v příkladě 6 bylo zpracováno 32,1 g vysoleniny a při jejím rozpouštění bylo nastaveno pH 2,2 pomocí 1 M kyseliny sírové, měrná vodivost 58 mS/c-m byla upravena přídavkem síranu amonného a k extrakci balastnich látek ze sedimentu bylo použito 220 cm³ ethanolu. Bylo- izolováno 1,01-77 g insulinu o biologické účinnosti 24,83 j/mg.

Příklad 8

Podle postupu v příkladě 6 bylo zpracováno 32,1 g vysoleniny a při jejím rozpuštění bylo nastaveno pH 2,7 pomocí 1,5 M kyseliny chlorovodíkové a hodnota měrné vodivosti 95 mS/cm pomocí síranu sodného. Konečná hodnota -pH 8,5 byla nastavena pomocí hydroxidu draselného a pevná fáze byla oddělena centrifugaci. Bylo izolováno 1,0027 g insulinu o účinnosti 23,94 j/mg. Příklad 9

Bylo zpracováno 5,0 1 vodného filtrovaného odparku o pH 2,3 pocházejících -z 10,0 vepřového pankreatu. Pomoci 5 M hydroxidu sodného byl-a upravena hodnota pH 8,1 a hodnota měrné vodivosti 88 miS/cm byla upravena přídavkem chloridu sodného. Po 120 hodinách byla pevná fáze ponechána 5 hodin sedimentovat. Asi 9/10 kapalné fáze nad sedimentem bylo odtaženo a pevná fáze byla dosušena filtrací na fritě, promývána 5 X 200 cm³ acetonem, dosušena etherem a po rozpuštění a filtraci podrobena gel·,-vé filtraci na sloupci polydextranového gelu a potom byl insulin běžným způsobem zkrystalizová-n v přítomnosti zinečnatých iontů. Byl-o izolováno 0,8394 g insulinu v aktivů ě 24,01 j/mg.

Claims

PREDMET

1. Způsob izolace insulinu z vodných roztoků po odstranění ethanolu a většiny vyloučených lipidů, vyznačující se tím, že se vodný koncentrát surového insulinu o minimální koncentraci 100 ^g/cm³ upraví bází na hodnotu pH 6,9 až 10,5, potom se zvýší měrná vodivost na hodnotu 50 až 120 mS/ /cm, načež se pevná fáze oddělí, promyje organickým rozpouštědlem nebo směsí organických rozpouštědel mísitel-ných s vodou a ze získané pevné fáze se připraví farmaceuticky čistý insulin buď přímou krystalizací v. přítomnosti zinečnatých iontů, anebo po předchozím chro-matogr-afickém nebo elektrochemickém přečištění.
2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se vodný koncentrát surového insulinu upraví přídavkem hydroxidu alkalického kovu nebe- hydroxidu amonného na hodnotu pH 6,9 až 10,5, s výhodou na hodnotu pH 7,8 až 8,2.
3. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že měrná vodivost se zvýší přídavkem sodných, draselných nebo -amonných solí, zejména síranů, chloridů, fosfátů nebo jejich směsí, popříp-adě přídavkem vysoleného surového insulinu na hodnotu 50 až 120 mS/ /cm, s výhodou -na hodnotu 80 až 90 mS/cm.
4. Způsob rpodle bodu 1 vyznačující se tím, že se pevná fáze opako-v-aně promývá alkanolem s 1 až 3 atomy uhlíku nebo -acetonem, případně jejich směsí.

Severografia, n. p. závod 7, Most

Cena 2,40 Kčs