JPH0224840B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、均質なタンパク質としてのヒトの線
維芽細胞インターフエロン（human fibrobla−
st interferon）およびアフイニテイー（affinity）
クロマトグラフイーの高圧液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）との組み合わせによるその製造方法
に関する。 より詳細には本発明は、 (a) 均質な形態であり、 (b) HPLC条件下、炭化水素結合シリカマトリツ
クスカラムで単一ビークを示し、 (c) ドデシル硫酸ナトリウムを含まず、 (d) ２−メルカプトエタノールの存在下でのドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動で単一のせまいバンドを示し、 (e) 次のＮ末端部分的アミノ酸配列、H₂N−
Met¹−Ser−Tyr−Asn−Leu⁵−Leu−Gly−
Phe−Leu−Gln¹⁰−Arg−Ser−Ser−Asn−
Phe¹⁵−Gln−……−Gln−Lys¹⁹−……を有し、 そして(f)次の工程： Ａ 不純な状態のヒト線維芽細胞インターフエロ
ンの水溶液をアフイニテイー・クロマトグラフ
イーのカラムに通してインターフエロンをカラ
ム上に吸着させ、しかる後インターフエロンを
カラムから溶離し、そしてインターフエロンを
溶出液の選んだフラクシヨン中に増大した純度
の状態で得る； Ｂ 工程Ａにおいて得られた選んだインターフエ
ロンのフラクシヨンを１または２個以上の緩衝
平衡化した炭化水素結合シリカマトリツクスカ
ラムにHPLC条件下で通し、ここで炭化水素は
シクロヘキシル、フエニル、ジフエニル、オク
チル、オクタデシルおよびシアノプロピルから
なる群より選ばれ、これによつてインターフエ
ロンをカラムに吸着させ、しかる後インターフ
エロンをカラムから水混和性溶媒の酸性水性緩
衝混合物の勾配で溶離し、そしてインターフエ
ロンを溶出液の選んだフラクシヨン中の単一の
明確なピークとして均質なタンパク質の状態で
得る；を組合せることからなる方法により得る
ことができること特徴とするヒトの線維芽細胞
インターフエロンおよびその製造方法に関す
る。 なお、本発明の均質ヒト線維芽細胞インターフ
エロンは本明細書に記載の方法によつて製造され
た均質ヒト線維芽細胞インターフエロンに限定さ
れるものではなく、いかなる適当な方法によつて
製造されたいかなる均質ヒト線維芽細胞インター
フエロンをも包含するものであり、かつ本発明の
権利はいかなる均質ヒト線維芽細胞インターフエ
ロンにも及ぶものである。 IsaacsおよびLindenmannによる最初の発見以
来、白血球または線維芽細胞のいずれの形態のイ
ンターフエロンも、その特定の生物学的および化
学的性質を特性づけ且つ確認するために十分な量
で均質なペプチドとして単離することは、世界中
で20年間にわたる研究機関での研究者達の試みに
かかわらず不可能であつた。数人の著者らはマウ
スまたはヒトのインターフエロンを均質にまで精
製したと主張しているが、タンパク質材料の均質
性の正統的証拠はまつたく示されていないか、或
いは純粋であると主張する化合物の性質について
何ら記載されていなかつた。 タンパク質の精製に高性能液体クロマトグラフ
イー（HPLC）を使用することは一般的技術的に
知られている。文献にはタンパク質の精製におけ
るイオン交換およびサイズ排除型のカラムが詳細
に記載されており（たとえば、Regnierおよび
Noel，J.Chromatog.Sci.14，316−20〔1976〕並
びにChang et al.，Anal.Chem.48，1839−45
〔1976〕参照）、そして逆相（reverse phase）分
配クロマトグラフイーにおけるリクロソルブ
（Lichro−sorb）RP−18（オクタデシル結合シリ
カ微粒子カラム）の使用により、β−エンドルフ
インのようなペプチドを精製するのに成功したも
のである〔Rubinstein et al.，Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA74，4969−72（1977）〕。 ヒトの線維芽細胞インターフエロンの精製にお
ける−工程としてアフイニテイー・クロマトグラ
フイーを用いることは、当該分野で知られてい
る。すなわち、Davey et al.，J.Biol.Chem.251，
7620（1976）は、コンカナバリンＡ−セフアロー
ス4B（Concanavalin Ａ−Sepharose 4B）アフ
イニテイー・クロマトグラフイーを用いて精製さ
れたヒトの線維芽細胞インターフエロンを製造す
ることを記載している。Jankowski et al.，
Biochemi−stry15，5182（1976）は同じ目的に、
ブルー・デキストラン−セフアロース（Blue
Dextran−Sepharose）を利用している。最後
に、米国特許第4172071号（de Maeyer et al.）
によれば、白血球および線維芽細胞のインターフ
エロンの種々の粗製溶液の精製は、ブルー・デキ
ストラン−セフアロースのカラムとさらにアフイ
ニテイー・クロマトグラフイーによつて達成さ
れ、１〜５×10⁸インタフエロン国際単位の比活
性をもつ調製物を生成した。追加の精製工程は開
示されておらず、そして得られるインターフエロ
ン調製物は、汚染タンパク質を大部分除去したイ
ンターフエロン型活性をもつ生成物を高い含量で
含有することが示されている。 本発明の改良された方法は、ヒトの線維芽細胞
の効率よい精製を達成するために、アフイニテイ
ー・クロマトグラフイーの工程と高圧液体クロマ
トグラフイーの工程との組み合わせを提供する。 さらに詳しくは、本発明の方法は、次の工程の
組み合わせからなる： Ａ 不純の状態のヒトの線維芽細胞インターフエ
ロンの水溶液をアフイニテイー・クロマトグラ
フイーのカラムに通して該インターフエロンを
カラム上に吸収させ、しかる後該インターフエ
ロンを該カラムから溶離し、そして該インター
フエロンを該溶出液の選んだフラクシヨン中に
増大した純度の状態で得、そして Ｂ 工程Ａにおいて得られた選んだ該インターフ
エロンのフラクシヨンを１または２個以上の緩
衝平衡化した炭化水素結合シリカマトリツクス
カラムに高圧液体クロマトグラフイー条件下で
通し、こゝで該炭化水素はシクロヘキシル、フ
エニル、ジフエニル、オクチル、オクタデシル
およびシアノプロピルからなる群より選ばれ、
これによつて該インターフエロンを該カラムに
吸収させ、その後該インターフエロンを該カラ
ムから水混和性溶媒の酸性水性緩衝混合物の勾
配で溶離し、そしてインターフエロンを該溶出
液の選んだフラクシヨン中の単一の明確なピー
クとして均質なタンパク質の状態で得る。 本発明のアフイニテイー・クロマトグラフイー
法において、コンカナバリンＡ−セフアロース
4B（Concanavalin Ａ−Sepharose 4B）または
ブルー・デキストラン−セフアロース（Blue
Dextran−Sepharose）を使用することができ、
そして後者を使用することは、このような方法が
コンカナバリンＡ−セフアロース4B法よりも実
質的に高い収率を与え、そしてまた一層安定な生
成物を与える事実から見て好ましい。 コンカナバリンＡ−セフアロース4B法のため
に、次のプロトコール（protocol）を用いること
ができる： (a) イーグル（Eagle）の最小必須培地
（essential medium）を含有する５％の子牛
血清中の粗製のヒトの線維芽細胞インターフ
エロン（比活性約10⁴単位／mg）の20〜30カ
ラム体積を、コンカナバリンＡ−セフアロー
ス4Bカラム上へ30〜60cm／時の流速で送り、 (b) リン酸緩衝塩溶液（phosphate buffered
saline）（PBS）PH7.2で洗浄し、 (c) PBS−0.1Mのα−メチルマンノシド（α
−MM）で洗浄し、そして (d) 50％のエチレングリコールを含有する
PBS−0.1Mのα−MMで溶離する。 工程(d)から得られた生ずる精製インターフエロ
ンは、約10⁷単位／mgの比活性を示し、回収率が
約10〜30％である。 アフイニテイー・クロマトグラフイーにおいて
ブルー・デキストラン−セフアロースを用いるプ
ロトコールは次のとおりである： (a) 培養物の上澄液（１〜３×10⁴単位／ml、
0.2〜１mgのタンパク質／ml）の10〜40カラ
ム体積を、飽和NaCl溶液の添加により
1.25MのNaClに調整し、次いでカラム上に
20〜40cm／時の直線速度で送り、 (b) このカラムを1MのNaCl／0.02〜0.05Mの
リン酸塩の５〜15カラム体積で、次いで 15％（Ｖ／Ｖ）のエチレングリコールを含有
する1MのNaCl／0.02〜0.05Mのリン酸塩
（pH7.2）の５〜15カラム体積で洗浄し、そ
して (c) インターフエロンを50％（Ｖ／Ｖ）のエチ
レングリコールを含有するIMのNaCl／0.02
〜0.05Mのリン酸塩（PH7.2）で溶離する。 生ずるインターフエロンはほぼ３×10⁶単位／
mgの比活性を有し、そしてこの工程において約80
％の回収率で得ることができる。 上記のアフイニテイー・クロマトグラフイー工
程において使用できるブルー・デキストラン−セ
フアロースはブルー・デキストラン〔デキストラ
ン（Dextran）へ結合したシバクロン・ブルー
F3GA（Cibacron Blue F3GA）〕を臭化シアン−
活性化セフアロース4BにPH9.5で結合することに
よつて都合よく製造することができる。 前述の結合法、ならびに樹脂の洗浄および熟
成、カラムの装填および溶離の設計は、生成物の
ヒトの線維芽細胞インターフエロンの最高の収率
および最高の純度を得るために重要である。 血清不含培地からインターフエロンを採収する
場合、均質までの精製はブルー・セフアロース
4Bカラムに１回または２回通し、30〜50％
（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール／緩衝水溶性（PH
7.2）で溶離することによつて達成される。 アフイニテイー・クロマトグラフイー工程にお
いて製造したインターフエロンをさらに精製する
ためには、分取規模（preparative scale）で高
い分割性と高い収率をもつ１または２以上の高圧
液体クロマトグラフイー工程においてインターフ
エロンを処理する。この液体クロマトグラフイー
法は、シクロヘキシル、オクチル、オクタデシ
ル、フエニル、ジフエニルまたはシアノプロピル
基が結合した多孔質シリカのマトリツクスを含有
するカラムを使用する。これらのカラムは順番に
且つPHおよび有機溶媒の勾配の変化する条件下で
使用することができ、そしてヒトの線維芽細胞イ
ンターフエロンを均質になるまで精製することが
でき、この均質性はドデシル硫酸ナトリウム
（NaDodso₄）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
上の単一帯、一定の比活性、および重ね合わせる
ことができる活性およびタンパク質レベルをもつ
HPLC上の単一ピークによつて決定される。 本発明の実施において使用する。結合したシク
ロヘキシル、オクチル、オクタデシル、フエニル
またはシアノプロピル基を有する不規則な型の完
全に多孔質の微粒子のカラム（粒度約10ミクロン
および孔径約100Å）は市販されている。 前述のカラムに使用する便利な高圧液体クロマ
トグラフイー系は、米国特許第4116046号
（Stanley Stein）に記載されている。 この方法の実施において、PH４〜８の水性緩衝
液中のアフイニテイー・クロマトグラフイーによ
つて精製したヒトの線維芽細胞インターフエロン
の溶液を、シリカのマトリツクスのカラムに通
す。本発明の目的に好ましい緩衝液は、ピリジ
ン／ギ酸／水（８：８：84，Ｖ／Ｖ）である。通
常、この方法は加圧下に、好ましくは約3.4〜約
340気圧の範囲において実施する。インターフエ
ロンはカラムに吸収させ、次いで選択的方式で水
性緩衝液の勾配と変化量の水混和性溶媒を用いて
溶離する。この目的に適当な水混和性溶媒は、ア
ルコール、たとえば、ｎ−プロパノール、イソー
プロパノール、ｎ−ブタノール、tert−ブタノー
ル、エタノール、メタノールなどを包含する。プ
ロパノールとブタノールとの混合物は、ヒトの線
維芽細胞インターフエロンの溶離にとくに好まし
い。 溶出液の分別は、それ自体既知の方法におい
て、フラクシヨン収集器を用い、高い感度で動作
するペプチド監視装置により各フラクシヨン中の
タンパク質分を同時に監視することによつて達成
する。この目的に適当な系は、Bohlen et al.，
Anal.Biochem.67，438（1975）に開示されてい
る。米国特許第3876881号も参照。 高圧液体クロマトグラフイー工程において使用
する特定の樹脂の種類は、この工程のためのヒト
の線維芽細胞の源および純度に依存して選択す
る。すなわちコンカナバリンＡ−セフアロースの
カラムのアフイニテイー・クロマトグラフイーに
より製造される材料は、シクロヘキシル結合シリ
カのカラム、次いでオクチル結合シリカのカラム
上の高圧液体クロマトグラフイーを用いて、均質
に都合よく精製される。他方において、ブルー・
デキストランのカラムをアフイニテイー・クロマ
トグラフイー工程において使用するとき、均質に
なるまでの精製は、オクチル結合シリカのカラム
に１回または２回以上通すことにより、或いは別
法としてオクチル結合シリカのカラムに通し、次
いでシアノプロピル結合シリカのカラムに通し、
次いで必要に応じ、ジフエニル結合シリカのカラ
ムに通すことによつて達成することができる。ブ
ルー・セフアロース−4Bのカラムと血清不含調
製物を用いるとき、オクチル結合シリカのカラム
の単一通過は均一な調製物を生成するであろう。 中性のPHにおける有機溶媒、たとえば、プロパ
ノール、ブタノールまたは２−メトキシエタノー
ルの存在下でのヒトの線維芽細胞インターフエロ
ン活性の感受性のため、クロマトグラフイーは酸
性のPHにおいて実施した。ヒトの線維芽細胞イン
ターフエロンは白血球のインターフエロンよりも
疎水性であるので、そして部分的に精製した線維
芽細胞インターフエロン調製物中に一層疎水性の
他のタンパク質が存在するため、プロパノールと
ブタノールとの混合物はｎ−プロパノールより
も、逆相（revers phase）カラムのための好まし
い溶媒であることがわかつた。このような混合物
は、すべての吸収されたタンパク質の完全な溶離
のために必要な有機溶媒濃度を限定し、こうして
高装填においてタンパク質の低い溶解度のための
人工物（artifact）の発生を減少する。 本発明に従つて得られる均質なヒトの線維芽細
胞インターフエロンは、最後の段階の高性能液体
クロマトグラフイーのカラムにおいて単一ピーク
として誘導され、そして２−メルカプトエタノー
ルの存在下でNaDodSO₄ポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動上に単一の狭い帯を与えた。このゲ
ルの抽出は、タンパク質帯と一致する抗ウイルス
活性をもつ単一ピークを与えた。ヒトの線維芽細
胞インターフエロンについての普通の抗ウイルス
検定は、いずれもこの目的に使用することができ
る。 ポリアクリルアミドゲル法により決定した均質
なヒトの線維芽細胞インターフエロンの分子量
は、ほぼ20500であつた。この精製した物質の比
活性は、ほぼ４×10⁸単位／mgであつた。均質な
ヒト線維芽細胞インターフエロンの試料について
得られたＮ−末端部分的序列はMet¹−Ser−Tyr
−Asn−Leu⁵−Leu−Gly−Phe−Leu−Gln¹⁰−
Arg−Ser−Ser−Asn−Phe¹⁵−Gln−……−Gln
−Lys¹⁹−……であつた。 フインターフエロン類は抗ウイルス活性、制癌
活性、生長阻止活性および腫瘍抑制活性を示し
た。これらの活性は、ヒトのインターフエロンが
１％より少ない比較的粗製の製剤を用いて１〜10
×10⁶単位／日を用いる臨床レベルにおいてさえ
得られた。本発明の精製された均質なヒトの線維
芽細胞インターフエロンは、従来用いられた粗製
の製剤と同じ方法で投与量を調整して望む等価レ
ベルのインターフエロン単位を与えるようにして
使用することができる。 本発明の方法および生成物の態様を、次の実施
例を参照しながらさらに説明する。すべてのイン
ターフエロンの力価は、米国ナシヨナル、インス
チチユーツ・オブ・ヘルス（Ｕ・Ｓ・National
Institues of Health）により提供されたヒトの
白血球インターフエロン（G023−901−527）の
ための参照標準に対する参照単位／mlまたは単
位／mlで表わす。 実施例 １ コンカナバリンＡアフイニテイー・クロマトグ
ラフイー 0.1Mのα−MMを含有するPBSPH7.2で平衡化
した50mlのコンカナバリンＡ−セフアロース4B
の50mlを、ポリエチレンのデイスク・フリツトを
備えた50mlのポリプロピレンカラムに詰めた。そ
れに180ml／時（35.5cm／時）の流速で、比活性
が２×10⁴単位／mgの粗製インターフエロン（２
×10⁷単位）1.25を装填した。供給したカラム
を150mlのPSS緩衝液、そして0.1のα−MMを含
有する600mlのPBS緩衝液で洗つた。インターフ
エロンを最後に50％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコー
ルを含有する上記緩衝液で溶離した。この方法の
収率は９％（1.8×10⁶単位）であり、比活性は約
１×10⁷単位／mgであつた。追加のフラクシヨン
を含むより広いカツトは15％（３×10⁶単位）を
生じ、比活性は２〜４×10⁶単位／mgであつた。 HPLC コンカナバリンＡ−セフアロース4Bカラムか
らの合計120mlの溶離液（2.5×10⁶単位；約２〜
４×10⁶単位／mg）を、ピリジン／ギ酸／イソプ
ロパノール／水（８：８：20：64，Ｖ／Ｖ，緩衝
液Ａ）で平衡化したクロメガボンド
（Chromegabond）10μシクロヘキシルカラム
（4.6×300mm）に、直接0.4〜0.8ml／分の範囲の流
速で供給し、最高背圧を306気圧以下に保持した。
このHPLC法に使用した系は、本質的にBohlen
et al.（Anal Biochem.67，438〔1975〕）が記載す
るものであつた。 次の緩衝液Ａから最後の緩衝液Ｂ（ピリジン／
ギ酸／イソプロパノール／ｎ−ブタノール／水
８：８：25：20：39，Ｖ／Ｖ）に至る勾配は、
0.4ｍ／分；０〜25％Ｂ、32分；25〜60％Ｂ、225
分；60〜100％Ｂ、63分において実施した。2.0ml
のフラクシヨンを集めた。活性ピークの中心のフ
ラクシヨン26〜29からなるプール（２×10⁶単位）
を取り、そして４mlのピリジン／ギ酸で希釈し
た。この溶液をポンプを通してクロメガボンド
10μオクチルのカラム（4.6×300mm）に供給した。
溶離条件は前記のシクロヘキシルカラムについて
と同一であつた。活性ピークの中心の比活性はほ
ぼ４×10⁸単位／mgであり、精製されたヒトの線
維芽細胞インターフエロンの合計の収量は10⁶単
位であつた。 シクロヘキシルカラムとオクチルカラムの両方
についてのインターフエロンの溶離位置は、コン
カナバリンＡで精製したインターフエロンをいず
れかのカラムでHPLCに付すとき、主中央ピーク
に非常に近接することに注意すべきである。最初
のHPLC工程をオクチルカラムで実施するとき、
インターフエロンは主中央ピークのちようど前に
溶出するが、それはシクロヘキシルカラムで同り
クロマトグラフイー条件下にそのピークの直径に
溶出する。 HPLC精製したヒト線維芽細胞インターフエロ
ンの試料を、12.5または15％のNaDodSO₄ポリア
クリルアミドゲル上で、トリス／グリシン緩衝液
中で1μｇのタンパク質をこの実験について使用
して実験した。電気泳動後、クーマツシー・ブル
ー（Coomassie blue）で染色すると単一帯が得
られた。同一試料物質を平行ゲル中で実験し、そ
してこのゲルを抗ウイルス活性のためにスライス
した。抗ウイルス活性の最大は染色した帯の中心
と一致した。約20500の分子量は牛の血清アルブ
ミン、チモトリプシン、サイトクロームＣおよび
リボヌクレアーゼを用いて決定した。ヒトの線維
芽細胞インターフエロンの相対的移動度は、メル
カプトエタノールが試料中に存在するか否かにか
かわらず同一であつた。 実施例 ２ ブルー・デキストラン−セフアロース4B樹脂
の調整 50ｇの詰めたセフアロース4Bを１の水で洗
い、そして50mlの蒸留水中に再懸濁させた。15ｇ
の微細な臭化シアンをゆつくりかきまぜた溶液に
加え、そしてPHを直ちに10NのNaOHの滴下によ
り11±0.2に調整し、その値に維持した。温度を
砕氷のわずかの添加により20±５℃に維持した。
反応がしずまつたとき（15〜20分）、約１体積の
氷水を加え、懸濁液をブフナー漏斗に移し、さら
に５体積の0.01NのHClで洗つた。 この活性化された樹脂を、1.00ｇの溶解したブ
ルー・デキストランを含有する。0.4Mの炭酸ナ
トリウム緩衝液（PH9.5）50ml中に直ちに懸濁し、
丸底フラスコ中で４℃において一夜回転した。次
いで、この樹脂を10体積の１モルのNaCl、２体
積の1MのNaClと0.05Mのリン酸ナトリウムを含
有する50％のエチレングリコール（PH7.2）で洗
浄し、50％エチレングリコール中に一夜放置し、
１体積の80％エチレングリコール、および５体積
の５％の子牛血清（MEM）を含有するギブコ
（Gibco）No.11最小必須培地で洗い、この培地中
で50℃において一夜放置した。さらに３体積の
1MのNaClを含有する80％の水性エチレングリコ
ールで、次いで２体積のMEMで洗浄した後、樹
脂をMEM中でスラリーにし、次いで使用のため
カラムに詰める。 アフイニテイー・クロマトグラフイー 1.5の粗製の線維芽細胞インターフエロン
（２×10⁴単位／ml；１mgのタンパク質／ml；比活
性２×10⁴単位／mgのタンパク質）を、0.27体積
の飽和NaCl溶液（約6.3M）と混合した。多孔質
ポリエチレンデイスクを底に備えた50mlのポリプ
ロピレンカラムにブルー・デキストラン−セフア
ロース4B（35ml）を詰め、これに上記の溶液を
100ml／時（20cm／時）の流速でポンプで送入し
た。供給した樹脂を順番に0.05Mのリン酸ナトリ
ウム緩衝液を含有する1MのNaCl（PH7.2）200ml、
0.05Mのリン酸ナトリウムを含有する1Mの
NaCl500ml（PH7.2）、そして75mlのエチレングリ
コールで洗浄し、最後に0.05Mのリン酸ナトリウ
ムを含有する1MのNaCl（PH7.2）500mlと250mlの
エチレングリコールで溶離した。約90％のインタ
ーフエロンは50％のエチレングリコールの前に１
つのピーク中で現われた。溶出した合計のインタ
ーフエロンの50％より多くがが存在するピークの
最大中の比活性は１×10⁷単位／mgであつた。 HPLC (A) ブルー・デキストラン−セフアロース4Bカ
ラム（３×10⁷単位；１×10⁷単位／mgから溶出
したインターフエロンのプールの合計125mlを、
50％のエチレングリコールを含有する1Mの
NaClで前もつて平衡にした4.6×300mmクロメ
ガボンド10μオクチルカラム上に送入した。試
料供給直後に、緩衝剤Ａ（ピリジン／ギ酸／イ
ソプロパノール／ｎ−ブタノール／水、８：
８：20：33：60.7、Ｖ／Ｖ）をカラム上に送入
した。次のプログラムをもつ縦衝剤Ｂ（ピリン
ジ／ギ酸／イソプロパノール／ｎ−プタノー
ル／水、８：８：25：20：39，Ｖ／Ｖ）への勾
配を0.45ml／分の流速で実施した：０〜25％、
30分；25〜55％Ｂ、190分；55〜100％Ｂ、20
分；100％Ｂ、60分。インターフエロンの活性
はフラクシヨン18〜23（各フラクシヨンは1.5ml
の溶出液を含有した）中に見い出される単一の
タンパク質ピークと本質的に一致した。 (B) 上記の実験(A)における装入物のほぼ４分の１
を同じカラムに加え、そして実施例１における
シクロヘキシルカラムに使用した溶離条件を用
いると、インターフエロンの活性はフラクシヨ
ン24〜26に見い出されたタンパク質ピークと一
致することがわかつた。 (C) (A)と同じ装入、勾配プログラムおよび直線流
速、および(B)において使用したと同じＡおよび
Ｂ緩衝剤を用い、そして９分の１の装入／カラ
ム体積を与える9.6×500mmクロメガボンド・オ
クチル・カラムを用いると、より優れた分離性
質が生じた。 (D) 上記実験(A)からの最高の比活性（４×10⁸単
位／mg）を示す材料を、シアノプロプルカラム
でピリジン／ギ酸／水（８：８：84，Ｖ／Ｖ）
および１時間の０〜40％（Ｖ／Ｖ）ｎ−プロパ
ノール勾配を、0.3ml／分を用いて再クロマト
グラフイーすると、対称の主ピークが得られ
る。 NaDodSO₄ポリアクリルアミドゲル電気泳動 方法(A)，(B)よび(C)の試料の実施例１に記載した
と同じ電気泳動は、主帯として20500の分子量帯
を示し、これはゲルをスライスし、評価すると、
活性ピークの中心と一致した、第２の最強の帯
（10500の分子量／合計材料の20〜50％、染色強度
から推定）は、試料ごとに変化し、そして抗ウイ
ルス活性をもつていなかつた。試料をメルカブト
エタノールで処理しないとき、40000の分子量の
帯を観測することができ、これはボーダーライン
の活性を有した。20000の分子量帯および40000の
分子量帯のアミノ酸分析は区別できなかつたが、
10000分子量帯の分析は非常に有意に異なつた。 上記方法(D)からの試料の電気泳動は、単一の帯
を与え、この帯は約20500の分子量と４×10⁸単
位／mgの比活性を有した。この均質なペプチドの
アミノ酸分析を実施し、6NのHCl中の24時間の
加水分解物は、ロイシンについて与えた任意の値
（arbitrary value）の25.0に関して次の値を与え
た：

【表】 実施例 ３ ブルー・デキストラン−セフアロース・アフイ
ニテイー・クロマトグラフイー (a) 19400単位／mlの線維芽細胞インターフエロ
ンを含有する５の培養物の上澄み液を0.3μの
フイルターで過し、次いで275mlの床体積の
ブルー・デキストラン−セフアロースを含有す
るカラムに供給した。この上澄み液を1350mlの
NaCl（6.3M）飽和溶液の添加により1.25Mの
NaClに調整し、このカラム上へ360ml／時の流
速で送る。約４〜６％のインターフエロンは、
カラムにより保持されない貫通流においてカラ
ムを通過させた。 (b) 次いでこのカラムを1300mlの15％（Ｖ／Ｖ）
のエチレングリコール、1MのNaCl、および
0.02Mのリン酸ナトリウム（PH7.2）を含有す
る水溶液で420ml／時の時速で洗浄した、供給
したインターフエロンの約１％が溶離された。 (c) 次いでインターフエロンを50％（Ｖ／Ｖ）の
エチレングリコール、1MのNaClおよび0.02M
のリン酸ナトリウム（PH7.2）を含有する水溶
液で420ml／時の流速で溶離した。少量のイン
ターフエロンはは最初の200mlの溶離剤で溶出
された。カラムへ供給したインターフエロンの
ほとんどは、次の300mlの溶離剤で下表に示す
ように溶離された：

【表】 回収された合計の収率は、114％（検定の変
動性のため）と計算された。 HPLC ブルー・デキストラン−セフアロース・アフイ
ニテイー・カラムからのフラクシヨン２〜６（250
ml；13×10⁷単位；比活性8.12×10⁶単位／mg）
は、9.5×500mmのオクチル結合シリカマトリツク
スのカラム上に４ml／分の流速で送つた。緩衝剤
Ａ（ピリジン／ギ酸／２−プロパノール／ｎ−ブ
タノール／水、８／８／20／2.5／61.5、Ｖ／Ｖ）
を、次いでこのカラムに２ml／分の流速で12分間
送入した。引き続いて次の勾配を緩衝剤Ｂ（ピリ
ジン／ギ酸／２−プロパノール／ｎ−ブタノー
ル／水、８／８／25／25／34、Ｖ／Ｖ）について
1.25ml／分の流速で実施した：０〜20％Ｂ、18
分；20〜29％Ｂ、57分；29％Ｂ、27分間均等
（isocratic）；29〜30％Ｂ、３分間；30〜100％
Ｂ、36分；100％Ｂ、54分。 インターフエロン活性は勾配の均等の領域にお
いて現われ、そして共溶離され、フルオレスカミ
ン監視システムで検出される１つのピークが存在
した。インターフエロンの45×10⁶単位が回収さ
れ（収率35％）、そして２×10⁸単位／mgの比活性
がプール（50ml）について得られた。蓋付きポリ
プロピレンの小ビンに−20℃で２カ月間貯蔵した
後、活性はHPLC工程後前記値の10％に低下し
た。タンパク質は失なわれなかつた。 前記のHPLCカラムからの50mlのプール（比活
性、約0.2×10⁸単位／mg）を、１mlのチオジグリ
コールおよび20mlのｎ−プロパノールと混合し
た。合計4.26×10⁶単位は、この混合物について
の検定において見い出された。これに100mlの0.1
％トリトン（Triton）×−100／0.3％のチオジグ
リコールを加えた。この混合物は5.1×10⁶単位合
計と検定され、前もつてピリジン／ギ酸／水
（８：８：84，Ｖ／Ｖ、緩衝剤Ａ）の混合物で平
衡化した5μ／80Åの4.6×250mmスフエリソルブ
（Spherisorb）CNカラムに、1.5ml／時の流速で
30分間送入する。次の勾配を緩衝Ｂ、ピリジン／
ギ酸／ｎ−プロパノール／水（８：８：50：34，
Ｖ／Ｖ）に対して実施した：０〜25％のＢ、30
分；25〜50％のＢ、210分。インターフエロンの
活性は、ただ１つの観測されたピークと一緒に現
われた。4.2×10⁶単位が３つの１mlのフラクシヨ
ンで回収された（82％）。 第１のシアノカラム上へ供給された合計のタン
パク質の69％表わす上記のプールを、２mlの0.1
％のトリトン×−100と混合し、そして上記で使
用したのと同じシアノカラム上へ送入した。上記
と同じ勾配を、合計の勾配時間の２分の１で実施
した。すべての活性（11.75×10⁶単位；280％の
回収）はただ１つのピークと一緒に溶出した。 第２のシアノカラムからのインターフエロン活
性プールを、緩衝剤ＡからＢ（シアノカラムにつ
いて同じ緩衝剤）への直線の２時間の勾配で前も
つて循環させた、4.6×250mmジフエニル結合シリ
カマトリツクスのカラム上へ送り、そして緩衝剤
Ａで1.5ml／分の流速で平衡化した。 次の勾配を0.5ml／分で実施した：０〜25％の
Ｂ、22分；25〜50％、98分。第２のピークは、勾
配器具が33％の緩衝剤Ｂを示す間溶出し、インタ
ーフエロンの活性プロツトと一致した。合計2.6
×10⁶単位（22％）と40μｇのタンパク質がこのピ
ークと一緒に溶出した。 ジフエニル結合シリカのマトリツクスのカラム
は次のようにして製造した： シリカ担体（10μｍ、10nmの孔大きさ）を6N
のHCl（10：１、Ｖ／Ｗ）中で24時間時々振とう
しながらソーキングした。担体を焼結ガラスフイ
ルター上で水で洗液が中性となるまで洗浄し、次
いでアセトンとメタノールで洗浄して水を除去し
た。一夜真空乾燥した後、担体（10ｇ）を10mlの
ジクロロジフエニルシランを含有する乾燥トルエ
ン（100ml）中で６時間還流した。結合した担体
を焼結ガラスフイルターでトルエン溶液から除去
し、200mlのトルエンで洗つた。次いで、結合し
た担体をソクスレー抽出器内で順次に250mlのト
ルエン、アセトンおよびメタノールで各回８時間
処理し、次いで前述と同じ手順でトリメチルクロ
ロシランで処理した。 結合した担体を、4.6×250mmのステンレス鋼の
カラムに340気圧で、クロロホルム（10.7ml）と
ｎ−ブタノール（2.3ml）との混合物を用いて、
詰めて３ｇ担体を懸濁した。 生ずるインターフエロンのピークの中央フラク
シヨンの試料を、変化する加水分解条件下に、ア
ミノ酸組成について分析した。結果を下に要約す
る。 すべては、酸洗浄飯した排気したガラス管内で
5.7NのHCl中にて加水分解する。試料緩衝剤と
とHClプランクは減ずる。

【表】 ジフエニルカラムの中央ピークフラクシヨンか
らの溶出液を用い、0.02％のチオグリコール酸を
含有する5.7NのNClを用いて、110℃において
６，14および24時間、インターフエロンを加水分
解した後、ヘキソサミンの分析を行うと、線維芽
細胞インターフエロンは約３つのグリコサミン残
基を含有することが示された。ガラクトサミンま
たはマンノサミンは見い出されなかつた。 末端基の定量は、ジフエニルカラムの線維芽細
胞インターフエロンのピークの中央フラクシヨン
の90ピコモルの試料を用いて実施し、そしてＮ−
末端としてMetが検出された。 線維芽細胞と白血球の各150ピコモルの試料を、
トリプシン消化（tryptic digestion）に付した、
消化物をクロマトグラフイーにかけ、そして両方
のインターフエロンに共通するペプチド破片は発
見されなかつた。 均質なヒト線維芽細胞インターフエロンのサン
プルについて測定を行い次のＮ末端部分アミノ酸
配列を得た。 H₂N−Met¹−Ser−Tyr−Asn−Leu⁵−Leu−
Gly−Phe−Leu−Gln¹⁰−Arg−Ser−Ser―Asn
−Phe¹⁵−Gln−……−Gln−Lys¹⁹−……。 実施例 ４ 粗製インターフエロンを、ヒトの線維芽細胞
〔細胞系統（cell line）GM2504A〕から調製し
た。この粗製材料を飽和塩化ナトリウムの添加に
より塩化ナトリウム溶液中で1Mとした。この材
料をブルー・セフアロース−4Bのカラム（ベツ
ド体積20〜25ml、直径2.5cm、2.5ml／分）に通し
た。この粗製材料を装入の間氷上に保持した。装
入後、カラムを250mlの次の溶液（2.5ml／分）で
洗浄した： 30％のエチレングリコール、1MのNaCl、
50mMのNa₂HPO₄（PH7.2）。 最後に、インターフエロンを次の溶液を用い
2.5ml／分の流速で溶離した： 50％のエチレングリコール、1MのNaCl、
50mMのNa₂HPO₄（PH7.2）。 典型的な検定の結果：貫流中５％の活性、30％
の洗浄液中10％の活性、50％の洗浄液中85％
の活性。 第１のブルー・セフアロースのカラムからのビ
ークフラクシヨンを集め、次の溶液で10％のエチ
レングリコールに希釈した： 2MのNaCl、50mMのNa₂HPO₄（PH7.2）。 この材料をブルー・セフアロースのカラム（20
〜25mlのベツド体積、2.5cmの直径、2.5ml／分の
流速）に装入した。それを2MのNaCl、50mMの
Na₂HPO₄（PH7.2）および30％のエチレングリコ
ールを含有する溶液の250mlで洗浄し、そして次
の成分を含有する溶液で溶離した： 2MのNaCl、50mMのNa₂TPO₄（PH7.2）およ
び50％のエチレングリコール。 典型的な検定結果：貫通流中10％の活性、30％
の洗浄液中30％の活性、50％の洗浄液中60％
の活性。 HPLC 試料：使用した第１の試料は、ブルー・セフア
ロースからの50％エチレングリコールのカツトで
あつた。後の試料はブルー・セフアロースに２回
通したものであり、この場合30％または50％のエ
チレングリコールのカツト中のいずれのインター
フエロンも使用できた。 25×0.46cmのリクロソルブ（Lichrosorb）RP
−８のカラムを使用した。このカラムをまず水で
洗浄し、次いでブルー・セフアロースの溶出液を
送入した。５mlの混合室をポンプの前に使用し
た。このHPLCカラムを22ml／時で次のｎ−プロ
パノールの段階的勾配を用いて、1Mのギ酸／
0.8Mのピリジンで維持した4.2の一定PHにおいて
操作した。 ｎ−プロパノール（％） 時間（分） １ ０ 10 ２ 30 40 ３ 32 40 次いで、このカラムを60％のｎ−プロパノール
で洗い、０％で次の実験のために再平衡化した。 インターフエロンは32％の段階の終りにおいて
（80〜90分の間）溶出した。この材料は、
NaDodSO₄アクリルアミドゲル電気泳動し、コ
オマツシー・ブルー（Coomassie Blue）で染色
するか、或いは試料をフルラム（Fluram）で前
もつて標識付けすることによつて決定すると、均
質であつた。 アミノ酸分析（24時間の加水分解、0.2％の
TGA、5.7NのHCl）を、４種の別々の調製物か
らなる９種類の別々の試料について実施した。平
均のアミノ酸組成を下に記載する。値はロイシン
の任意に与えた22.0に関するものである。結果は
次のとおりであつた。：

【表】 ＊ 補正しない値
この実施例および前の実施例において前述した
異なる手順により調製し、そして異なる時間に分
析したいくつかの試料に基づくと、0.2％のチオ
グリコール酸を含む6NのHCl中の24時間の加水
分解物を用いる均質な線維芽細胞インターフエロ
ンについての代表的なアミノ酸分析値（±15％）
は次おとおりである：

【表】 実施例 ５ 均質なヒト線維芽細胞インターフエロンを用い
る非経口投与形態 合計1.5mgの４×10⁸単位／mgの比活性を有する
均質なヒト線維芽細胞インターフエロンを、25ml
の５％の正常のヒト血清アルブミン中に溶かす。
この溶液を細菌学的フイルターに通し、次いで
100個の小ビン中に無菌的に分割する。各小ビン
は非経口的投与に適当な６×10⁶単位の純粋なイ
ンターフエロンを含有する。これらの小ビンは使
用前冷（−20℃）所に貯蔵することが好ましい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 均質な形態であり、 (b) HPLC条件下、炭化水素結合シリカマトリ
   ツクスカラムで単一ピークを示し、 (c) ドデシル硫酸ナトリウムを含まず、 (d) ２−メルカプトエタノールの存在下でのド
   デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動で単一のせまいバンドを示し、 (e) 次のＮ末端部分的アミノ酸配列、H₂N−
   Met¹−Ser−Tyr−Asn−Leu⁵−Leu−Gly−
   Phe−Leu−Gln¹⁰−Arg−Ser−Ser−Asn−
   Phe¹⁵−Gln−……−Gln−Lys¹⁹−……を有
   し、 そして(f)次の工程： Ａ 不純な状態のヒト線維芽細胞インターフエロ
   ンの水溶液をアフイニテイー・クロマトグラフ
   イーのカラムに通してインターフエロンをカラ
   ム上に吸着させ、しかる後インターフエロンを
   カラムから溶離し、そしてインターフエロンを
   溶出液の選んだフラクシヨン中に増大した純度
   の状態で得る； Ｂ 工程Ａにおいて得られた選んだインターフエ
   ロンのフラクシヨンを１または２個以上の緩衝
   平衡化した炭化水素結合シリカマトリツクスカ
   ラムにHPLC条件下で通し、ここで炭化水素は
   シクロヘキシル、フエニル、ジフエニル、オク
   チル、オクタデシルおよびシアノプロピルから
   なる群より選ばれ、これによつてインターフエ
   ロンをカラムに吸着させ、しかる後インターフ
   エロンをカラムから水混和性溶媒の酸性水性緩
   衝混合物の勾配で溶離し、そしてインターフエ
   ロンを溶出液の選んだフラクシヨン中の単一の
   明確なピークとして均質なタンパク質の状態で
   得る；を組合せることからなる方法により得る
   ことができることを特徴とするヒトの線維芽細
   胞インターフエロン。 ２ 次の工程： Ａ 不純な状態のヒトの線維芽細胞インターフエ
   ロンの水溶液をアフイニテイー・クロマトグラ
   フイーのカラムに通してインターフエロンをカ
   ラム上に吸着させ、しかる後インターフエロン
   をカラムから溶離し、そしてインターフエロン
   を溶出液の選んだフラクシヨン中に増大した純
   度の状態で得る； Ｂ 工程Ａにおいて得られた選んだインターフエ
   ロンのフラクシヨンを１または２個以上の緩衝
   平衡化した炭化水素結合シリカマトリツクスカ
   ラムにHPLC条件下で通し、ここで炭化水素は
   シクロヘキシル、フエニル、ジフエニル、オク
   チル、オクタデシルおよびシアノプロピルから
   なる群より選ばれ、これによつてインターフエ
   ロンをカラムに吸着させ、しかる後インターフ
   エロンをカラムから水混和性溶媒の酸性水性緩
   衝混合物の勾配で溶離し、そしてインターフエ
   ロンを溶出液の選んだフラクシヨン中の単一の
   明確なピークとして均質なタンパク質の状態で
   得る；を組合せることからなることを特徴とす
   る、 (a) 均質な形態であり、 (b) HPLC条件下、炭化水素結合シリカマトリ
   ツクスカラムで単一ピークを示し、 (c) ドデシル硫酸ナトリウムを含まず、 (d) ２−メルカプトエタノールの存在下でのド
   デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動で単一のせまいバンドを示し、 (e) 次のＮ末端部分的アミノ酸配列、H₂N−
   Met¹−Ser−Tyr−Asn−Leu⁵−Leu−Gly−
   Phe−Leu−Gln¹⁰−Arg−Ser−Ser―Asn−
   Phe¹⁵−Gln−……−Gln−Lys¹⁹−……を有
   する、 ヒトの線維芽細胞インターフエロンを均質
   なタンパク質として製造する方法。 ３ 炭化水素をシクロヘキシル、フエニル、オク
   チル、オクタデシルおよびシアノプロピルからな
   る群より選択する特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４ アフイニテイー・クロマトグラフイーのカラ
   ムがコンカナバリンＡ−セフアロース
   （Concanavalin−Ａ−Sepharose）カラムであ
   り、HPLCがシクロヘキシル結合シリカマトリツ
   クスのカラム上で溶離剤としてピリジン／ギ酸／
   イソプロパノール／ｎ−ブタノール／水溶液を用
   い、ｎ−ブタノールの濃度を増大しながら実施
   し、次いでシクロヘキシルカラムについてと同じ
   条件を用いて、集めた活性フラクシヨンをオクチ
   ル結合シリカマトリツクスのカラムに通す特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ５ HPLC系における初期の溶離剤組成がピリジ
   ン／ギ酸／イソプロパノール／水（８：８：20：
   64，ｖ／ｖ）であり、そして最後の溶離剤組成が
   ピリジン／ギ酸／イソプロパノール／ｎ−ブタノ
   ール／水（８：８：25：20：39，ｖ／ｖ）である
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ アフイニテイー・クロマトグラフイーのカラ
   ムがブルー・デキストラン−セフアロース
   （Blue Dextran−Sepharose）カラムであり、
   HPLCがオクチル結合シリカマトリツクスのカラ
   ム上で溶離剤としてピリジン／ギ酸／イソプロパ
   ノール／ｎ−ブタノール／水溶液を用い、ｎ−ブ
   タノールの濃度を増加しながら実施する特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ７ HPLC系における初期の溶離剤組成がピリジ
   ン／ギ酸／イソプロパノール／ｎ−ブタノール／
   水（８：８：20：3.3：60.7，ｖ／ｖ）であり、
   そして最後の溶離剤組成がピリジン／ギ酸／イソ
   プロパノール／ｎ−ブタノール／水（８：８：
   25：20：39，ｖ／ｖ）である特許請求の範囲第６
   項記載の方法。 ８ オクチル結合シリカマトリツクスのカラムか
   ら溶離した集めた活性フラクシヨンが、シアノプ
   ロピル結合シリカマトリツクスのカラム上で溶離
   剤としてピリジン／ギ酸／ｎ−プロパノール／水
   溶液を用い、ｎ−プロパノールの濃度を増大しな
   がら再クロマトグラフイーにかける特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 ９ 初期の緩衝剤組成がピリジン／ギ酸／水
   （８：８：84，ｖ／ｖ）であり、そして最後の緩
   衝剤組成がピリジン／ギ酸／ｎ−プロパノール／
   水（８：８：40：44，ｖ／ｖ）である特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １０ HPLCの工程における初期の緩衝剤組成が
   ピリジン／ギ酸／イソプロパノール／水（８：
   ８：20：64，ｖ／ｖ）であり、そして最後の緩衝
   剤組成がピリジン／ギ酸／イソプロパノール／ｎ
   −ブタノール／水（８：８：25：20：39，ｖ／
   ｖ）である特許請求の範囲第６項記載の方法。 １１ シアノプロピル結合シリカマトリツクスの
   カラムから集めた活性フラクシヨンを同カラムに
   ２回目としてもう一度通し、そして第２回目の通
   過から集めた活性フラクシヨンをジフエニル結合
   シリカマトリツクスのカラムに通す特許請求の範
   囲第８項記載の方法。 １２ ヒトの線維芽細胞インターフエロンを血清
   不含調製物から採取し、アフイニテイー・クロマ
   トグラフイーのカラムがブルー・セフアロース
   4Bカラムであり、そしてHPLCがオクチル結合
   シリカマトリツクスで溶離剤としてピリジン／ギ
   酸／水の一定混合物中のｎ−プロパノールの段階
   勾配を用いて実施する特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 １３ ｎ−プロパノールの段階的勾配が10分間０
   ％、40分間30％そして40分間32％からなり、そし
   てインターフエロンを80〜90分の間で溶出する特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。