JPH02218699A - 精製されたプロテインａ組成物及びそれらの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、−船釣に精製されたプロティン八組成物及び
そのような組成物の調製方法に関する。

特に本発明は、アフィニティー精製されたプロティン八
組成物からエンテロトキシン及び他の汚染物を除去する
ための方法に関する。

プロティンＡは、スタフィロコーカス　アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の特定の株
から単離され得、そして遊離ＩｇＧおよらびＩｇＧ−複
合体を結合することができる細胞表面タンパク質である
。

ｒｇｃ−複合体は、患者の血清中において８ｉ環し、そ
して免疫システムの正常な貧食機構により除去されない
抗原−ＩｇＧ複合体である。プロティンＡは典型的には
、適切なスタフィロコー力ス　アウレウス株の細胞壁か
らの抽出により又は好ましくはプロティンＡを分泌する
あるスタフィロコーカス　アウレウス株のならし培地か
らの単離により得られる０両者の場合、プロティンＡは
通常、他のタンパク質及び汚染物からそれを分離するた
めにアフィニティー精製される。たとえば、初めのプロ
ティンＡ調製物は、結合されたヒトＩｇＧを有するアフ
ィニティーカラム（プロティンＡを特異的に結合する）
上を通されるであろう。このカラムは洗浄され、そして
次にその結合されたプロティンＡは？容離される。

プロティンＡは、種々の生物学的サンプルからＩｇＧの
選択的精製に広く使用されて来た。さらに、プロティン
Ａカラムは、最近、特定の癌及び自己免疫疾患の処理に
おいてＩｇＧおよびＩｇＧ含有免疫複合体の治療的除去
のために使用されて来た。そのような処理方法は、多量
の患者の血液の除去、その血液の血漿成分及び細胞成分
への分離及びＩｇＧ及び免疫複合体の除去のためにプロ
ティンＡカラム上での血漿の潅流を必要とする。次に、
その細胞成分及び処理された血漿成分は、患者の免疫応
答を刺激する目的のために、患者中に再注入される。

そのようなプロティンＡ血漿潅流療法は好結果をもたら
して来たが、それらはまた、処理された患者にある毒性
副作用、たとえば、吐気、嘔吐、熱、悪寒及び同様のも
のを誘発することが観察されている。そのような毒性副
作用は、プロティンＡ組成物における汚染物質、特にス
タフィロコーカスのエンテロトキシンの存在に起因し、
そしてその汚染物質は治療の間、患者の血漿中に吸着性
カラムから浸出することができる。

直接的な免疫システム刺激剤としてのプロティンへの使
用はまた、腫瘍担持動物中へのプロティンＡの注入によ
り調べられて来た。抗−腫瘍効果が観察されたが、相当
な毒性反応もまた報告されている。そのような毒性反応
は、プロティンＡにおけるエンテロトキシン及び他の汚
染物の存在に起因するように思われる。

従って、精製されたプロティンＡ組成物及びそのような
組成物の調製方法を提供することが所望される。特に、
スタフィロコーカスのエンテロトキシン及び他のタンパ
ク質性汚染物を実質的に含まないプロティンＡ組成物を
供給することが所望される。

〔技術的背景〕

種々の報告が、スタフィロコーカスのプロティンＡｔ１
ｉ製物は微量のスタフィロコーカスのエンテロトキシン
により汚染され得ることを指摘して来た（Ｓａｔ　ｔｈ
など、（１９８３）Ｊ、Ｉｍｕｎｏｌ、、　１３０　：
　７７３５Ｃａｒｌａｓｏｎ　（１９８４）　Ｃｅ１１
．Ｉ＋ｕ＋＋ｕｎｏ１．、８６　：　１３６　；５ｃｈ
ｒｅｚｅｒｖｅｉｅｒ　（１９Ｂ？）　Ｊ、Ｉ＋＋＋ｎ
＋ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１０５：１３３］　、
プロティンＡのインターフェロン誘導能力がエンテロト
キシンの存在に由来することが最近示唆されている（Ｃ
ａｒｌｓｓｏｎなど、　、前記）。さらに、エンテロト
キシンはひじょうにを力なマイトジェンであるので、プ
ロティンＡにより観察されるマイトジェン効果は、事実
、エンテロトキシンによる汚染のためであることが示唆
されている（Ｓｃｈｒｅｚｅｎｌｌｅｉｅｒなど、＋Ｍ
）ａ　イオン交換のクロマトグラフィーは、タンパク質
を分離するための既知の技法である。たとえば、Ｈｕｄ
ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈａｇ。

Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｉ＋ｍｍｕｎｏｌ。

ｔｉｆｉｃ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ＋ページを参
照のこと。

、第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎ−Ｏｘｆｏ
ｒｄ、１９８０．１６９　〜１７５〔発明の要約〕 ひじょうに低レベル、典型的には約１０重量％以下、通
常約５重量％以下、及び好ましくは約２重量％以下、よ
り好ましくは約１重量％以下の微量汚染物を有するプロ
ティンＡ組成物が調製される。

特にその組成物は、アフィニティー精製されたプロティ
ンＡ調製物に存在することが見出されている、スタフィ
ロコーカスのエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）及びいくつ
かの他の低分子量（５０ＫＯ以下）のタンパク質性汚染
物を実質的に含まない。好ましくは、本発明のプロティ
ンＡｔ−１１成物は、約ｏ、ｏｏｉ重量％以下、より好
ましくは約０．０００５重量％以下、及び最っとも好ま
しくは約０．００００１重量％以下のＳＥＢを有するで
あろう。

本発明の方法においては、プロティンＡは、アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより天然源、たとえば酵素に
より消化されたスタフィロコー力ス　アウレウス又はス
タフィロコーカス　アウレウス細胞培養物からのならし
培地から得られる。

次に、そのアフィニティー精製されたプロティンＡは、
アニオン交換物質へのプロティンＡ及びＳＥＢ並びにタ
ンパク質性汚染物の結合をもたらす条件下でそのアニオ
ン交換物質と接触せしめられる。次にＳＥＢ及びタンパ
ク質性汚染物が、適切な低いイオン強度の緩衝液により
そのアニオン交換物質から選択的に溶離される。プロテ
ィンＡは、より高いイオン強度の緩衝液により分離的に
溶離され、本発明の高純度のプロティンＡ組成物をもた
らす。

〔特定の態様の記載〕

プロティンＡは、プロティンＡを産生ずる実質的にすべ
てのスタフィロコーカス種、特にスタフィロコーカス　
アウレウスの株、たとえばＳ、アウレウスＣｏｗａｎ　
［から得られる。

使用されるスタフィロコーカス株に依存して、プロティ
ンＡは、細胞壁に固定されたまま存続し、又は細胞増殖
の間、その増殖培地中に分泌されるであろう０分泌しな
い菌株に関しては、プロティンＡは、そのプロティンを
放出するが、但し分解しない条件下で細胞壁の酵素消化
により回収される。次に、その消化された細胞成分は、
従来の技法により、より詳しく下記に説明されるように
、適切なアフィニティーカラムに適用され得る。非分泌
性スタフィロコーカス株からプロティンＡをアフィニテ
ィー精製するための特別な方法は、５ｊｏｑｕｉｓｔな
ど、（１９７２）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　
２Ｊ　：　５７２に記載される。増殖培地中にプロティ
ンＡを分泌する菌株に関しては、そのならし培地が、プ
ロティンＡの除去のためにアフィニティーカラムに直接
適用され得る。そのような菌株からのプロティンＡの回
収法は、Ｌｉｎｄａ＋ａｒｋなど、（１９７７）　Ｂｕ
ｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　７４　：　６２に詳しく説明され
る。−船釣に、増殖培地中にプロティンＡを分泌するス
タフィロコーカス株を用いることが好ましいであろう。

便利には、プロティンＡを分泌するスタフィロコーカス
株のならし培地は、その分泌されたプロティンＡを結合
するためにアフィニティーカラム上に通される０次に、
そのアフィニティーカラムは、非特異的に結合されたプ
ロティンを除去するために、典型的には緩衝液、たとえ
ば約７〜８のｐＨでのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ　）によ
り集中的に洗浄されるであろう。そのカラムは、プロテ
ィンがもはや開放されなくなるまで洗浄されるであろう
。

次に、プロティンＡが、適切な緩衝液、たとえば約３の
ｐＨでの０．１Ｍのグリシン／ＨＣＩ緩衝液を用いてそ
のカラムから溶離され得る。次にその溶離されたプロテ
ィンは集められ、そして典型的には、たとえばｌ０ＫＯ
をカットオフする分子篩を用いて濃縮され得る。

プロティンＡの初期精製段階に使用するために適切なア
フィニティーカラムは、プロティンＡを特異的に結合で
きるいづれかの受容体を含むことができる０種々の他の
受容体、たとえば抗−プロチインＡ抗体もまた、使用さ
れ得るけれども、その受容体は普通１ｇＧ　、より普通
にはヒトＩｇＧであろう。その受容体は、適切な固相支
持体、典型的には不連続粒子、たとえばアガロースビー
ズ、粒状シリカ、デキストラン及び同様のものに共有結
合されるであろう。Ａｘｅｎなと、（１９６７）Ｎａｔ
ｕｒｅ　２１４：　１３０２に記載されるように、臭化
シアン結合により調製されるヒトＴｇＧ−アガロースマ
トリックスが特に適切である。

適切なアフィニティー精製されたプロティンＡはまた、
種々の市販源、たとえばＰｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ
、。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　；　
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　；　Ｂｉｏ−
Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋Ｉｎｃ、＋　ｔｌ
ｅｒｃａｌｅｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｓ　；及びＣａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍＢｔｏｃｈｅｍｔｃａｌｓ、　Ｓａｎ
　Ｄｔｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａからも得られる
。

上記のようにして得られるアフィニティー精製されたプ
ロティンＡは、相当なレベルのタンパク質性汚染物、た
とえばスタフィロコーカスのエンテロトキシン、特にス
タフィロコーカスのエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）及び
いくつかの他の低分子量（５０ＫＤ以下）のスタフィロ
コーカスのタンパク質を含むことが見出された。そのア
フィニティー精製されたプロティンＡ調製物における汚
染性スタフィロコーカスのタンパク質の存在の原因は、
現在知られていない。そのような微量汚染は、プロティ
ンＡを単離するために使用されるＩｇＧアフィニティー
カラムへのタンパク質の非特異的吸着に起因するかも知
れない。他方、そのタンパク質に比べて少量のヒト抗体
が、アフィニティー支持マトリックスに結合されるＩｇ
Ｇ　１１製物に存在するかも知れない、いずれにせよ、
本発明のプロティンＡ組成物からこれらの汚染物を除去
することが必要である。

ＳＥＢ及び他のタンパク質性汚染物は、アフィニティー
精製されたプロティンＡ調製物と適切なアニオンイオン
交換物質とを接触せしめることによってその調製物から
除去される。そのようなイオン交換物質は一般的に、そ
れらに結合される塩基性（アニオン交換）基を有する支
持マトリックスを含んで成る。アフィニティー精製され
たプロティンＡは、カラムマトリックス上のアニオン基
とタンパク買上のアニオン官能価との間に交換をもたら
す条件下でカラムに適用され、そこでタンパク質、たと
えばプロティンＡ、ＳＥＢ及び他のタンパク質性汚染物
のカラムマトリックスへの結合がもたらされる０次に、
溶出緩衝液がそのカラムに適用され、そして緩衝液のイ
オン強度及びｐＨを変えることによって、種々のタンパ
ク質がマトリックスから選択的に除去される。ＳＥＢ及
び他の低分子量のタンパク質性汚染物は低いアニオン強
度の緩衝液により選択的に溶離され、そしてプロティン
Ａはより高いイオン強度の緩衝液により除去され、それ
によりプロティンＡから汚染物の高い選択的な分離をも
たらすことが見出された。

種々のアニオン交ｍ’ｓ質が使用され得る。たとえばジ
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）を組込む、アニオン官
能価を有する交換マトリックスの使用が好ましい。適切
なマトリックスは、セルロース、アクリルアミド、シリ
カゲル及び同様のものを包含する。ＤＥＡＥマトリック
スは、タンパク質が安定するイオン強度及びｐｌｌ、す
なわち約０．００１〜０．００５Ｍの；ＮａＣｌの１イ
オン強度及び約６．５〜８．５の範囲の９Ｈの条件下で
プロティンＡ及がタンパク質性汚染物の結合を可能にす
る。適切なりＥＡＢ−セルロースカラムは、Ｗｈａｔｍ
ａｎ、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙの業
者から入手できる。

アフィニティー精製されたプロティンＡ調製物は、次の
ようにしてＤＥＡＩＥカラムに適用され得る。

カラムはまず洗浄され、そして水により平衡化される。

アフィニティー精製された調製物が水に対して透析され
、そして塩の実質的な不在下で（たとえば約０．００１
Ｍ以下のＮａＣｌ！　、好ましくは約０．００１Ｍ以下
のＮａＣｌ）及び約６．５〜８．５の範囲のｐＨでカラ
ムに適用される。そのような条件下で、プロティンＡ及
びタンパク質性汚染物がカラムマトリックスに結合され
るであろう。

プロティンＡ及びタンパク質性汚染物の結合の後、その
汚染物（ＳＥＢを含む）は、低いイオン強度の緩衝液、
典型的にはリン酸緩衝液中、約ｏ、ｏｏｔ〜０．００５
ＭのＮａＣｌにより、約６．５〜８．５のｐ）Ｉで溶離
される。その汚染物が除去された後、プロティンＡは、
より高いイオン強度の緩衝液、典型的にはリン酸緩衝液
中、０．０５〜０．５ＭのＮａＣｌを用いて、約６．５
〜８．５の範囲のｐＨで開放され、そして別々に集めら
れる。

次に、イオン交換カラムから回収されたプロティンＡは
濃縮され、そして直接使用されるか又は保存のために凍
結乾燥される。

次の例は、例示的であって、制限するものではない。

〔実　験〕

一佳桂皮堕方法 １、　固定されたヒト■ｇＧを有するアフィニティーク
ロマトグラフィーを用いてのプロティンＡの単離 プロティンＡを、前記（Ａｘｅｎなど、（１９６７）Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２１４　：　１３０２）のようにして臭
化シアンを用いて５ｅｐｈａｒｏｓｅ０４Ｂ（Ｓｉｇｍ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（：ｏｒｐ、。

ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ＋旧）に精製されたヒトＩｇＧ　（Ｓ
ｉｇ＋ｗａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、＋　Ｓｔ、Ｌ
ｏｕｉｓ＋　Ｍｌ）を共有結合することによって調製さ
れたアフィニティーマトリックスを用いて、プロティン
Ａを増殖培地中に分泌するスタフィロコーカス株の発酵
ブイヨンから単離した。その発酵ブイヨンをアフィニテ
ィーカラム上に通し、分泌されたプロティンＡを結合し
、そしてそのアフィニティーマトリックスを、プロティ
ンＡがそのアフィニティーカラムからもはや開放されな
くなるまで、０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液（ｐｆ１７．
５）により洗浄した。次に、結合されたプロティンＡを
０．１Ｍのグリシン／ＨＣｊ！　　（ｐＨ３，０）によ
り溶離し、そしてその溶離されたプロティンＡをミリボ
ア膜（１０，０００の分子量をカットオフする）濃縮シ
ステムを用いて濃縮した。その濃縮物中のプロティン含
有率を、前に記載した（Ｓｊｏｑｕｔｓｔなど、（１９
７２）ｆ！ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２９　：　
５７２　）ようにして、２７５ｎａ＋で及び１．６５の
消衰係数での吸光度により決定した。

２、　スタフィロコーカスのエンテロトキシンＢ（ＳＥ
Ｂ）の検出のためのＥＬＩＳＡ Ｅ！ＬＩＳＡ技法を用いて、流体相中におけるＳＥＢの
存在を検出した。０，１０．２５及び５ＱｎｇのＳＥＢ
／ｄの一連の標準５ＥＢＩ度が、５１ｇｌ１＋ａ　Ｃｈ
ｅａ＋１ｃａｌＣｏｒｐ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｆｓ＋　Ｍｌ
）から得られたＳＥＢの対照調製物を、０．０１Ｍのリ
ン酸緩衝液を含む０．００５ＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ７
，５）により希釈することによって調製された。　　Ｅ
ＬＩＳＡのために、２００　Ｉｔｌのそれぞれの標準及
び実験サンプル溶液を、ＰｒｏｂｉｎｄＡｓｓａｙマイ
クロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎＬａｂｗａｒｅ＋　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ＋　
ＮＪ）に、２通り添加した。

それらのサンプルをマイクロタイターウェル中で３０分
間２５℃でインキュベートした。すべてのウェルを、０
．ＯＩＭのリン酸緩衝液中、１％ウシ血清アルブミン（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｔｃａｌｓ＋　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ
＋　Ｍｌ）の溶液（ｐＨ７，５，ＢＳＡ／ＰＢＳ）　２
５０ｍニより３度洗浄した。洗浄の後、ウサギ抗−５Ｅ
Ｂ　ＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントＬＯｎ
を含むＢＳＡ／ＰＢＳ２００ｄをそれぞれのウェルに添
加し、そして２５℃で３０分間インキュベートした。イ
ンキュベーションの後、すべてのウェルを３度洗浄し、
そしてヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体のペルオキシダーゼ接
合のＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントのｉ　１５００　ｍ
釈溶液２００ｕ１をそれぞれのウェルに添加した。すべ
てのウェルを、２５℃で３０分間インキュベートした。

インキュベーションの後、すべてのウェルをＢＳＡ／Ｐ
ＢＳ２５０１ｔ！により３度洗浄した。洗浄の後、基１
ｉ　２００ｍをそれぞれのウェルに添加し、そして２５
℃でインキュベートした。

適切な色が進行した後、その反応を、もう１つのＰｒｏ
Ｂｉｎｄアッセイブレートにそれぞれのウェルから１５
０ｔｌｌを移すことによって停止した。４９２ｎｓでの
光学密度読みをＥＬＩＳＡリーダーで決定し、そしてＳ
ＥＢ標準溶液の既知濃度に対するその光学密度読みに関
する標準曲線を展開した。この標準曲線から、実験サン
プルの濃度を決定した。典型的には、そのアッセイの感
度は１０遁であり、そして標準曲線の相関係数は０．９
５０〜０．９９０であった。

３、　プロティンＡ１１ｌ製物の高圧液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）分析 アフィニティー精製されたプロティンＡ１１ｌ製物を、
次のようにしてＨＰＬＣ分析により均質性及び純度につ
いて分析した。プロティンＡ調製物を、分析の前、水（
プロティンＡ及びＳＢＨの両者は水に可溶性である）に
対して透析した。プロティンＡのサンプル（２００ａｒ
）を、０．ＯＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３，５）と共に
混合し、そして０．ＯＩＭのリン酸緩衝液（ｐ）１３．
５）により平衡化された３００錦分子分別ＨＰＬＣカラ
ム（Ｗａｔｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ。

バ１ｌｆｏｒｄ　ＭＡ）中に注入した。ｐＨ３が用いら
れた。

なぜならば、このｐＨは、シリカ基材のＨＰＬＣマトリ
ックスとプロティンとの間の非特異的吸着性質を減じる
ことによってプロティンＡ及びＳＥＢ調製物の最大の分
解能及び分離を付与することが観察されたからである。

サンプルを０．５ｄ／分の流速でＨＰ　ｌ、Ｃカラムを
通し、そして画分１．０　ｄを集め、そしてすぐにｐＨ
７，０〜７．５に中和した。　）ＩＰＬＣカラムを通さ
れたサンプルをまた、液体クロマトグラフィー分光光度
計（Ｗａｔｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ＋Ｍｉｌｆｏｒｄ　ＭＡ）を用いて２８０
ｎｍで吸着性質について分析し、そして種々のプロティ
ンビーク下の領域を決定し、ＨｅｗｌｅＬＬ　Ｐａｃｋ
ａｒｄ　３３９２Ａ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ（Ｈｅｗｌ
ｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏ＋＊ｐａｎｙ、　Ａｖｏ
ｎｄａｌｅ、　ＰＡ）を用いてその純度を評価した。

４、　　ＤＨＡｌｌ！−セルロースイオン交換クロマト
グラフィー ５ｅｏｐｈａｒｏｓｅ＠　４Ｂに共有結合されるヒトＩ
ｇＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより
単離されたプロティンＡ調製物を、ＤＥＡＥ−セルロー
ス（ジエチルアミノエチル−セルロース）イオン交換カ
ラム（Ｗｈａｔｍａｎ、　ＤＥ５２．Ｃ１１ｆｔｏｎ、
　ＮＪ）上への通過によりさらに処理した。ＤＥＡＥ−
セルロースがおよそ５０ｒＲ１のベツド体積のカラム（
直径３１×長さ１３ｃｍ）中に充填された。カラムを広
範囲に洗浄し、そして水により平衡化した。上記のよう
にしてアフィニティークロマトグラフィーにより単離さ
れ、そして水に対して透析されたプロティンＡのサンプ
ル１００ｍｇを、そのＤＥＡＥ〜セルロースカラムに適
用した６次に画分２００ｄを、しだいに高まるイオン強
度の緩衝液システムを用いて集めた。

プロティンへの適用後すぐに、画分２００ｄを、０、Ｏ
ＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）中、０．００５Ｍの
ＮａＣｌ溶液による溶離により集めた。次に２番目の画
分２００−を、０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
’）中、０．０５ＭのＮａＣｌ溶液による溶離により集
めた。

次に最終画分２００ｄを、０．０１　Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）中、０．５ＭのＮａＣｌ溶液による溶離
により集めた。それぞれの画分中のプロティン含有率を
、Ｌｏｗｒｙなど、（１９５１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、１９３　：　２６５の方法により決定し、そして水
に対する透析の後、それぞれの画分中のＳＥＢ含有率を
、上記ＥＬＩＳＡ技法を用いて決定した。さらに、水に
対する透析の後、すべてのサンプルを凍結乾燥により濃
縮した。

５、　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）イ
オン交換クロマトグラフィーにより単離されたプロティ
ンの分析のために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）
　ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２２７　：６８０の緩衝液システムを用いて７．
５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける還元条
件下で行なった。サンプルを、その最終溶液が５Ｍの尿
素、２％（重量／体積）のＳＤＳ、５％（重量／体積）
の２−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェ
ノールブルーを含むように緩衝液と共に混合し、そして
ゲルへの適用の前、１００℃で１分間加熱した。電気泳
動及びクーマシーブリリアントブルーによる染色の後、
ゲルレーンを、自動スキャンゲルデンシトメーター（Ｈ
ｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕ−ｍ
ｅｎｔｓ＋　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ＋　（＾）に
より走査した。

１、プロティンＡ調製物中における微量のＳＥＢの検出 ＳＥＢが、アフィニティークロマトグラフィーにより単
離されたプロティンＡから分離され、そしてその分離後
、検出され得るかどうかを決定するために、アフィニテ
ィー精製されたプロティンＡサンプル（２００ｘ　）を
、上記のようにしてｆ（ＰＩ、Ｃ分析にゆだねた。対照
調製物を、既知量のＳＥＢによる汚染により調製した。

ＳＥＢからのプロティンＡの分離は、材料及び方法に記
載される条件下で明白であることが見出された。プロテ
ィンＡ及びＳＥＢの既知混合物の代表的なＩＩＰＬｃプ
ロフィールは、第１表に示される。

ＳＥＢを含むと思われる肝ＬＣ画分をプールし、そして
４ＮのＮａＯＨの急速な添加により中和し、ｐＨを７．
５にした。中和の後、そのプールされた画分を、ＳＥＢ
の存在及び量について上記ＥＬＩＳＡ技法により分析し
た。ＳＥＢ汚染は、０．０１８％〜０．１３８％の範囲
で、種々のアフィニティー単離されたプロティンＡサン
プルに見出された。その結果は、第１表に要約されてい
る。

１　　　　　　　１５２．１ ２　　　　　　　３５．１ ３　　　　　　　４０．５ ４　　　　　　　１４９．４ ５　　　　　　　２７６．３ ６　　　　　　１３２．３ 合計をｎｇで表わす。

０．０７６％ ０、０１８％ ０．０２０％ ０．０７５％ ０．１３８％ ０．０６６％ ２、　プロティンＡ調製物から微量のＳＥＢの除去 アフィニティー精製されたプロティンＡサンプルから微
量のＳＥＢ及び他の汚染タンパク質を除去するためには
、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー
が使用される。アフィニティー精製されたプロティンＡ
！Ｐｉ製物を水に対して透析し、そして水により平衡化
されたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラムに適用し
た。材料及び方法に記載されているように、イオン交換
マトリックスに結合されたタンパク質を、０．ＯＩＭの
リン酸緩衝液（ｐ１１７．５）中、０．００５Ｍ　、　
０．０５Ｍ及び０．５　ＭのＮａＣｌ溶液により連続的
に溶離した。溶離の後、それぞれの画分中のタンパク賞
含有量を決定し、そしてそれぞれの画分を、上記ＥＬＩ
ＳＡ技法を用いてＳＥＢの存在について評価した。第２
図に示されるように、少量の合計タンパク質（空白の棒
グラフ）が０．００５ＭのＮａｃｅ　’ｆｉｌ出液に検
出され；ところがほとんどのタンパク質は０．０５Ｍ及
び０．５０ＭのＮａＣｌ溶出液中に検出された。対照的
に、ＳＥＢ（斜線の棒グラフ）は０．００５ＭのＮａＣ
ｌ溶出液中に卓越的に溶出され、そしてこれは単に少量
の合計タンパク質を含むに過ぎなかった。これらの結果
は、アフィニティー精製されたプロティンＡ調製物中の
汚染ＳＥＢがＤＥＡＥ−セルロースを通してのプロティ
ンＡ調製物の通過及び低いイオン強度の緩衝液による溶
出により除去され得ることを示唆すする。

３、　イオン交換クロマトグラフィー処理後のＳＥＢ及
びプロティンＡの特徴化 ＤＥＡＥ−セルロースカラムから溶離されたそれぞれの
画分を一７０℃で凍結し、そして凍結乾燥により濃縮し
た。凍結乾燥後、それぞれの画分を水中に再水和化し、
そして４°Ｃで水に対して透析した。

透析後、それぞれの画分中のタンパク賞金存置を上記の
ようにして測定した。　０．０５Ｍ及び０．５ＭのＮａ
Ｃｌ溶出液中に存在するプロティンＡの純度を評価する
ために、それぞれの画分をＨＰＬＣ分析にゆだね、そし
てプロティンＡのピークの面積を上記のように統合し、
そして％純度につい分析した。

第２表に示されるように、イオン交換クロマトグラフィ
ー処理の前、プロティンＡ調製物に関して、０．０５Ｍ
のＭａｃｌ溶出画分は、最高度の純度を示すことを観察
された。

次に、０．００５ＭのＮａＣｊ！溶出画分中に含まれる
ＳＥＢを特徴づけるために、追加の研究を行なった。第
３図に示されるように、０．００５ＭのＮａＣ（１溶出
画分のＰＡＧＥ分析は、２５に〜４５にの分子量の範囲
の一連のポリペプチドを示した。さらに、上記のような
ＥＬＩＳＡ技法により確認される場合、存在する最っと
も有力なポリペプチドはＳＥＢに相当した。

男−」し−表 ９８％ ９５％ ９３％ ９５％ ９９％ ９０％ ９４　％ １００％ １００％ ９５％ １００％ ９９％ ９６％ ９６％ ９９％ ８６％ ９９％ ９２％ ９８％ ９７％ ９７％ Ｙ＝９５％ Ｔ＝９８％ Ｙ＝９６％ 前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾および変更を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブロテ、インＡ及びＳＥＢの分離を示す代表
的なＩ（ＰＬＣプロフィールであり；第２図は、異なっ
たイオン強度を有する緩衝液によＪ）　ＤＥＡＥ−セル
ロースカラムから溶離された合計タンパク質（主にプロ
ティンＡ）及びＳＥＢの代表的な量を示す棒グラフであ
り：そして第３図は、０．００５ＭのＮａＣｌ溶液によ
りＤＥＡＥセルロースイオン交換カラムから溶離された
ＳＥＢ画分の代表的なＰＡＧＥ分析であり、そして卓越
したＳＥＢピーク及びいくつかの低いピークを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、９５重量％以上の純度を有し、そしてエンテロトキ
   シンＢを実質的に含まないプロテインＡ組成物。 ２、０．００１重量％以下のエンテロトキシンＢを有す
   るプロテインＡ組成物。 ３、アフィニティー精製されたプロテインＡ調製物から
   タンパク質性汚染物を分離するための方法であって、 プロテインＡ及びタンパク質性汚染物をアニオン交換物
   質に結合せしめるために、選択されたイオン強度及びｐ
   Ｈの条件下で前記アフィニティー精製されたプロテイン
   Ａ調製物とアニオン交換物質とを接触せしめ； 前記アニオン交換物質からプロテインＡ及びタンパク質
   性汚染物、たとえばエンテロトキシンＢを種々の画分に
   選択的に溶離し；そして 卓越的にプロテインＡから成る画分を集めることを含ん
   で成る方法。 ４、前記アニオン交換物質がＤＥＡＥ−セルロースであ
   る請求項３記載の方法。 ５、前記ＤＥＡＥ−セルロースがカラム中に存在し、そ
   して前記アフィニティー精製されたプロテインＡ調製物
   をそのカラムに通用することにより接触せしめる請求項
   ４記載の方法。 ６、前記接触を、塩の実質的な不在下で及び約６．５〜
   ８．５の範囲のｐＨで行なう請求項５記載の方法。 ７、エンテロトキシンＢを含む前記タンパク質性汚染物
   を、０．００１〜０．００５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ
   ６．５〜８．５）により溶離し、そして前記プロテイン
   Ａを０．０５〜０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５
   〜８．５）により溶離する請求項６記載の方法。 ８、タンパク質性汚染物を実質的に含まないプロテイン
   Ａ組成物を調製するための方法であって、プロテインＡ
   に対して特異的な固定された受容体と精製されていない
   プロテインＡ調製物とを接触せしめ、それによってプロ
   テインＡをその受容体に結合せしめ； アフィニティー精製されたプロテインＡ調製物を形成す
   るために前記受容体からプロテインＡを開放し； プロテインＡ及びタンパク質性汚染物をアニオン交換樹
   脂に結合せしめるために選択されたイオン強度及びｐＨ
   の条件下で前記アフィニティー精製されたプロテインＡ
   調製物と前記アニオン交換物質とを接触せしめ； 前記アニオン交換物質からプロテインＡ及びタンパク質
   性汚染物を種々の画分に選択的に溶離し；そして 卓越的にプロテインＡから成る画分を集めることを含ん
   で成る方法。 ９、前記プロテインＡのための固定された受容体がヒト
   ＩｇＧである請求項８記載の方法。 １０、前記ヒトＩｇＧがアガロースに結合され、そして
   カラム中に含まれ、前記精製されていないプロテインＡ
   調製物がそのカラムを通過せしめられる請求項９記載の
   方法。 １１、前記プロテインＡを、０．１Ｍのグリシン／ＨＣ
   ｌ（ｐＨ３．０）による溶離によりヒトＩｇＧ−アガロ
   ースカラムから開放する請求項１０記載の方法。 １２、前記開放されたプロテインＡを、アニオン交換物
   質と接触せしめる前、濃縮する請求項８記載の方法。 １３、前記アニオン交換物質がＤＥＡＥ−セルロースで
   ある請求項８記載の方法。 １４、前記ＤＥＡＥ−セルロースがカラム中に存在し、
   そして前記アフィニティー精製されたプロテインＡ調製
   物をそのカラムへの適用により接触せしめる請求項１３
   記載の方法。 １５、前記接触を、塩の実質的な不在下で及び約６．５
   〜８．５の範囲のｐＨで行なう請求項１４記載の方法。 １６、前記タンパク質性汚染物を０．００１〜０．００
   ５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５〜８．５）により溶
   離し、そして前記プロテインＡを０．０５〜０．５Ｍの
   ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５〜８．５）により溶離する
   請求項１５記載の方法。