JPS62253396A - アフイニテイ・クロマトグラフイ−材料及びこれを用いてのボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアフィニティ・クロマトグラフィーの材
料及びその応用とくにボルデテラ−（Ｂｏｒｄ−ｅｔｅ
ｌｌａ）属細菌の蛋白質抗原の分離及び精製への応用に
関する。

ボルデテラ属細菌たとえば百日咳菌（ボルデテラ　パー
タラシスＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ■ｒｔｕｓｓｉｓ）バラ
百日咳菌（ボルデテラ　バラバータラシスＢｏｒｄａｔ
ｅ−１１ａ　　ａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及び気管支
敗血症菌（ボルデテラ　ブロンキセブチカＢｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉ■口１ｃａ）の培養によりＦ
−ＨＡプロティン（糸状血液凝集素Ｆｉｌａｍｅｎｔｏ
ｕｓ　ｈｅ＋＊ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を産生できるこ
とは公知である。そのうえ百日咳菌の培養で同様に蛋白
質外毒素：百日咳菌毒素またＬＰＦ又はＬＰＦ−ＨＡ　
（白血球増多症促進因子−血液凝集素Ｌｅｕｋｏｃｙｔ
ｏｓｉｓ　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　）Ｉｅ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）とも呼ばれる外毒素も産生で
きる。これらの蛋白質は百日咳に対する無細胞ワクチン
調製に主として使用できる。

ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の分離及び精製は良好な
収率をもって精製抗原を得るためには解決するのが困難
な技術的問題を生ずる。

一般に、精製操作の際にはアフイニテイ・クロマトグラ
フィーの技法が用いられる。

英国特許出願第２０１５５３１号明細書にはシアロブロ
チイン又はシアル酸に富んだ他の物質が固定してある不
溶性ポリマー担体を用いるアフイニテイ・クロマトグラ
フィー法の使用が推奨してある。

シアロブロチインは百日咳菌毒素を選択的に固定でき次
いでこれを溶離できる。

欧州特許出願第０１４０３８６号明細書には百日咳菌毒
素選択性リガンドとして熱変性したセルロプラ不ミンを
用いるクロマトグラフィー法が記述してある。

今回意外なことに、以下に示すとおり、百日咳菌毒素は
シアロブロチインによりも担体上に固定した脱シアル化
した（ｄｅｓｉａｌｙｌｅｄ）グリコプロティンに一層
の親和力があることが見出された。この結果は百日咳菌
毒素が、担体上に固定された場合にはフェチュインの方
がアシアロフェチュインの固定よりも１２５■で標識し
たフェチュインの固定を抑止する（フェチュインに比べ
て僅か９３％の抑止：　Ｒ，Ｄ、　５ｅｋｕｒａらのＰ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ　ＴｏｘｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ　
Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　
１ｎｔｅｒａｃ−ｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌｓ　”
　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｅｒｔｕ
ｓ−ｓｉｓ　Ｔｏｘｉｎ　ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、　Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ、　５ｅｐｔ、　２０−２１’１９８４
　、Ｒ，Ｄ、　５ｅｋｕｒａ、　Ｊ、　Ｍｏ５ｓ　＆　
Ｍ、　Ｖａｕｇｈａｎ編（１９８５）Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、ｌ　ｐ、　４５−６４参照）ことが観察
されているので尚一層意外である。

本発明は百日咳菌毒素用アフィニテイ・クロマトグラフ
ィー・リガンドとして脱シアル化グリコプロティンに関
する。脱シアル化グリコプロティンは、とくに脱シアル
化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビンのうちか
ら選ぶことができる。

フェチュイン及びハプトグロビンがシアル化したオリゴ
配糖体基を含んでいることは公知である：たとえばＪ、
υ、　Ｂａｅｎｚｉｇｅｒらのｔｈｅ　Ｊｏｎｒｎａｌ
　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５
４、Ｎｏ３、ｐｐ、７８９−７９５　（１９７９）及び
Ｂ、Ｎｉ１ｓｓｏｎらのＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　
　ＶＩ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙ＋＋ｐｏｓ
ｉｕａ＋　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ−ｕｇａｔｅｓ（
１９８１）Ｉ）ｐ、　２７５−２７６参照。

公知の方法によりフェチュイン又はハプトグロビンを酸
加水分解するとシアル化した配糖体構造を対応の脱シア
ル化配糖体構造に転化させこうしてアシアロ−フェチュ
イン又はアシアロ−ハプトグロビンが得られる。

フェチュイン及びハプトグロビンは主としてＳＩＧＭＡ
社から市販された工業製品である。

本発明はまた百日咳菌毒素について親和力のあるリガン
ドが固定してある固体担体により構成された新規なアフ
ィニティ・クロマトグラフィー材料であって該リガンド
が脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビ
ンよりなる群から選ばれた脱シアル化プロティンである
ことを特徴とするクロマトグラフィー材料にも関する。

これらの蛋白質は固体担体との結合に先立って又は場合
によってはその後に脱シアル化処理を施こす。この脱シ
アル化処理は公知の諸方法に従って温和な加水分解によ
り行なわれる：たとえばＲ，Ｇ、５ＰＩＲＯらの、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　（１９７４）　　２４９−。

５７０４−５７１７参照。

脱シアル化プロティンを結合させる固体担体にはアフィ
ニティ・クロマトグラフィーにおいて通常用いられる慣
用の固体担体の何れもが使用できる。

固体担体はたとえばポリ配糖体誘導体、ポリアクリルア
ミド、１．Ｂ、Ｆ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｑｕｅＦｒａｎｃａｉｓ）社からトリスアクリル　（
ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ）の名称で市販の担体の如きＮ−ア
クリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，
３−プロパンジオール反復単位を含むポリマー又はコポ
リマーによって構成されるポリマー担体である。

使用できるポリ配糖体誘導体のうちとくにセルロース、
デキストラン、アガロース、セファロース、澱粉ならび
にアミノ化アルコール誘導体とのエーテル化により改質
したポリ配糖体誘導体があげられる。これらの改質した
ポリ配糖体誘導体は次式； （式中Ｒはポリ配糖体残基を表わし、ｎは整数であ）て
１乃至１０好ましくは２乃至５であり、Ｒ１及びＲ２は
低級アルキル基又はヒドロキシ低級アルキル基を表わし
１ｍはポリ配糖体分子上に固定されたエーテル化基の個
数を表わす）に相当する。

改質したこれらポリ配糖体誘導体のうちたとえばジエチ
ルアミノエチルセルロース　（ＤＥＡＥセルロース）　
、ＤＥＡＥデキストラン、ＤＥＡＥ澱粉などがあげられ
る。

固体担体として用いたポリマーはそれら自体多孔性無機
質担体たとえばシリカ、アルミナ、マグネシアの如き金
属酸化物により又はガラス、珪酸塩、硼珪酸塩、カオリ
ンなどの如きこれら酸化物の天然又は合成の誘導体によ
り構成された多孔性無機担体上に固定してあるものであ
ってもよい。

該ポリマーは含浸によって多孔性無機質担体上に固定す
ることができ、必要ならばポリマー被覆を引続いて公知
の方法に従って架橋により安定させる。架橋剤はたとえ
ばジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシドな
どである。また担体ポリマーは双官能結合剤を介して無
機質担体上に固定できる。

脱シアル化プロティンはまた公知の方法に従って適宜な
双官能性結合剤によりポリマー担体上に固定することも
できる。該結合剤はたとえばジシアングロミド、ジアル
デヒド、ジエボキシドの如き双官能性誘導体である。

脱シアル化プロティンはまた直接に多孔性無機質担体上
に固定できる。

たとえばシリカ担体の場合において、シリカのアミノア
ルキルシラン誘導体を調製し次にグルタルアルデヒドの
如き双官能性結合剤によってアミノアルキルシラン上に
脱シアル化プロティンを固定できる：たとえばＰ、Ｔ、
Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ、　２４２．６５９−６６１（１９７１）
参照。

また脱シアル化プロティンを仏国特許出願第７７．２８
１６３号（公告番号第２４０３０９８号）明細書記載の
方法に従って多孔性無機質担体上に固定できる。この方
法は過沃素酸塩の如き酸化剤によるグリコール基の酸化
開裂反応を引き起こし得るポリ配糖体ポリマーで多孔性
無機質担体を被覆することにある。そのときポリカルボ
ニル化した被覆が得られ、リガンドたとえば脱シアル化
グリコプロティンは生成したカルボニル基上に固定でき
る。

引続いて所望ならば生成したイミン基を還元してアミン
とする。

本発明はまたボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法に
も関する。この方法は本質的には該蛋白質抗原含有の溶
液を前述の如きアフイニテイ・りロマトグラフィー担体
と接触させ次に所望の抗原を収集又は溶出するにある。

こうしてＦ−ＨＡが溶液中に残留している一方でアフィ
ニティ・クロマトグラフィー担体上に固定された百日咳
菌毒素を該溶液から分離し次に適当な溶出（溶ｌｌ）剤
により百日咳菌毒素を溶出することができる。

また本発明の方法を、Ｆ−ＨＡで富化されたフラクショ
ンを、それが含んでいる可能性のある百日咳菌毒素がア
フィニティ・クロマトグラフィー担体により保留され、
これが除去されるように精製するために利用することも
できる。従ってクロマトグラフィー材料と接触させた後
に得られる溶液を分離して精製Ｆ−ＨＡ溶液が得られる
。

精製すべき原料溶液はたとえばボルデテラ属細菌の培養
上澄液又は部分的に精製した百日咳菌毒素又はＦ−ＨＡ
の溶液とすることができる。

本発明のアフイニテイ・クロマトグラフィー担体上の百
日咳菌毒素を精製するためにはｐＨを６−８好ましくは
７に調節した原料溶液が用いられる。

用いられるアフィニティ・クロマトグラフィー担体の量
は出発材料として用いられる初めの上澄液の容積及び／
又は培地中又はフラクション中の百日咳菌毒素濃度によ
フて左右される。接触は温度２−３０℃において浴中又
はカラム内で行なわれる。

本発明のアフィニティ・クロマトグラフィー担体上に固
定した百日咳菌毒素を溶出するためにはたとえば十分な
濃度の塩及び／又は既知のカオトロピック剤たとえば塩
化マグネシウムを含んでいる１１１衝剤溶液又はｐ）ｌ
が８．３乃至１１．６の程度でモル濃度が２５ｍＭを超
える炭酸塩緩衝剤を用いることができる。

以下の実施例は本発明を説明するもので決して本発明を
限定するものではない。

夫五■ユ セファロース４　Ｂ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）　
・アシアロフェチュイン上でのアフィニテイ・クロマト
グラフィーによる百日咳菌毒素の精製 ３０１　ｉｌｌｌｌ的で培養した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａンを６　ｍｌＪ　／　ｃｎｆ　／時間の流速
で、アシアロフェチュインと結合したセファロース４Ｂ
クロマト−グラフィー担体１２０Ｉｌ１５１が収容して
ある直径４ｃｍのカラム上へ通送した。

セファロース４Ｂは下記の要領でアシアロフェチュイン
と結合した。

ＣＮＢｒで活性化したセファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）３０ｇを１　ｍＭ　　ＨＣｌ２６　Ｊ２
中で約１５分間膨潤させた。引続いてこのゲルを１　ｍ
Ｍ　　ＨＣｌ２６１で３回洗浄した。アシアロフェチュ
インｌｆｆ１ｇ／Ｔｄ、０．１　Ｍ　Ｎａ）ＩＣＯ３及
び０．５Ｍ　ＮａＣｕ含有の溶液４００ｍ文をゲルに加
えた。

該混合物を＋４℃において温和に攪拌しながら１夜反応
させた。５Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８，０）　１
２５　＋＋＋ＩＪを反応混合物に却えた。室温に４時間
反応させた後にゲルを順次にＩ　Ｍ　ＮａＣＪ２含有の
０．１Ｍ酢酸ナトリウムａｍ液（ｐＨ４，０）　５００
　ｍｊｌにより次にＩ　Ｍ　ＮａＣＪ！含有の５０ｆｆ
ｉＭトリスーＨＣＪｌ緩衝液（ｐＨ７，５）　５００−
により洗浄した。この洗浄サイクルを３回反復した。

引続いてゲルを濃度１７１００００　　（重量／容量）
のマージオレートの如き防腐剤の存在下において５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣＪｌ　＆１衝液（ｐＨ７，５）　５００
　ｍｊｌにより３回洗浄した。

アシアロフェチュインと結合したセファロース４Ｂゲル
を＋４℃において防腐剤たとえばマージオレートの存在
下において５０ｍＭトリス−ＨＣλ緩衝液（ｐＨ７，５
）の如きＩ衝液中に保存した。

アフィニティ・クロマトグラフィーにリガンドとして用
いるアシアロフェチュインは下記の要領で作られた。

フェチュイン（ＳＩＧＭＡ社のフェチュインＩＩＩ型）
の水溶液を０．０５Ｎ　　Ｈ２５０４により８０℃にお
いて１時間加水分解した。加水分解後に該溶液を遊離シ
アル酸を除くため複数の蒸留水浴に対して＋４℃におい
て２４時間透析した。アシアロフェチュイン溶液は排除
限界が１０００（ｌに等しい膜を備えたシステムによっ
て限外濾通して濃縮できた。

シアル酸の除去は加水分解前・後の蛋白質上のシアル酸
特異比色定量により検査した。

ｂ）豆１隻皿皇工旦皿逼 前記のゲルをカラムの２倍の容積の５０−ｆｆ１Ｍトリ
ス−ＨＣＪＬ　ｉ衝液（ｐｏ７．ｓ）テ洗浄しすすｔ）
チ２２７−８ｎの紫外線吸収が完全に消滅するまで洗浄
し、次にカラムの容積のＩ　Ｍ　ＮａＣｊ２含有の５０
ｍＭトリス−ＨＣλ緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した。

百日咳菌毒素は１００ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐ）１９．Ｉ
ｉ）　４００　ｍＭで溶出した。

カラム出口で集めたフラクションの光学的濃度及び赤血
球凝集活性を測定した。

有効成分含有のフラクションすなわちコレステロールに
より抑止されない、強い赤血球凝集活性のある細胞を統
合した。

百日咳菌毒素は引続いて飽和の７０％に相当する最終濃
度の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。

こうして精製した百日咳菌毒素は強いリンパ球増多症を
引き起こし、マウスあたり０．０４Ｍｇの投薬量でＣＦ
Ｗマウスをヒスタミンに対して敏感とする。ＨＯＣ細胞
（ハムスターの卵巣細胞）上にクラスター生成を引き起
こす毒素の能力は６５０００乃至２６００００ＣＰＵ／
μｇの程度の特異活性によフて特徴付けられる。

物理・化学的検査及び生物学的活性の結果（偶発的汚染
、ＤＮＡ、ＲＮＡ、９類の比色定量、内毒素含有量の定
量、ＳＤＳ媒体中及び酸性媒体中の電気泳動なと）は高
度に精製された有効成分を含んでいる均質な最終製剤を
示している。

初めの培地上澄液中及び最後の沈澱物中の百日咳菌毒素
含有量の分析は９０％を超える精製収率を示した。

衷】０Ｉ且 スフェロシルーＤＥＡＥデキストラン−アシアロフェチ
ュイン上のアフイニテイ・クロマトグラフ？−による百
日咳菌毒素の精製 ａ）　アフィニティ・クロマトグラフィーゲル百日咳菌
（工相菌）の懸濁液の遠心分離及び濃縮後に得られたフ
ラクションのｐＨを５Ｎ塩酸溶液の添加により７．０に
調節した。フラクションをｓ　Ｏｍｕ／ｃｎｆ／時間の
流速で、アシアロフェチュインと結合したスフェロシル
ＤＥＡＥデキ・ストランクロマトグラフィー担体６０−
を収容している直径２ｃｍのカラム上へ通送した。

スフェロシルＤＥＡＥデキストラン（最少量の架橋した
ＤＥＡＥデキストランで被覆したＸＯＣ００５シリ力小
球からなる担体）は下記の要領でアシアロフェチュイン
と結合した。

スフェロシルＤＥＡＥデキストランにリガンドのアミン
基と反応し得るアルデヒド官能基を生成する目的で工夫
した酸化を施こす、１０ｍＭ燐酸塩Ｍ衝液（ｐＨ８，０
）中４　ｍｇ／ｍｕ濃度の溶液としたアシアロフェチュ
インを室温においてゲルと１５時間接触させた。引き続
いてゲルを下記の溶液で洗浄した： （イ）１０ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（ロ）２０
ｇ／４グリコール、０．１７Ｍ　ＮａＣｊ２（ハ）　０
．０５Ｍ　＜えん酸ナトリウム（ｐＨ２，８）、０．１
ＮＨＣ１ ｂ）　　日眩菌毒　の溶出 ゲルを５０ｍＭトリス−Ｈｉ緩衝液（１）Ｈ７，５）　
１２０叔で洗浄し次にＩＭＮａＣＪ２含有の５０ｆｆ１
Ｍトリスー０ＣＸ　Ｍ衝液７０叔で洗浄した。百日咳菌
毒素は４Ｍ　ＭｇＣｊ２２含有の５０ｍＭ）リスーＨＣ
１緩衝液（ｐＨ７，５）により溶出した。カラム出口で
集めたフラクションの２７８ｎｍにおける光学的濃度及
び赤血球凝集活性を測定した。有効成分含有のフラクシ
ョンすなわちコレステロールによって抑止されない高い
赤血球凝集活性のある細胞を統合した。

得られた混合物は５０ｍ１Ｊトリス−ＨｃｘＭ衝液（ｐ
Ｈ７，５）と平衡させたセファデックスＧ−２５（Ｓｅ
ｐｈ−ａｄｅｘ　Ｇ−２５）のカラム（７，５ｘ　４５
　ｃｍ、　ＰＩ（ＡＲＭＡＣＩＡ社）のゲル濾過により
脱塩した。溶出はこの同じ１１衝液を用いて行なわれた
。

カラム出口で集めたフラクションの２７８ｎｍにおける
光学的濃度及び赤血球凝集活性を測定した。百日咳菌毒
素含有のフラクションすなわち高い赤血球凝集活性のあ
る細胞を統合した。

有効成分を、溶ｆｉ　１００　ｍＡあたり４７ｇの（Ｎ
Ｈａ　）　２　ＳＯａを攪拌を行ないながら徐々に添加
し泌て硫酸アンモニウムにより沈澱させた。生物学的及
び物理・化学的特性の分析は得られた生成物が高度に精
製された有効成分であることを示゛した。

東五■ユ Ｆ−ＨＡ冨富化ラクション中に痕跡の百日咳菌毒素があ
る場合のその除去 たとえばＳへＴＯＹ、、　（：Ｏ１？ＥＬＬ　Ｊ、Ｌ、
、　５ＡＴＯＨ，。

ＢＵＲ５ＴＹＮ　Ｄ、Ｇ、＆　ＭＡＮ（：ＬＡＲＫ　Ｃ
，Ｒ，”５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉ
ｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｒ−ｄｅｔｅｌｌａ　７″、　Ｉ
ｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　ｆｍｍｕｎ、。

（１９８３）、土工、１．３１３−３２０の刊行物中に
記載される如き在来のＦ　−ＨＡＦｉ製法はヒドロキシ
アパタイトの如きクロマトグラフィー担体及び０．５　
Ｍ　ＮＡＣＩＬ含有の１００　ａ＋Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）を用いての原料のＦ−ＨＡの脱着過程を包含
する。

ヒドロキシアパタイトカラム出口で集められたフラクシ
ョンの２７８ｎｍにおける光学的濃度及び赤血球凝集活
性を測定した。ＦごＨＡ金含有フラ１　クションすなわ
ちコレステロールによフて抑止されない高い赤血球凝集
活性のある細胞を統合した。

本発明においては最後の痕跡の百日咳菌毒素が存在する
場合にそれを除く目的でＦ−ＨＡ金含有フラクションの
混合物をセファロース４Ｂ−アシアロフェチュインカラ
ムに通送した。Ｆ−ＨＡはただちに溶出され一方痕跡量
の毒素はカラム上に保留された。

次にＦ−ＨＡを溶液１００叔あたり４７ｇの（ＮＨａ　
）　２　Ｓ０４を攪拌を行ないながら徐々に添加して硫
酸アンモニウムにより沈澱させた。

こうして精製したＦ−ＨＡはマウスあたり１０００μｇ
の用薬量でリンパ球増多症も対ヒスタミン敏・感化も引
き起こさない。１００μｇ７ｍＡの濃度ではＦ−ＨＡは
ハムスター卵巣細胞　（）ＩＯｃ）からなる細胞層の外
見に変化を生ぜずすなわち百日咳菌毒素の存在に特有な
細胞群いわゆる“クラスター”の生成を生じない。ガチ
ョウの赤血球で測定したその特異な赤血球凝集活性は蛋
白質ＩＢ単位あたり２５００００乃至５０００００ＨＡ
の程度である。この活性はコレステロールによって完全
に抑止される。

哀直里１ フェチュイン及びアシアロフェチュインを基剤とするア
フィニティ・クロマトグラフィー担体による百日咳菌毒
素固定能力の比較試験。

アフィニティ・クロマトグラフィーゲルは実施例１に記
載の方法に従ってＣＮＢｒで活性化したセファ０−ス４
　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上にアシアロフェチュ
インを固定して調製した。

同様なしかたでフェチュインを用いてアフィニティ・ク
ロマトグラフィーゲルを調製した。

フェチュインの固定及びアシアロフェチュインの固定は
ゲル上に同等のリガンド密度が得られるよう同じ実験条
件において実施した。得られたゲルの性能の比較試験を
実施した。結果は下表にまとめてあり、同表においてア
シアロフェチュインを用いたゲルについて任意に効率１
００％としてある： 表示の値は二つの測定の結果である。各々の実験は平行
して二つの型の担体についてそれらを同容積の百日咳菌
毒素含有培地上澄液と接触させて実施した。溶出した百
日咳菌毒素の量は蛋白質の定量により酵素免疫測定法　
（ＥＬＩＳＡ）に従って測定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロ
   ビンよりなる群から選ばれた脱シアル化グリコプロテイ
   ンよりなる百日咳菌毒素用アフィニティ・クロマトグラ
   フィー・リガンド。 ２、該プロテインはアシアロフェチュインである特許請
   求の範囲第１項記載のリガンド。 ３、該プロテインはアシアロハプトグロビンである特許
   請求の範囲第１項記載のリガンド。 ４、該脱シアル化プロテインは固体担体上に固定される
   特許請求の範囲第１項乃至第３項の何れかに記載のリガ
   ンド。 ５、百日咳菌毒素について親和力のあるリガンドが固定
   してある固体担体により構成されたアフィニティ・クロ
   マトグラフィー材料であって該リガンドが脱シアル化フ
   ェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビンよりなる群か
   ら選ばれた脱シアル化プロテインであるクロマトグラフ
   ィー材料。 ６、該脱シアル化プロテインはポリマー担体上に固定し
   てある特許請求の範囲第５項記載の材料。 ７、該ポリマー担体は多孔性無機質担体上に固定してあ
   る特許請求の範囲第６項記載の材料。 ８、ボルデテラ￥（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）￥属細菌の
   蛋白質抗原を含んでいる溶液を、百日咳菌毒素について
   親和力のあるリガンドが固定してある固体担体により構
   成されたアフィニティ・クロマトグラフィー材料であっ
   て該リガンドが脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化
   ハプトグロビンよりなる群から選ばれた脱シアル化プロ
   テインであるクロマトグラフィー材料と接触させ次に所
   望の抗原を収集又は溶出することから成るボルデテラ属
   細菌の蛋白質抗原の精製法。 ９、該溶液をクロマトグラフィー材料と接触させた後に
   百日咳菌毒素を該材料から溶出する特許請求の範囲第８
   項記載の方法。 １０、クロマトグラフィー材料と接触すべき溶液はＦ−
   ＨＡで富化されたフラクションであり、該フラクション
   をクロマトグラフィー材料と接触させた後に百日咳菌毒
   素を含有しないＦ−ＨＡ精製溶液を分離する特許請求の
   範囲第８項記載の方法。