JPH0826080B2 - アフイニテイ・クロマトグラフイ−材料及びこれを用いてのボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法 - Google Patents
アフイニテイ・クロマトグラフイ−材料及びこれを用いてのボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアフィニティ・クロマトグラフィーの
材料及びその応用とくにボルデテラ（Bordetella）属細
菌の蛋白質抗原の分離及び精製への応用に関する。
材料及びその応用とくにボルデテラ（Bordetella）属細
菌の蛋白質抗原の分離及び精製への応用に関する。
ボルデテラ属細菌たとえば百日咳菌（ボルデテラ パ
ータッシスBordetella pertussis）パラ百日咳菌（ボル
デテラ パラパータッシスBordetella parapertussis）
及び気管支敗血症菌（ボルデテラ ブロンキセプチカBo
rdetella bronchiseptica）の培養によりＦ−HAプロテ
イン（糸状血液凝集素Filamentous hemagglutinin）を
産生できることは公知である。そのうえ百日咳菌の培養
で同様に蛋白質外毒素：百日咳菌毒素またLPF又はLPF−
HA（白血球増多症促進因子−血液凝集素Leukocytosis P
romoting Factor Hemagglutinin）とも呼ばれる外毒素
も産生できる。これらの蛋白質は百日咳に対する無細胞
ワクチン調製に主として使用できる。
ータッシスBordetella pertussis）パラ百日咳菌（ボル
デテラ パラパータッシスBordetella parapertussis）
及び気管支敗血症菌（ボルデテラ ブロンキセプチカBo
rdetella bronchiseptica）の培養によりＦ−HAプロテ
イン（糸状血液凝集素Filamentous hemagglutinin）を
産生できることは公知である。そのうえ百日咳菌の培養
で同様に蛋白質外毒素：百日咳菌毒素またLPF又はLPF−
HA（白血球増多症促進因子−血液凝集素Leukocytosis P
romoting Factor Hemagglutinin）とも呼ばれる外毒素
も産生できる。これらの蛋白質は百日咳に対する無細胞
ワクチン調製に主として使用できる。
ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の分離及び精製は良好
な収率をもって精製抗原を得るためには解決するのが困
難な技術的問題を生ずる。
な収率をもって精製抗原を得るためには解決するのが困
難な技術的問題を生ずる。
一般に、精製操作の際にはアフィニティ・クロマトグ
ラフィーの技法が用いられる。
ラフィーの技法が用いられる。
英国特許出願第2015531号明細書にはシアロプロテイ
ン又はシアル酸に富んだ他の物質が固定してある不溶性
ポリマー担体を用いるアフィニティ・クロマトグラフィ
ー法の使用が推奨してある。シアロプロテインは百日咳
菌毒素を選択的に固定でき次いでこれを溶離できる。
ン又はシアル酸に富んだ他の物質が固定してある不溶性
ポリマー担体を用いるアフィニティ・クロマトグラフィ
ー法の使用が推奨してある。シアロプロテインは百日咳
菌毒素を選択的に固定でき次いでこれを溶離できる。
欧州特許出願第0140386号明細書には百日咳菌毒素選
択性リガンドとして熱変性したセルロプラスミンを用い
るクロマトグラフィー法が記述してある。
択性リガンドとして熱変性したセルロプラスミンを用い
るクロマトグラフィー法が記述してある。
今回意外なことに、以下に示すとおり、百日咳菌毒素
はシアロプロテインによりも担体上に固定した脱シアル
化した（desialyled）グリコプロテインに一層の親和力
があることが見出された。この結果は百日咳菌毒素が、
担体上に固定された場合にはフェチュインの方がアシア
ロフェチュインの固定よりも125Iで標識したフェチュイ
ンの固定を抑止する（フェチュインに比べて僅か93％の
抑止:R.D.Sekuraらの“Pertussis Toxin Structural El
ements involved in the interaction with cells"Proc
eedings of the Pertussis Toxin conference,Bethesd
a,Sept.20−21′1984,R.D.Sekura,J.Moss ＆ M.Vaughan
編（1985）Academic Press社 p.45−64参照）ことが観
察されているので尚一層意外である。
はシアロプロテインによりも担体上に固定した脱シアル
化した（desialyled）グリコプロテインに一層の親和力
があることが見出された。この結果は百日咳菌毒素が、
担体上に固定された場合にはフェチュインの方がアシア
ロフェチュインの固定よりも125Iで標識したフェチュイ
ンの固定を抑止する（フェチュインに比べて僅か93％の
抑止:R.D.Sekuraらの“Pertussis Toxin Structural El
ements involved in the interaction with cells"Proc
eedings of the Pertussis Toxin conference,Bethesd
a,Sept.20−21′1984,R.D.Sekura,J.Moss ＆ M.Vaughan
編（1985）Academic Press社 p.45−64参照）ことが観
察されているので尚一層意外である。
本発明は百日咳菌毒素用アフィニティ・クロマトグラ
フィー・リガンドとして脱シアル化グリコプロテインに
関する。脱シアル化グリコプロテインは、とくに脱シア
ル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビンのうち
から選ぶことができる。
フィー・リガンドとして脱シアル化グリコプロテインに
関する。脱シアル化グリコプロテインは、とくに脱シア
ル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビンのうち
から選ぶことができる。
フェチュイン及びハプトグロビンがシアル化したオリ
ゴ配糖体基を含んでいることは公知である：たとえばJ.
U.Baenzigerらのthe Jonrnal of Biological Chemistry
254、No3、pp.789・795（1979）及びB.NilssonらのProc
eedings of VI International Symposium of glycoconj
ugates（1981）pp.275−276参照。
ゴ配糖体基を含んでいることは公知である：たとえばJ.
U.Baenzigerらのthe Jonrnal of Biological Chemistry
254、No3、pp.789・795（1979）及びB.NilssonらのProc
eedings of VI International Symposium of glycoconj
ugates（1981）pp.275−276参照。
公知の方法によりフェチュイン又はハプトグロビンを
酸加水分解するとシアル化した配糖体構造を対応の脱シ
アル化配糖体構造に転化させこうしてアシアロ−フェチ
ュイン又はアシアロ−ハプトグロビンが得られる。
酸加水分解するとシアル化した配糖体構造を対応の脱シ
アル化配糖体構造に転化させこうしてアシアロ−フェチ
ュイン又はアシアロ−ハプトグロビンが得られる。
フェチュイン及びハプトグロビンは主としてSIGMA社
から市販された工業製品である。
から市販された工業製品である。
本発明はまた百日咳菌毒素について親和力のあるリガ
ンドが固定してある固体担体により構成された新規なア
フィニティ・クロマトグラフィー材料であって該リガン
ドが脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロ
ビンよりなる群から選ばれた脱シアル化プロテインであ
ることを特徴とするクロマトグラフィー材料にも関す
る。
ンドが固定してある固体担体により構成された新規なア
フィニティ・クロマトグラフィー材料であって該リガン
ドが脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロ
ビンよりなる群から選ばれた脱シアル化プロテインであ
ることを特徴とするクロマトグラフィー材料にも関す
る。
これらの蛋白質は固体担体との結合に先立って又は場
合によってはその後に脱シアル化処理を施こす。この脱
シアル化処理は公知の諸方法に従って温和な加水分解に
より行なわれる：たとえばR.G.SPIROらの、J.Biol.Che
m.（1974）249、5704−5717参照。
合によってはその後に脱シアル化処理を施こす。この脱
シアル化処理は公知の諸方法に従って温和な加水分解に
より行なわれる：たとえばR.G.SPIROらの、J.Biol.Che
m.（1974）249、5704−5717参照。
脱シアル化プロテインを結合させる固体担体にはアフ
ィニティ・クロマトグラフィーにおいて通常用いられる
慣用の固体担体の何れもが使用できる。
ィニティ・クロマトグラフィーにおいて通常用いられる
慣用の固体担体の何れもが使用できる。
固体担体はたとえばポリ配糖体誘導体、ポリアクリル
アミド、I.B.F（Institut Biologique Francais）社か
らトリスアクリル（TRISACRYL）の名称で市販の担体の
如きＮ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメ
チル−1,3−プロパンジオール反復単位を含むポリマー
又はコポリマーによって構成されるポリマー担体であ
る。
アミド、I.B.F（Institut Biologique Francais）社か
らトリスアクリル（TRISACRYL）の名称で市販の担体の
如きＮ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメ
チル−1,3−プロパンジオール反復単位を含むポリマー
又はコポリマーによって構成されるポリマー担体であ
る。
使用できるポリ配糖体誘導体のうちとくにセルロー
ス、デキストラン、アガロース、セファロース、澱粉な
らびにアミノ化アルコール誘導体とのエーテル化により
改質したポリ配糖体誘導体があげられる。これらの改質
したポリ配糖体誘導体は次式； （式中Ｒはポリ配糖体残基を表わし、ｎは整数であっ
て１乃至10好ましくは２乃至５であり、R1及びR2は低級
アルキル基又はヒドロキシ低級アルキル基を表わし、ｍ
はポリ配糖体分子上に固定されたエーテル化基の個数を
表わす）に相当する。
ス、デキストラン、アガロース、セファロース、澱粉な
らびにアミノ化アルコール誘導体とのエーテル化により
改質したポリ配糖体誘導体があげられる。これらの改質
したポリ配糖体誘導体は次式； （式中Ｒはポリ配糖体残基を表わし、ｎは整数であっ
て１乃至10好ましくは２乃至５であり、R1及びR2は低級
アルキル基又はヒドロキシ低級アルキル基を表わし、ｍ
はポリ配糖体分子上に固定されたエーテル化基の個数を
表わす）に相当する。
改質したこれらポリ配糖体誘導体のうちたとえばジエ
チルアミノエチルセルロース（DEAEセルロース）、DEAE
デキストラン、DEAE澱粉などがあげられる。
チルアミノエチルセルロース（DEAEセルロース）、DEAE
デキストラン、DEAE澱粉などがあげられる。
固体担体として用いたポリマーはそれら自体多孔性無
機質担体たとえばシリカ、アルミナ、マグネシアの如き
金属酸化物により又はガラス、珪酸塩、硼珪酸塩、カオ
リンなどの如きこれら酸化物の天然又は合成の誘導体に
より構成された多孔性無機担体上に固定してあるもので
あってもよい。
機質担体たとえばシリカ、アルミナ、マグネシアの如き
金属酸化物により又はガラス、珪酸塩、硼珪酸塩、カオ
リンなどの如きこれら酸化物の天然又は合成の誘導体に
より構成された多孔性無機担体上に固定してあるもので
あってもよい。
該ポリマーは含浸によって多孔性無機質担体上に固定
することができ、必要ならばポリマー被覆を引続いて公
知の方法に従って架橋により安定させる。架橋剤はたと
えばジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシド
などである。また担体ポリマーは双官能結合剤を介して
無機質担体上に固定できる。
することができ、必要ならばポリマー被覆を引続いて公
知の方法に従って架橋により安定させる。架橋剤はたと
えばジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシド
などである。また担体ポリマーは双官能結合剤を介して
無機質担体上に固定できる。
脱シアル化プロテインはまた公知の方法に従って適宜
な双官能性結合剤によりポリマー担体上に固定すること
もできる。該結合剤はたとえばジシアンブロミド、ジア
ルデヒド、ジエポキシドの如き双官能性誘導体である。
な双官能性結合剤によりポリマー担体上に固定すること
もできる。該結合剤はたとえばジシアンブロミド、ジア
ルデヒド、ジエポキシドの如き双官能性誘導体である。
脱シアル化プロテインはまた直接に多孔性無機質担体
上に固定できる。
上に固定できる。
たとえばシリカ担体の場合において、シリカのアミノ
アルキルシラン誘導体を調製し次にグルタルアルデヒド
の如き双官能性結合剤によってアミノアルキルシラン上
に脱シアル化プロテインを固定できる：たとえばP.T.Ro
binsonらの、Biochim.Biophys.Acta,242、659−661（19
71）参照。
アルキルシラン誘導体を調製し次にグルタルアルデヒド
の如き双官能性結合剤によってアミノアルキルシラン上
に脱シアル化プロテインを固定できる：たとえばP.T.Ro
binsonらの、Biochim.Biophys.Acta,242、659−661（19
71）参照。
また脱シアル化プロテインを仏国特許出願第77,28163
号（公告番号第2403098号）明細書記載の方法に従って
多孔性無機質担体上に固定できる。この方法は過沃素酸
塩の如き酸化剤によるグリコール基の酸化開裂反応を引
き起こし得るポリ配糖体ポリマーで多孔性無機質担体を
被覆することにある。そのときポリカルボニル化した被
覆が得られ、リガンドたとえば脱シアル化グリコプロテ
インは生成したカルボニル基上に固定できる。引続いて
所望ならば生成したイミン基を還元してアミンとする。
号（公告番号第2403098号）明細書記載の方法に従って
多孔性無機質担体上に固定できる。この方法は過沃素酸
塩の如き酸化剤によるグリコール基の酸化開裂反応を引
き起こし得るポリ配糖体ポリマーで多孔性無機質担体を
被覆することにある。そのときポリカルボニル化した被
覆が得られ、リガンドたとえば脱シアル化グリコプロテ
インは生成したカルボニル基上に固定できる。引続いて
所望ならば生成したイミン基を還元してアミンとする。
本発明はまたボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法
にも関する。この方法は本質的には該蛋白質抗原含有の
溶液を前述の如きアフィニティ・クロマトグラフィー担
体と接触させ次に所望の抗原を収集又は溶出するにあ
る。
にも関する。この方法は本質的には該蛋白質抗原含有の
溶液を前述の如きアフィニティ・クロマトグラフィー担
体と接触させ次に所望の抗原を収集又は溶出するにあ
る。
こうしてＦ−HAが溶液中に残留している一方でアフィ
ニティ・クロマトグラフィー担体上に固定された百日咳
菌毒素を該溶液から分離し次に適当な溶出（溶離）剤に
より百日咳菌毒素を溶出することができる。
ニティ・クロマトグラフィー担体上に固定された百日咳
菌毒素を該溶液から分離し次に適当な溶出（溶離）剤に
より百日咳菌毒素を溶出することができる。
また本発明の方法を、Ｆ−HAで冨化されたフラクショ
ンを、それが含んでいる可能性のある百日咳菌毒素がア
フィニティ・クロマトグラフィー担体により保留され、
これが除去されるように精製するために利用することも
できる。従ってクロマトグラフィー材料と接触させた後
に得られる溶液を分離して精製Ｆ−HA溶液が得られる。
ンを、それが含んでいる可能性のある百日咳菌毒素がア
フィニティ・クロマトグラフィー担体により保留され、
これが除去されるように精製するために利用することも
できる。従ってクロマトグラフィー材料と接触させた後
に得られる溶液を分離して精製Ｆ−HA溶液が得られる。
精製すべき原料溶液はたとえばボルデテラ属細菌の培
養上澄液又は部分的に精製した百日咳菌毒素又はＦ−HA
の溶液とすることができる。
養上澄液又は部分的に精製した百日咳菌毒素又はＦ−HA
の溶液とすることができる。
本発明のアフィニティ・クロマトグラフィー担体上の
百日咳菌毒素を精製するためにはpHを６−８好ましくは
７に調節した原料溶液が用いられる。
百日咳菌毒素を精製するためにはpHを６−８好ましくは
７に調節した原料溶液が用いられる。
用いられるアフィニティ・クロマトグラフィー担体の
量は出発材料として用いられる初めの上澄液の容積及び
／又は培地中又はフラクション中の百日咳菌毒素濃度に
よって左右される。接触は温度２−30℃において浴中又
はカラム内で行なわれる。
量は出発材料として用いられる初めの上澄液の容積及び
／又は培地中又はフラクション中の百日咳菌毒素濃度に
よって左右される。接触は温度２−30℃において浴中又
はカラム内で行なわれる。
本発明のアフィニティ・クロマトグラフィー担体上に
固定した百日咳菌毒素を溶出するためにはたとえば十分
な濃度の塩及び／又は既知のカオトロピック剤たとえば
塩化マグネシウムを含んでいる緩衝剤溶液又はpHが8.3
乃至11.6の程度でモル濃度が25mMを超える炭酸塩緩衝剤
を用いることができる。
固定した百日咳菌毒素を溶出するためにはたとえば十分
な濃度の塩及び／又は既知のカオトロピック剤たとえば
塩化マグネシウムを含んでいる緩衝剤溶液又はpHが8.3
乃至11.6の程度でモル濃度が25mMを超える炭酸塩緩衝剤
を用いることができる。
以下の実施例は本発明を説明するもので決して本発明
を限定するものではない。
を限定するものではない。
実施例１ セファロース4B（Sepharose 4B）・アシアロフェチュ
イン上でのアフィニティ・クロマトグラフィーによる百
日咳菌毒素の精製 ａ）アフィニティ・クロマトグラフィーゲル上の百日咳
菌毒素の吸着 30l醗酵槽内で培養した百日咳菌（Bordetellapertuss
is）（Ｉ相菌）の懸濁液の遠心分離及び濃縮後に得られ
た百日咳菌毒素で富化したフラクションを6ml/cm2／時
間の流速で、アシアロフェチュインと結合したセファロ
ース4Bクロマトグラフィー担体120mlが収容してある直
径4cmのカラム上へ通送した。
イン上でのアフィニティ・クロマトグラフィーによる百
日咳菌毒素の精製 ａ）アフィニティ・クロマトグラフィーゲル上の百日咳
菌毒素の吸着 30l醗酵槽内で培養した百日咳菌（Bordetellapertuss
is）（Ｉ相菌）の懸濁液の遠心分離及び濃縮後に得られ
た百日咳菌毒素で富化したフラクションを6ml/cm2／時
間の流速で、アシアロフェチュインと結合したセファロ
ース4Bクロマトグラフィー担体120mlが収容してある直
径4cmのカラム上へ通送した。
セファロース4Bは下記の要領でアシアロフェチュイン
と結合した。
と結合した。
CNBrで活性化したセファロース4B（Pharmacia社）30g
を1mM HCl6l中で約15分間膨潤させた。引続いてこのゲ
ルを1mM HCl6lで３回洗浄した。アシアロフェチュイン1
mg/ml、0.1M NaHCO3及び0.5M NaCl含有の溶液400mlをゲ
ルに加えた。
を1mM HCl6l中で約15分間膨潤させた。引続いてこのゲ
ルを1mM HCl6lで３回洗浄した。アシアロフェチュイン1
mg/ml、0.1M NaHCO3及び0.5M NaCl含有の溶液400mlをゲ
ルに加えた。
該混合物を＋４℃において温和に撹拌しながら１夜反
応させた。5Mエタノールアミン溶液（pH8.0）125mlを反
応混合物に加えた。室温に４時間反応させた後にゲルを
順次に1M NaCl含有の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.
0）500mlにより次に1M NaCl含有の50mMトリス−HCl緩衝
液（pH7.5）500mlにより洗浄した。この洗浄サイクルを
３回反復した。
応させた。5Mエタノールアミン溶液（pH8.0）125mlを反
応混合物に加えた。室温に４時間反応させた後にゲルを
順次に1M NaCl含有の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.
0）500mlにより次に1M NaCl含有の50mMトリス−HCl緩衝
液（pH7.5）500mlにより洗浄した。この洗浄サイクルを
３回反復した。
引続いてゲルを濃度1/10000（重量／容量）のマーシ
オレートの如き防腐剤の存在下において50mMトリス−HC
l緩衝液（pH7.5）500mlにより３回洗浄した。
オレートの如き防腐剤の存在下において50mMトリス−HC
l緩衝液（pH7.5）500mlにより３回洗浄した。
アシアロフェチュインと結合したセファロース4Bゲル
を＋４℃において防腐剤たとえばマーシオレートの存在
下において50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）の如き緩衝
液中に保存した。
を＋４℃において防腐剤たとえばマーシオレートの存在
下において50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）の如き緩衝
液中に保存した。
アフィニティ・クロマトグラフィーにリガンドとして
用いるアシアロフェチュインは下記の要領で作られた。
用いるアシアロフェチュインは下記の要領で作られた。
フェチュイン（SIGMA社のフェチュインIII型）の水溶
液を0.05N H2SO4により80℃において１時間加水分解し
た。加水分解後に該溶液を遊離シアル酸を除くため複数
の蒸留水浴に対して＋４℃において24時間透析した。ア
シアロフェチュイン溶液は排除限界が10000に等しい膜
を備えたシステムによって限界濾過して濃縮できた。
液を0.05N H2SO4により80℃において１時間加水分解し
た。加水分解後に該溶液を遊離シアル酸を除くため複数
の蒸留水浴に対して＋４℃において24時間透析した。ア
シアロフェチュイン溶液は排除限界が10000に等しい膜
を備えたシステムによって限界濾過して濃縮できた。
シアル酸の除去は加水分解前・後の蛋白質上のシアル
酸特異比色定量により検査した。
酸特異比色定量により検査した。
ｂ）百日咳菌毒素の溶出 前記のゲルをカラムの２倍の容積の50mMトリス−HCl
緩衝液（pH7.5）で洗浄しすなわち278nmの紫外線吸収が
完全に消滅するまで洗浄し、次にカラムの容積の1M NaC
l含有の50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）で洗浄した。
百日咳菌毒素は100mM炭酸塩緩衝液（pH9.6）400mlで溶
出した。
緩衝液（pH7.5）で洗浄しすなわち278nmの紫外線吸収が
完全に消滅するまで洗浄し、次にカラムの容積の1M NaC
l含有の50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）で洗浄した。
百日咳菌毒素は100mM炭酸塩緩衝液（pH9.6）400mlで溶
出した。
カラム出口で集めたフラクションの光学的濃度及び赤
血球凝集活性を測定した。
血球凝集活性を測定した。
有効成分含有のフラクションすなわちコレステロール
により抑止されない、強い赤血球凝集活性のある細胞を
統合した。
により抑止されない、強い赤血球凝集活性のある細胞を
統合した。
百日咳菌毒素は引続いて飽和の70％に相当する最終濃
度の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。
度の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。
こうして精製した百日咳菌毒素は強いリンパ球増多症
を引き起こし、マウスあたり0.04μｇの投薬量でCFWマ
ウスをヒスタミンに対して敏感とする。HOC細胞（ハム
スターの卵巣細胞）上にクラスター生成を引き起こす毒
素の能力は65000乃至260000CPU/μｇの程度の特異活性
によって特徴付けられる。
を引き起こし、マウスあたり0.04μｇの投薬量でCFWマ
ウスをヒスタミンに対して敏感とする。HOC細胞（ハム
スターの卵巣細胞）上にクラスター生成を引き起こす毒
素の能力は65000乃至260000CPU/μｇの程度の特異活性
によって特徴付けられる。
物理・化学的検査及び生物学的活性の結果（偶発的汚
染、DNA,RNA、糖類の比色定量、内毒素含有量の定量、S
DS媒体中及び酸性媒体中の電気泳動など）は高度に精製
された有効成分を含んでいる均質な最終製剤を示してい
る。
染、DNA,RNA、糖類の比色定量、内毒素含有量の定量、S
DS媒体中及び酸性媒体中の電気泳動など）は高度に精製
された有効成分を含んでいる均質な最終製剤を示してい
る。
初めの培地上澄液中及び最後の沈澱物中の百日咳菌毒
素含有量の分析は90％を超える精製収率を示した。
素含有量の分析は90％を超える精製収率を示した。
実施例２ スフェロシル−DEAEデキストラン−アシアロフェチュ
イン上のアフィニティ・クロマトグラフィーによる百日
咳菌毒素の精製 ａ）アフィニティ・クロマトグラフィーゲル上の毒素の
吸着 百日咳菌（Ｉ相菌）の懸濁液の遠心分離及び濃縮後に
得られたフラクションのpHを5N塩酸溶液の添加により7.
0に調節した。フラクションを60ml/cm2／時間の流速
で、アシアロフェチュインと結合したスフェロシルDEAE
デキストラン クロマトグラフィー担体60mlを収容して
いる直径2cmのカラム上へ通送した。
イン上のアフィニティ・クロマトグラフィーによる百日
咳菌毒素の精製 ａ）アフィニティ・クロマトグラフィーゲル上の毒素の
吸着 百日咳菌（Ｉ相菌）の懸濁液の遠心分離及び濃縮後に
得られたフラクションのpHを5N塩酸溶液の添加により7.
0に調節した。フラクションを60ml/cm2／時間の流速
で、アシアロフェチュインと結合したスフェロシルDEAE
デキストラン クロマトグラフィー担体60mlを収容して
いる直径2cmのカラム上へ通送した。
スフェロシルDEAEデキストラン（最少量の架橋したDE
AEデキストランで被覆したXOC 005シリカ小球からなる
担体）は下記の要領でアシアロフェチュインと結合し
た。
AEデキストランで被覆したXOC 005シリカ小球からなる
担体）は下記の要領でアシアロフェチュインと結合し
た。
スフェロシルDEAEデキストランにリガンドのアミン基
と反応し得るアルデヒド官能基を生成する目的で工夫し
た酸化を施こす。10mM燐酸塩緩衝液（pH8.0）中4mg/ml
濃度の溶液としたアシアロフェチュインを室温において
ゲルと15時間接触させた。引き続いてゲルを下記の溶液
で洗浄した： （イ）10mM燐酸塩緩衝液（pH8.0） （ロ）20g/lグリコール、0.17M NaCl （ハ）0.05Mくえん酸ナトリウム（pH2.8）、 0.1N HCl （ｂ）百日咳菌毒素の溶出 ゲルを50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）120mlで洗浄
し次に1M NaCl含有の50mMトリス−HCl緩衝液70mlで洗浄
した。百日咳菌毒素は4M MgCl2含有の50mMトリス−HCl
緩衝液（pH7.5）により溶出した。カラム出口で集めた
フラクションの278nmにおける光学的濃度及び赤血球凝
集活性を測定した。有効成分含有のフラクションすなわ
ちコレステロールによって抑止されない高い赤血球凝集
活性のある細胞を統合した。
と反応し得るアルデヒド官能基を生成する目的で工夫し
た酸化を施こす。10mM燐酸塩緩衝液（pH8.0）中4mg/ml
濃度の溶液としたアシアロフェチュインを室温において
ゲルと15時間接触させた。引き続いてゲルを下記の溶液
で洗浄した： （イ）10mM燐酸塩緩衝液（pH8.0） （ロ）20g/lグリコール、0.17M NaCl （ハ）0.05Mくえん酸ナトリウム（pH2.8）、 0.1N HCl （ｂ）百日咳菌毒素の溶出 ゲルを50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）120mlで洗浄
し次に1M NaCl含有の50mMトリス−HCl緩衝液70mlで洗浄
した。百日咳菌毒素は4M MgCl2含有の50mMトリス−HCl
緩衝液（pH7.5）により溶出した。カラム出口で集めた
フラクションの278nmにおける光学的濃度及び赤血球凝
集活性を測定した。有効成分含有のフラクションすなわ
ちコレステロールによって抑止されない高い赤血球凝集
活性のある細胞を統合した。
得られた混合物は50mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）と
平衡させたセファデックスＧ−25（Sephadex G−25）の
カラム（7.5×45cm、PHARMACIA社）のゲル濾過により脱
塩した。溶出はこの同じ緩衝液を用いて行なわれた。
平衡させたセファデックスＧ−25（Sephadex G−25）の
カラム（7.5×45cm、PHARMACIA社）のゲル濾過により脱
塩した。溶出はこの同じ緩衝液を用いて行なわれた。
カラム出口で集めたフラクションの278nmにおける光
学的濃度及び赤血球凝集活性を測定した。百日咳菌毒素
含有のフラクションすなわち高い赤血球凝集活性のある
細胞を統合した。
学的濃度及び赤血球凝集活性を測定した。百日咳菌毒素
含有のフラクションすなわち高い赤血球凝集活性のある
細胞を統合した。
有効成分を、溶液100mlあたり47gの(NH4)2SO4を撹拌
を行ないながら徐々に添加して硫酸アンモニウムにより
沈澱させた。生物学的及び物理・化学的特性の分析は得
られた生成物が高度に精製された有効成分であることを
示した。
を行ないながら徐々に添加して硫酸アンモニウムにより
沈澱させた。生物学的及び物理・化学的特性の分析は得
られた生成物が高度に精製された有効成分であることを
示した。
実施例３ Ｆ−HA冨化フラクション中に痕跡の百日咳菌毒素があ
る場合のその除去 たとえば SATO Y.,COWELL J.L.,SATO H.,BURSTYN D.
G.＆ MANCLARK C.R.“Separation and purification of
the hemagglutinins from Bor-detella pertussis",In
fect.and Immun.,（1983）、41、１、313−320の刊行物
中に記載される如き在来のＦ−HA精製法はヒドロキシア
パタイトの如きクロマトグラフィー担体及び0.5M NACl
含有の100mM燐酸塩緩衝液（pH7.0）を用いての原料のＦ
−HAの脱着過程を包含する。
る場合のその除去 たとえば SATO Y.,COWELL J.L.,SATO H.,BURSTYN D.
G.＆ MANCLARK C.R.“Separation and purification of
the hemagglutinins from Bor-detella pertussis",In
fect.and Immun.,（1983）、41、１、313−320の刊行物
中に記載される如き在来のＦ−HA精製法はヒドロキシア
パタイトの如きクロマトグラフィー担体及び0.5M NACl
含有の100mM燐酸塩緩衝液（pH7.0）を用いての原料のＦ
−HAの脱着過程を包含する。
ヒドロキシアパタイトカラム出口で集められたフラク
ションの278nmにおける光学的濃度及び赤血球凝集活性
を測定した。Ｆ−HA含有のフラクションすなわちコレス
テロールによって抑止されない高い赤血球凝集活性のあ
る細胞を統合した。
ションの278nmにおける光学的濃度及び赤血球凝集活性
を測定した。Ｆ−HA含有のフラクションすなわちコレス
テロールによって抑止されない高い赤血球凝集活性のあ
る細胞を統合した。
本発明においては最後の痕跡の百日咳菌毒素が存在す
る場合にそれを除く目的でＦ−HA含有のフラクションの
混合物をセファロース4B−アシアロフェチュインカラム
に通送した。Ｆ−HAはただちに溶出され一方痕跡量の毒
素はカラム上に保留された。
る場合にそれを除く目的でＦ−HA含有のフラクションの
混合物をセファロース4B−アシアロフェチュインカラム
に通送した。Ｆ−HAはただちに溶出され一方痕跡量の毒
素はカラム上に保留された。
次にＦ−HAを溶液100mlあたり47gの(NH4)2SO4を撹拌
を行ないながら徐々に添加して硫酸アンモニウムにより
沈澱させた。
を行ないながら徐々に添加して硫酸アンモニウムにより
沈澱させた。
こうして精製したＦ−HAはマウスあたり1000μｇの用
薬量でリンパ球増多症も対ヒスタミン敏感化も引き起こ
さない。100μg/mlの濃度ではＦ−HAはハムスター卵巣
細胞（HOC）からなる細胞層の外見に変化を生ぜずすな
わち百日咳菌毒素の存在に特有な細胞群いわゆる“クラ
スター”の生成を生じない。ガチョウの赤血球で測定し
たその特異な赤血球凝集活性は蛋白質1mg単位あたり250
000乃至500000HAの程度である。この活性はコレステロ
ールによって完全に抑止される。
薬量でリンパ球増多症も対ヒスタミン敏感化も引き起こ
さない。100μg/mlの濃度ではＦ−HAはハムスター卵巣
細胞（HOC）からなる細胞層の外見に変化を生ぜずすな
わち百日咳菌毒素の存在に特有な細胞群いわゆる“クラ
スター”の生成を生じない。ガチョウの赤血球で測定し
たその特異な赤血球凝集活性は蛋白質1mg単位あたり250
000乃至500000HAの程度である。この活性はコレステロ
ールによって完全に抑止される。
実施例４ フェチュイン及びアシアロフェチュインを基剤とする
アフィニティ・クロマトグラフィー担体による百日咳菌
毒素固定能力の比較試験。
アフィニティ・クロマトグラフィー担体による百日咳菌
毒素固定能力の比較試験。
アフィニティ・クロマトグラフィーゲルは実施例１に
記載の方法に従ってCNBrで活性化したセファロース4B
（Pharmacia社）上にアシアロフェチュインを固定して
調製した。
記載の方法に従ってCNBrで活性化したセファロース4B
（Pharmacia社）上にアシアロフェチュインを固定して
調製した。
同様なしかたでフェチュインを用いてアフィニティ・
クロマトグラフィーゲルを調製した。
クロマトグラフィーゲルを調製した。
フェチュインの固定及びアシアロフェチュインの固定
はゲル上に同等のリガンド密度が得られるよう同じ実験
条件において実施した。得られたゲルの性能の比較試験
を実施した。結果は下表にまとめてあり、同表において
アシアロフェチュインを用いたゲルについて任意に効率
100％としてある： 表示の値は二つの測定の結果である。各々の実験は平
行して二つの型の担体についてそれらを同容積の百日咳
菌毒素含有培地上澄液と接触させて実施した。溶出した
百日咳菌毒素の量は蛋白質の定量により酵素免疫測定法
（ELISA）に従って測定した。
はゲル上に同等のリガンド密度が得られるよう同じ実験
条件において実施した。得られたゲルの性能の比較試験
を実施した。結果は下表にまとめてあり、同表において
アシアロフェチュインを用いたゲルについて任意に効率
100％としてある： 表示の値は二つの測定の結果である。各々の実験は平
行して二つの型の担体についてそれらを同容積の百日咳
菌毒素含有培地上澄液と接触させて実施した。溶出した
百日咳菌毒素の量は蛋白質の定量により酵素免疫測定法
（ELISA）に従って測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (10)
- 【請求項１】脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハ
プトグロビンよりなる群から選ばれた脱シアル化グリコ
プロテインよりなる百日咳菌毒素用アフィニティ・クロ
マトグラフィー・リガンド。 - 【請求項２】該プロテインはアシアロフェチュインであ
る特許請求の範囲第１項記載のリガンド。 - 【請求項３】該プロテインはアシアロハプトグロビンで
ある特許請求の範囲第１項記載のリガンド。 - 【請求項４】該脱シアル化プロテインは固体担体上に固
定される特許請求の範囲第１項乃至第３項の何れかに記
載のリガンド。 - 【請求項５】百日咳菌毒素について親和力のあるリガン
ドが固定してある固体担体により構成されたアフィニテ
ィ・クロマトグラフィー材料であって該リガンドが脱シ
アル化フェチュイン及び脱シアル化ハプトグロビンより
なる群から選ばれた脱シアル化プロテインであるクロマ
トグラフィー材料。 - 【請求項６】該脱シアル化プロテインはポリマー担体上
に固定してある特許請求の範囲第５項記載の材料。 - 【請求項７】該ポリマー担体は多孔性無機質担体上に固
定してある特許請求の範囲第６項記載の材料。 - 【請求項８】ボルデテラ（Bordetella）属細菌の蛋白質
抗原を含んでいる溶液を、百日咳菌毒素について親和力
のあるリガンドが固定してある固体担体により構成され
たアフィニティ・クロマトグラフィー材料であって該リ
ガンドが脱シアル化フェチュイン及び脱シアル化ハプト
グロビンよりなる群から選ばれた脱シアル化プロテイン
であるクロマトグラフィー材料と接触させ次に所望の抗
原を収集又は溶出することから成るボルデテラ属細菌の
蛋白質抗原の精製法。 - 【請求項９】該溶液をクロマトグラフィー材料と接触さ
せた後に百日咳菌毒素を該材料から溶出する特許請求の
範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】クロマトグラフィー材料と接触すべき溶
液はＦ−HAで冨化されたフラクションであり、該フラク
ションをクロマトグラフィー材料と接触させた後に百日
咳菌毒素を含有しないＦ−HA精製溶液を分離する特許請
求の範囲第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8605457 | 1986-04-16 | ||
| FR8605457A FR2597605B1 (fr) | 1986-04-16 | 1986-04-16 | Nouveau materiau pour chromatographie d'affinite et son application a la separation et a la purification des antigenes proteiques des bacteries du genre bordetella |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62253396A JPS62253396A (ja) | 1987-11-05 |
| JPH0826080B2 true JPH0826080B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=9334301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62092148A Expired - Lifetime JPH0826080B2 (ja) | 1986-04-16 | 1987-04-16 | アフイニテイ・クロマトグラフイ−材料及びこれを用いてのボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0242302B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0826080B2 (ja) |
| AT (1) | ATE57936T1 (ja) |
| CA (1) | CA1295985C (ja) |
| DE (2) | DE242302T1 (ja) |
| ES (1) | ES2000434B3 (ja) |
| FR (1) | FR2597605B1 (ja) |
| GR (2) | GR880300042T1 (ja) |
| LU (1) | LU90380I2 (ja) |
| SU (1) | SU1600633A3 (ja) |
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| AU613387B2 (en) * | 1987-08-13 | 1991-08-01 | Carl-Zeiss-Stiftung Trading As Schott Glaswerke | An inorganic carrier element comprising an amine-containing surface layer for the immobilization of microorganisms or cells, a process for the preparation thereof |
| US5445817A (en) * | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
| WO2004036216A1 (ja) * | 2002-10-18 | 2004-04-29 | Japan Science And Technology Agency | 糖鎖−糖鎖結合性タンパク質の相互作用の測定方法およびその利用 |
| US7402243B2 (en) * | 2004-09-10 | 2008-07-22 | Dionex Corporation | Organosilanes and substrate bonded with same |
| US7468130B2 (en) * | 2005-02-15 | 2008-12-23 | Dionex Corporation | Organosilanes and substrates covalently bonded with same and methods for synthesis and use same |
| US7557232B2 (en) * | 2007-05-25 | 2009-07-07 | Dionex Corporation | Compositions useful as chromatography stationary phases |
| CA2831787A1 (en) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
| WO2019189474A1 (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 日本精工株式会社 | ステアリング装置 |
| KR102362777B1 (ko) * | 2018-03-27 | 2022-02-15 | 주식회사 녹십자 | 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법 |
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| SU547104A1 (ru) * | 1973-12-21 | 1985-03-30 | Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени химико-технологический институт им.Д.И.Менделеева | Способ получени сорбента дл гемоадсорбции |
| US4125492A (en) * | 1974-05-31 | 1978-11-14 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
| US4225487A (en) * | 1974-05-31 | 1980-09-30 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of Vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
| US4010251A (en) * | 1974-12-16 | 1977-03-01 | Green Allan M | Scanning agent composition and use in imaging liver and for biliary function |
| FR2403098A1 (fr) * | 1977-09-19 | 1979-04-13 | Merieux Inst | Nouveau materiau capable de fixer de facon reversible des macromolecules biologiques, sa preparation et son application |
| US4247452A (en) * | 1978-03-01 | 1981-01-27 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Purification of pertussis haemagglutinins |
| US4416872A (en) * | 1982-03-17 | 1983-11-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Treatment of malaria with liposomes containing 8-aminoquinoline derivatives and glycoconjugates |
| US4466951A (en) * | 1982-11-12 | 1984-08-21 | University Of California | Intracellular trapping of therapeutics or tracer agents |
| SE445649B (sv) * | 1983-06-08 | 1986-07-07 | Jorgen Hermansson | Anvendning av en fast berare med immobiliserad orosomucoid for separation, forfarande for framstellning av separationsmaterial, separationsanordning samt separationsmaterial |
| JPS6098988A (ja) * | 1983-11-01 | 1985-06-01 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| JPS6176422A (ja) * | 1984-09-22 | 1986-04-18 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 百日ぜきコンポ−ネントワクチンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法 |
-
1986
- 1986-04-16 FR FR8605457A patent/FR2597605B1/fr not_active Expired
-
1987
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- 1987-04-15 ZA ZA872711A patent/ZA872711B/xx unknown
- 1987-04-15 US US07/038,748 patent/US4985144A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-15 CA CA000534842A patent/CA1295985C/fr not_active Expired - Lifetime
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- 1987-04-16 DE DE8787400878T patent/DE3765822D1/de not_active Expired - Lifetime
-
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-
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- 1990-12-18 US US07/629,674 patent/US5045203A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1991-01-24 GR GR91400080T patent/GR3001376T3/el unknown
-
1999
- 1999-03-29 LU LU90380C patent/LU90380I2/xx unknown
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