KR102362777B1 - 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법에 관한 것이다. 본 발명은 블루 친화성 컬럼을 이용한 정제 공정을 통해 백일해균의 PT 및 FHA 단백질을 분리함으로써 PT 및 FHA 단백질의 생산효율을 증가시킨다. 또한, 상기 정제 공정을 이용할 경우, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC) 공정을 통한 분리 방법에 비해 목적 단백질의 생산량이 현저히 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 블루 친화성 컬럼을 이용한 PT 및 FHA 단백질의 분리 방법은 레진 비용, 공정 시간, 버퍼 사용량 및 생산원가를 감소시켰으며, PT 및 FHA 단백질의 생산성을 현저히 증가시켰다.

Description

친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법{METHOD FOR OBTAINING BORDETELLA PERTUSSIS RELATED PROTEINS COMPRISING AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법에 관한 것이다.
백일해는 주로 영유아에게 발병하고 2주 이상의 기침을 특징으로 하는 급성 호흡기 질환이다. 그람 음성의 짧은 호기성 간균인 백일해균(Bordetella pertussis)이 백일해의 원인으로 보고된 바 있다. 백일해균은 인간을 유일한 숙주로 이용하고, 주로 호흡기를 통하여 감염된다. 또한, 백일해균은 호흡기관 점막에 서식하며, 인체에 질환을 야기시킨다. 1930년대 세포 백일해 백신이 개발되어 백일해 예방 효과가 증명되었다. 또한, 백일해 백신은 1940년대 파상풍 및 디프테리아 불활화 사백신과 혼합하여 사용되었으나 전세포 백일해 백신(whole-cell pertussis vaccine)의 부작용(발작, 부종, 발열 등)이 보고되어, 안전성이 확보된 백일해 백신의 개발이 요구되었다.
1950년대 이르러 백일해균에 의한 발병 기전에 대한 연구가 진행되었고, Pertussis toxin (PT), Filamentous hamagglutinin (FHA), Pertactin (PRN), Fimbriae (FIM) 등과 같은 구성 성분이 항원으로 보고되었다. 그 후 이들 단백질을 분리, 정제한 무세포성 백일해 백신(acellular pertussis vaccine)에 대한 개발이 진행되었고, 1980년대 이후 정제된 백일해 백신이 일본에서 처음으로 개발되어 접종되었다.
백일해 백신 정제의 목적은 PT, FHA, PRN 등의 특정 단백질이 많고 엔도톡신이 없는 제품을 생산하기 위함이다. 전통적으로 황산암모늄 침전법과 밀도 구배 원심분리 방법을 반복하여 항원을 동시 정제하였으나, 이러한 방법은 불순물이 많고 정제공정을 컨트롤하기 어려운 단점이 있다. 다른 방법은 물리, 화학적 방법을 조합하여 각 항원을 개별적으로 정제하는 것이다. 대한민국 공개공보 제2015-0124973호에서는 PT, FHA, 및 FIM 2형 및 3형을 포함하는 무세포 백일해 백신 조성물에 대해 개시하고 있다.
백일해균의 주요 단백질인 PT 및 FHA의 기존 정제 공정은 배양상청액에 함께 존재하는 PT 및 FHA를 일반적인 백신 제재에서 사용하는 방법인 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC) 방법을 이용하여 분리하는 것이다. 그러나, 상기 방법은 scale-up이 힘들고 공정 수율이 낮다. 또한, 3개 또는 4개의 구성요소를 혼합하여 생산하는 백일해 백신 생산 방법은 1개의 구성요소라도 생산성이 떨어질 경우, 생산 배치 수의 증가에 따른 경제적 문제와 더불어 전체 생산기간이 증가하는 문제가 있다.
KR 10-2015-0124973 A
이에, 본 발명자들은 SEC 공정의 문제점들을 해결하고 백일해균 유래 단백질인 PT 및 FHA를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 찾기 위해 연구하던 중, 특정 화합물이 결합한 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 PT 및 FHA 단백질을 분리할 경우 공정에 소요되는 시간과 비용이 크게 감소할 뿐 아니라, 목적 단백질의 생산량도 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 친화성 컬럼을 이용하여 백일해균 유래 단백질인 PT 단백질 또는 FHA 단백질 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 백일해균 유래 단백질인 PT 단백질 또는 FHA 단백질의 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 친화성 크로마토그래피 공정을 거쳐 전처리된 백일해균 배양액 내의 PT 단백질 또는 FHA 단백질 분리 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 멤브레인 크로마토그래피(membrane chromatography, MC) 공정을 거쳐 상기 친화성 크로마토그래피 공정에서 분리된 PT 단백질의 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 PT 단백질 정제 방법을 제공한다.
또한, 멤브레인 크로마토그래피 공정을 거쳐 상기 친화성 크로마토그래피 공정에서 분리된 FHA 단백질의 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 FHA 단백질 정제 방법을 제공한다.
본 발명은 특정 화합물이 결합한 레진으로 충전된 친화성 컬럼의 정제 공정을 통해 백일해균의 PT 및 FHA 단백질을 분리함으로써 PT 및 FHA 단백질의 생산효율을 증가시키는 것이다. 상기 정제 공정을 통해 PT 및 FHA 단백질을 분리하였을 때, SEC 공정을 통한 분리 방법에 비해 PT 단백질의 생산량이 현저히 증가하였으며, 상기 친화성 컬럼을 이용한 PT 단백질 또는 FHA 단백질의 분리 방법은 레진 비용, 공정 시간, 버퍼 사용량 및 생산원가를 감소시켜 PT 단백질 또는 FHA 단백질의 대량 생산에도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 PT 및 FHA 단백질의 전체 공정의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2a는 블루 친화성 컬럼 공정에서 기울기 용출법을 이용한 PT 및 FHA 단백질 분리 공정의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2b는 기울기 용출법을 이용한 PT 및 FHA 단백질의 분리 가능성을 SDS-PAGE 상에 나타낸 것이다.
도 3a는 블루 친화성 컬럼 공정에서 단계적 용출법 (300 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 및 1 M NaCl)을 이용한 PT 및 FHA 단백질 분리 공정의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3b는 단계적 용출법 (300 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 및 1 M NaCl)을 이용한 PT 및 FHA 단백질의 분리 가능성을 SDS-PAGE 상에 나타낸 것이다.
도 4a는 블루 친화성 컬럼 공정에서 단계적 용출법 (300 mM, 400 mM, 850 mM, 및 1 M NaCl)을 이용한 PT 및 FHA 단백질 분리 공정의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4b는 단계적 용출법 (300 mM, 400 mM, 850 mM, 및 1 M NaCl)을 이용한 PT 및 FHA 단백질의 분리 가능성을 SDS-PAGE 상에 나타낸 것이다.
도 5a는 하기 표 1의 DOE (design of experiments)를 가지고 블루 친화성 컬럼 공정을 수행하여 확립한 PT 및 FHA 단백질의 최적의 분리 조건을 이용한 분리 공정의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5b는 하기 표 1의 DOE를 가지고 확립한 PT 및 FHA 단백질의 최적의 분리 조건으로 공정을 수행한 결과를 SDS-PAGE 상에 나타낸 것이다.
본 발명은 일 측면으로, 친화성 크로마토그래피 공정으로 전처리된 백일해균 배양액 내의 PT 및 FHA 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 PT 단백질 또는 FHA 단백질 정제 방법을 제공한다.
이때, 상기 크로마토그래피는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 결합된 레진을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018030289364-pat00001
상기 화합물은 Cibacron Blue 3G-A(sigma-aldrich)일 수 있다. 본 발명에서는, 상기 화합물이 결합한 레진으로 충전된 친화성 컬럼 공정을 "블루 친화성 컬럼 공정" 또는 "블루 친화성 크로마토그래피 공정"이라고도 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, PT 단백질 및 FHA 단백질 분리를 위해 기존에 사용하던 방법인 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC) 대신에 상기 화합물 Cibacron Blue 3G-A를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피 공정을 수행함으로써 배양상청액에 함께 존재하는 PT 및 FHA 단백질을 분리하였다.
또한, 상기 친화성 크로마토그래피 공정은 단계적 용출법(step elution) 또는 기울기 용출법 (gradient elution)에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 기울기 용출법일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 블루 친화성 크로마토그래피 공정에서 PT 및 FHA 단백질을 분리하기 위한 효과적인 공정 방법을 확립하기 위해 단계적 용출법(step elution)과 기울기 용출법(gradient elution)을 통한 PT 및 FHA 단백질 분리 공정을 각각 수행하였다. 그 결과, 기울기 용출법으로 공정을 수행한 경우, SDS-PAGE 상에서 PT 단백질 및 FHA 단백질의 분리가 잘 이루어짐을 확인하였다.
이때, "기울기 용출법"이란 이동상의 조성을 연속적으로 변화시키면서 용리하는 방법을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "단계적 용출법"은 크로마토그래피에서 칼럼 내에 흐르는 용매의 농도나 조성을 변화시켜 용리능을 증가시킨 후 불연속적 변환을 통해 용리하는 방법이다.
상기 기울기 용출법에서 사용되는 용출버퍼는 인산나트륨 용액일 수 있다. 또한, 상기 용출버퍼는 NaCl 용액을 추가로 포함할 수 있고, 상기 NaCl 용액의 농도에 변화를 주어 상기 블루 친화성 크로마토그래피 공정이 수행될 수 있다.
상기 인산나트륨 용액의 농도는 10 mM 내지 500 mM, 20 mM 내지 350 mM, 50 mM 내지 200 mM, 100 mM 내지 150 mM일 수 있으며, 구체적으로는 100 mM일 수 있다. 또한, 상기 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액의 pH는 6.5 내지 8.5, 6.8 내지 8.2, 7.2 내지 7.8, 7.4 내지 7.7일 수 있으며, 구체적으로는 7.6일 수 있다. 또한, 상기 용출버퍼의 양은 15 CV 내지 35 CV, 20 CV 내지 33 CV, 23 CV 내지 30 CV일 수 있으며, 구체적으로는 25 CV일 수 있다. 또한, 상기 크로마토그래피 공정은 NaCl 용액의 농도를 0 M에서 3 M, 0 M에서 2 M, 0 M에서 1 M로 점진적으로 증가시켜 PT 및 FHA 단백질을 각각 용출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, NaCl의 농도를 1 M까지 점차 증가시키며 pH 7.6의 100 mM 인산나트륨 용액을 25 CV 흘려 목적 단백질인 PT 및 FHA를 각각 용출하였으며 이때, PT가 먼저 용출되고 FHA가 이후에 용출되었다.
상기 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제 공정은 상기 기울기 용출법을 이용한 용출 단계 이전에 전처리 과정을 거칠 수 있다. 상기 전처리 과정은 i) 세척하는 단계, ii) 평형버퍼를 이용하여 컬럼을 평형시키는 단계, iii) 목적 단백질들을 포함하는 용액을 컬럼에 흡착시키는 단계, iv) 재평형버퍼를 이용하여 컬럼을 재평형시키는 단계, 및 v) 세척버퍼를 이용하여 컬럼을 세척하는 단계를 통해 수행될 수 있다.
상기 레진이 충전된 컬럼은 NaCl 용액에 의해 세척될 수 있다. 또한, 상기 평형버퍼, 재평형버퍼, 및 세척버퍼는 인산나트륨 용액일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 3 M NaCl 용액으로 컬럼을 세척하였고, 평형버퍼 및 재평형버퍼로서 인산나트륨 용액을 사용하여 컬럼을 평형 및 재평형시켰다. 또한, 세척버퍼로서 인산나트륨 용액을 사용하여 컬럼을 세척하였다.
또한, 본 발명에서 "전처리된 백일해균 배양액"은 1) 백일해균 배양액을 원심분리하는 단계; 2) 수득된 상청액을 수산화 인회석 크로마토그래피(hydroxyapatite, HA)를 통해 정제하는 단계; 및 3) 정제된 상청액을 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC)를 통해 정제하는 단계를 거쳐 수득될 수 있다.
첫 번째로, 백일해균 배양액을 원심분리하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서 "백일해균"은 보르데텔라 파라백일해균이라고도 하며, 그람 음성균인 0.3 내지 1 μm 가량의 소간균이다. 백일해균의 주요 단백질 중 PT는 백일해 독소 (pertussis toxin)의 약어이다. 상기 PT 단백질은 백일해균이 생산하며 생체나 세포에 장애 또는 치사작용을 나타내는 독성물질이다. 또한, FHA는 섬유 헤마글루티닌 부착분자 (filamentous haemagglutinin adhesin)의 약어이며, 백일해를 일으키는 백일해균의 독성인자이다. 상기 PT 단백질 및 FHA 단백질은 기관 상피세포에 접착하는 외막 단백질로서, 백일해균으로부터 수득되며 백일해 백신의 중요한 구성성분이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 백일해 균주를 MSS(modified stainer scholte) 배지에서 35℃의 온도로 배양하고 상기 세포 배양액을 상온에서 2시간 동안 원심분리하여 이로부터 세포가 제거된 배양상청액을 분리 수득하였다.
두 번째로, 수득된 상청액을 수산화 인회석 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계를 수행할 수 있다.
세포 용해물 또는 세포 배양물을 원심분리한 후 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 이용하여 불필요한 세포 잔해물(cell debris) 등을 제거할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 수산화 인회석 크로마토그래피(hydroxyapatite, HA), 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 또는 친화성 크로마토그래피(blue affinity chromatography) 등일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 백일해균 배양액의 전처리를 위한 첫 번째 정제 공정으로 수산화 인회석 크로마토그래피를 수행하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수산화 인회석 크로마토그래피"는 인산칼슘의 결정입자를 분리담체로 한 컬럼크로마토그래피이다. 상기 결정의 표면에는 음전하를 띠는 양전하를 띠는 칼슘원자가 규칙적으로 배치되어 있다. 이들과 적절하게 이온적 상호작용을 할 수 있는 분자표면을 가진 단백질은 컬럼 내 레진에 흡착될 수 있다. 또한, 흡착된 단백질은 인산완충액 등으로 용출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 수산화 인회석 크로마토그래피의 평형버퍼로서 인산나트륨 용액, 세척버퍼로서 인산나트륨 용액, 및 용출버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액을 사용하여 PT 및 FHA 단백질을 용출하였다.
세 번째로, 정제된 상청액을 소수성 상호반응 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 백일해균 배양액의 전처리를 위한 두 번째 정제 공정으로 소수성 상호반응 크로마토그래피를 수행하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "소수성 상호반응 크로마토그래피"는 소수성 기능기를 갖는 지지체(matrix)와 어떤 분자간의 소수성 상호작용을 이용하여 분리하는 방법이다. 지지체는 친수성(hydrophilic)이고 불활성인 아가로오스를 변형시켜 소수성 기능을 갖도록 한다. 알킬아민을 BrCN으로 활성화시킨 아가로오스와 반응시켜 변형된 아가로오스를 이용할 수 있다. 또한, 소수성 상호반응 크로마토그래피는 단백질 분리과정에 많이 이용된다. 또한, 소수성 상호반응 크로마토그래피에서 단백질의 용리를 위해 이온세기를 감소시키거나 pH를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 소수성 상호반응 크로마토그래피의 평형버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액, 세척버퍼로서 인산나트륨 용액, 및 용출버퍼로서 인산나트륨 용액을 사용하여 PT 단백질 및 FHA 단백질이 포함된 용액을 용출하였다.
본 발명은 다른 측면으로, 멤브레인 크로마토그래피(membrane chromatography, MC) 공정을 거쳐 상기 친화성 크로마토그래피 공정에서 분리된 PT 단백질의 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 PT 단백질 정제 방법을 제공한다.
백일해균 유래 단백질인 PT 및 FHA에는 균체내 독소인 엔도톡신(endotoxin)이 포함되어 있다. 따라서, 상기 PT 및 FHA 단백질을 정제하여 백신으로서 활용하기 위해서는 엔도톡신 제거 공정을 진행해야 한다.
상기 엔도톡신 제거는 친화성 크로마토그래피 또는 멤브레인 크로마토그래피 공정에 의해 수행될 수 있으며, 구체적으로는 멤브레인 크로마토그래피 공정에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멤브레인 크로마토그래피"는 단일클론항체(monoclonal antibodies, MAbs) 및 그 밖의 생체분자를 정제하기 위해 사용하는 공정으로서, 평면 형태 및 거대 기공(macroporous)을 가지는 막을 이용하여 확산 대비 대류의 비중이 크고 용액의 분리효율이 높은 편이다. 따라서, 바이러스, 플라스미드, 또는 거대 단백질 복합체 등의 막으로의 접근 및 분리가 용이하다. 상업적으로 구매 가능한 멤브레인 크로마토그래피는 Mustang Q(pall corporation), sartobind Q(sartorius stedim biotech gmbH) 등이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, PT 단백질의 엔도톡신을 제거하기 위한 멤브레인 크로마토그래피 공정으로서 Mustang Q 공정을 수행하였다. Mustang-Q는 소수성 PES(polyethersulfone) 막 기반의 캡슐로, 크로스-링크된 4차 아민기 중합체 코팅을 통해 음전하를 띄는 엔도톡신을 이온 교환으로 제거한다. 상기 Mustang Q 멤브레인 크로마토그래피의 공극 직경이 0.6 μm 내지 1.0 μm, 구체적으로는 0.7 μm 내지 0.9 μm, 보다 구체적으로는 0.8 μm일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 멤브레인 크로마토그래피 공정을 거쳐 상기 블루 친화성 크로마토그래피 공정에서 분리된 FHA 단백질의 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 FHA 단백질 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, FHA 단백질의 엔도톡신을 제거하기 위한 멤브레인 크로마토그래피 공정으로서 Mustang Q 공정을 수행하였다.
상기 Mustang Q 멤브레인 크로마토그래피의 공극 직경이 0.6 μm 내지 1.0 μm, 구체적으로는 0.7 μm 내지 0.9 μm, 보다 구체적으로는 0.8 μm일 수 있다.
상기 PT 및 FHA 단백질의 분리 및 정제 공정은 도 1에 나타내었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 백일해균의 배양
백일해균(국립보건원)을 MSS 배지(입수처)에서 35℃의 온도로 4일 동안 배양하였으며, 배양 기간은 구체적으로 종배양 1일, 1차 증균배양 1일, 2차 증균배양 1일, 및 본배양 1일이 소요되었다.
실시예 2. 원심분리 공정
상기 세포 배양액을 상온에서 2시간 동안 투입 유량을 100 l/h로 하여, 9,500 rpm의 조건으로 연속원심분리하여 배양상청액과 슬러리(slurry)로 분리하였다.
실시예 3. HA 정제
수산화 인회석(hydroxyapatite, HA) 레진(resin)을 증류수를 사용하여 보관 용액을 제거 한 후, 1 M NaOH 용액과 1시간 동안 반응시켜 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 인산나트륨 용액을 이용하여 평형화한 후, 원심분리 공정을 통해 수득한 배양상청액을 HA 레진에 흡착시키고, 평형버퍼를 이용하여 잔여 배양상청액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 인산나트륨 용액을 이용하여 세척을 완료한 다음, 용출버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액을 이용하여 PT 및 FHA 단백질을 용출하였다.
실시예 4. HIC 컬럼 정제
HIC 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 120 cm/hr, 3 CV 흘려 보관 용액을 제거한 후, 1 M NaOH 용액을 40 cm/hr 로 4 CV 흘려 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, HA 정제 공정을 통해 수득한 용출액을 HIC 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 5 CV로 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 세척을 시행하였다. 세척이 완료된 후 인산나트륨 용액을 10 CV로 흘려 PT 및 FHA 단백질을 용출하였다
실시예 5. 블루 친화성 컬럼 정제
실시예 5.1. 기울기 용출법을 통한 정제
Cibacron Blue 3G-A 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 보관 용액을 제거한 후, 3 M NaCl 용액을 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 사용 전 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, 상기 실시예 1.4의 HIC 용출액과 증류수를 1:1로 혼합한 용액을 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 5 CV 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 세척을 실시하였다.
세척이 완료된 후, 기울기 용출법을 진행하였는데 용출버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨 용액을 사용하였다. 이때, NaCl 용액의 농도를 100 mM에서 500 mM로 증가시키며 상기 용액을 10 CV로 흘려 PT 단백질 및 FHA 단백질을 분리하였다. 이때, 레진과의 결합력 차이에 따라 PT 단백질이 먼저 용출되고, 이후에 FHA 단백질이 용출되었다. 이를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
실시예 5.2. 단계적 용출법을 통한 정제
Cibacron Blue 3G-A 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 보관 용액을 제거한 후, 3 M NaCl 용액을 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 사용 전 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, 상기 실시예 1.4의 HIC 용출액과 증류수를 1:1로 혼합한 용액을 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 5 CV 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 세척을 실시하였다.
세척이 완료된 후, 5 단계를 포함하는 단계적 용출법을 진행하였다. 각 단계의 용출버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 pH 7.6의 100 mM 인산나트륨 용액을 사용하였다. 이때, NaCl 용액의 농도는 각 단계에서 300 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 및 1 M을 사용하였고, 상기 용액을 10 CV로 흘려 PT 단백질 및 FHA 단백질을 분리하였다. 이를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 도 3a 및 도 3b에 나타나는 바와 같이, 결합력 차이에 따라 300 mM의 NaCl 농도에서 PT 단백질이 용출되었으며, 400 mM 부터 FHA가 용출됨을 확인하였다.
FHA 단백질이 용출되는 정확한 시점을 확인하기 위해, NaCl 용액의 농도를 달리하여 4 단계를 포함하는 단계적 용출법을 진행하였다. 각 단계에서 NaCl 용액의 농도는 300 mM, 400 mM, 850 mM, 1 M이었고, 이후 과정은 상기와 동일하였다. 이를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 도 4a 및 도 4b에 나타나는 바와 같이, PT 단백질은 여전히 300 mM의 NaCl 농도에서 용출되었고, FHA 단백질은 850 mM의 NaCl 농도에서 용출되었다.
실시예 6. PT 및 FHA의 최적의 분리 조건 확립
기울기 용출법으로 PT 및 FHA의 분리를 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여, 하기 표 1의 DOE(design of experiments)를 세워 small scale에서 정제 공정을 수행하였다.
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7
StdOrder RunOrder 중심점 블록 SP pH CV
1 1 3 1 1 50 7.4 20
2 2 10 1 1 150 7.4 20
3 3 9 1 1 50 7.8 20
4 4 11 1 1 150 7.8 20
5 5 1 1 1 50 7.4 30
6 6 8 1 1 150 7.4 30
7 7 7 1 1 50 7.8 30
8 8 4 1 1 150 7.8 30
9 9 5 0 1 100 7.6 25
10 10 6 0 1 100 7.6 25
11 11 2 0 1 100 7.6 25
Cibacron Blue 3G-A 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 보관 용액을 제거한 후, 3 M NaCl 용액을 60 cm/hr, 3 CV로 흘려 사용 전 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, 상기 실시예 1.4의 HIC 용출액과 증류수를 1:1로 혼합한 용액을 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 5 CV 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 인산나트륨 용액을 5 CV로 흘려 세척을 실시하였다.
세척이 완료된 후, 용출버퍼로서 1 M의 NaCl 용액을 포함하는 pH 7.6의 100 mM 인산나트륨 용액을 사용하여 25 CV에서 기울기 용출법을 진행함으로써 PT 및 FHA를 분리하였다. 이때, 레진과의 결합력 차이에 따라 PT가 먼저 용출되고, 이후에 FHA가 용출되었다. 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
상기 각 조건에 따른 분리 공정을 수행한 결과, 9, 10, 및 11의 조건에서 가장 효과적으로 PT 및 FHA가 분리되었다. 이를 통해, 상기 9, 10, 및 11이 기울기 용출법으로 PT 및 FHA를 분리하기 위한 최적의 조건임을 확인하였다.
실험예 1. 확립된 분리 조건의 scale-up 가능성 확인
상기 실시예 6의 small scale에서 확립한 PT 및 FHA의 최적의 분리 조건이 scale-up의 경우에서도 적용되는지 확인하기 위하여, 상기 조건을 large scale에 적용하여 분리 공정을 수행하였다. 그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.
공정 Batch No. PT 생산량 (mg)
SEC XaP1215 99
XaP1218 110
XaP1220 100
XaP1301 112
XaP1311 106
평균 생산량 - 105
공정 Batch No. PT 생산량 (mg)
Blue Affinity XaP1409 171
XaP1415 162
XaP1417 204
XaP1418 174
XaP1604 197
XaP1605 206
평균 생산량 - 186
표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 상기 small scale에서 확립한 PT 및 FHA 분리 조건을 large scale에 적용하였을 때, SEC 공정을 통해 PT 및 FHA를 분리하였을 때보다 PT 생산량이 약 80% 증가하였다. 이는 small scale에서 확립한 PT 및 FHA 분리 조건이 large scale에서도 적용 가능함을 나타내고, 기존에 사용해온 PT 및 FHA의 분리 방법인 SEC 공정보다 본 발명에 따른 블루 친화성 컬럼 공정이 scale-up 및 공정 수율 면에서 더 효과적임을 의미한다.

Claims (13)

  1. 친화성 크로마토그래피 공정을 이용하여 백일해균 배양액을 포함하는 시료에서 PT(Pertussis toxin) 및 FHA(Filamentous haemagglutinin) 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법으로서, 상기 공정의 용출버퍼가 인산나트륨 용액을 포함하고, 상기 용출버퍼가 NaCl 용액을 추가로 포함하되, 상기 NaCl 용액의 농도가 0 M에서 3 M로 점진적으로 증가하며, 상기 크로마토그래피 공정이 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 결합된 레진을 이용하는 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112021120031217-pat00012
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 NaCl 용액의 농도가 0 M에서 1 M로 점진적으로 증가하는 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인산나트륨 용액의 pH가 6.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인산나트륨 용액의 농도가 50 mM 내지 200 mM인 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 용출버퍼의 양이 15 CV 내지 35 CV인 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피 공정 이전에 하기 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, PT 단백질 또는 FHA 단백질 수득 방법:
    1) 백일해균 배양액을 원심분리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 수득된 상청액을 수산화 인회석 크로마토그래피(hydroxyapatite, HA)를 통해 정제하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 정제된 상청액을 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC)를 통해 정제하는 단계.
  10. 제1항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 수득한 PT 단백질을 멤브레인 크로마토그래피(membrane chromatography, MC) 공정을 거쳐 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 PT 단백질 정제 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 크로마토그래피의 공극 직경이 0.6 μm 내지 1.0 μm인 것을 특징으로 하는, PT 단백질 정제 방법.
  12. 제1항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 수득한 FHA 단백질을 멤브레인 크로마토그래피(membrane chromatography, MC) 공정을 거쳐 엔도톡신을 제거하는 단계를 포함하는 FHA 단백질 정제 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 크로마토그래피의 공극 직경이 0.6 μm 내지 1.0 μm인 것을 특징으로 하는, FHA 단백질 정제 방법.
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