JPH01141593A - ウロキナーゼの回収方法及びそれにより得られるウロキナーゼ含有画分 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、利用分野 本発明はウロキナーゼの回収方法に関する。

ロ、従来技術 ウロキナーゼは人尿および腎細胞の組織培養液中に存在
する酵素であり、人血漿中に含まれるプラスミノーゲン
を賦活化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生
成する機能がある。この故にウロキナーゼは人尿等から
捕集して精製され、各種血栓症や心筋梗塞症等の治療に
広く臨床使用されている。のみならず、最近においては
制癌剤と併用することにより、制癌剤の薬効を向上せし
めることが知られている。しかも、ウロキナーゼは人間
の尿または腎細胞の組織培養液からの抽出精製物である
から、抗原性を有さないため、抗原抗体反応による副作
用がなく、広く賞月されている。

ところで、ヒト尿などにはウロキナーゼがごく微量にし
か含まれていないので、効率よくつ「１キナーゼを分離
、濃縮、精製することが困難である。

たとえば、従来から繁用されている硅酸塩、珪藻土など
の鉱物を尿自体に接触させてウロキナーゼを吸着、溶出
する方法、種々のイオン交換クロマトグラフィーによっ
て回収する方法においては操作性が繁雑であり、−度に
処理出来る尿も限られているため、微量成分であるつ「
１キナーゼを多量に回収するにはコスト高になるという
問題点がある。

ハ１本発明が解決しようとする問題点 通常の限夕）濾過膜による濃縮回収では、ウロキナーゼ
の一部が■々に取り込まれ、回収率が悪く（４０−５０
％）、精製は伴わない。

すなわち、具体的には以下のような問題が挙げられる。

（１）膜は蛋白（ウロキナーゼ）を吸着する性質があり
、そのままでは、収量が大幅に低下する。

収量をあげるには、ｐ　Ｈを１０〜・１１に調整したり
、吸着阻害剤を添加する等の前処理が必要。

（２）濃縮するＧごしたがって、蛋白の濁りを生じ、次
工程のトラブル原囚となる為、遠心又は、ろ過工程をい
れて、濁りをろ過してやる必要がある。

（３）濁りの多い原料尿使用の時は、水酸化すｌ・リウ
ム処理等の前処理をおこない、前もって濁りを除去して
やらねばならない。

（４）尿から数種類の蛋白を製造する場合、分子量の接
近した蛋白分子の分離（ウロキナーゼとコロニー形成刺
激因子またはカリクレインなど）は、この工程では困難
で、次工程にクロマトを用いることで、始めて可能とな
る。しか１７、それは液状のままで蛋白を長時間置くこ
ととなり、その間の失活等が考えられる。

そこで、犀中から効率良くウロキナーゼを回収するため
の処理方法を検小１したところ、アルカリ処理したポリ
アクリロニトリル系限外濾過膜を用いることにより、蒸
成からウロキナーゼの濃縮・精製が一度に行い・うろこ
とを見出１−１本発明を完成した。

二６問題点を解決するための手段 本発明の原料である尿（原尿中）には、ウロキナーゼは
１〜ｌ０ＩＵ／ｍ１程度含有されている。

担体となる限外濾過膜はポリアクリロニトリル系で、分
画分子種１万〜５万程度であることが好ましい。以下、
本発明に使用できる商品名の具体例を挙げる。

ダイセル化学玉業■ＨＤ［ＪＹ−Ｈ（、Ｗ半分画分子量
１万）　、ＤｕＹ−１同２万）　、ＤＩＩＹ−Ｍ（同４
万）、円、Ｓ−１１Ａ１０９０　（同１万）　、ＰＬＳ
−ＭΔ（同２万）、Ｐｌ、Ｓ〜ＬＡ１０９０　（同４万
） ミリポア社：　ＰＴＧＣ（同１万）　、Ｉ’ＴＴＫ　（
同３万）アミコン社：　ＨＩＰＩＯ（同１万）　、ＨＩ
Ｐ３０（同３万）、旧！”５０　（同５万）、旧×５０
（同５万）　、Ｈ３Ｐ１０（同１万）　、１Ｉ５Ｐ３０
（同３万）　、Ｈ３Ｐ５０（同５万）　、ｌｌｌ０ＰＩ
Ｏ（同１万）　、Ｈ１０Ｘ５０　（同５万）ロミコン社
：　ＰＭＩＯ（同１万）　、ＸＭ５０　（同５万）など
が挙げられる。

特に、アクリロニトリルとビニルピロリドンの共重合体
からなるポリアクリロニトリル系限外濾過膜を用いるこ
とが好ましい。

このものは以下のような化学構造を有する。

この限外濾過膜をアルカリで処理する。アルカリとして
は、０．１〜ＩＮ程度の水酸化物（ｐ）１１０〜１３程
度）が好ましく、より好ましくは水酸化ナトリウムを用
いる。

その調製方法としては、限外濾過膜をアルカリ溶液で１
０〜６０分間循環させた後に１０〜２０時間静置し、次
いで冷精製水で洗浄した後に蒸成を循環させる。これを
数回（り返ずことが好ましい。

こうして調製した限外濾過膜を用いて蒸成を処理する。

蒸成を１１１６〜８に調整し、限外濾過膜に接触させ、
限外濾過膜により濃縮する。その条件としては、プリー
ツ型モジュールで操作圧１〜５ｋｇ、／ｃｄ程度が好ま
しい。この時、原尿中のウロキナーゼが吸着する。

濃縮液はｐＨ６〜８、低イオン強度（例えば、０．０１
〜０．１Ｍ程度）の条件下で押し出せば、ＵＫ基以外尿
蛋白（例えば、コロニー形成刺激因子、カリクレインな
ど）を回収することも可能である。

濃縮液（未吸着液）を除去した後、所望により当該膜を
ｐ（（６〜８、低イオン強度（例えば０．００５〜０．
０５Ｍ程度）の条件下で洗浄した後、ｐＨ６〜８、イオ
ン強度０．０５〜０．３Ｍ程度、好ましくは０．２〜０
．３回程度の条件下で、膜に吸着していたつに１キナー
ゼを前記した濃縮時の操作圧と同程度で押し出しながら
、または落差圧で透過側へ（すなわち、膜を透過して）
溶出させる。

かくして精製されたウロキナーゼの溶出液は常法により
脱塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医薬品として使用
できるウロキナーゼとすることができる。

ホ２効果 本発明の方法により （１）　　ウロキナーゼ吸着のための尿処理は不要（２
）　　限外濾過膜濃縮液を押し出すだけで他の尿蛋白と
分離が簡単にできる （３）　　ウロキナーゼの濃縮と精製が一度にできる （４）　　限外濾過膜濃縮液は少量となっているので、
精製し、他の蛋白取得等多目的に使える（５）　　濁り
、エンドトキシンおよび菌を除去できる （６）　　結果としてウロキナーゼの収−量、比活性は
向上し、製造時間は短縮できる。

などの助平かある。

従って、簡単な操作によってウロキナーゼを微量しか含
有せず、かつ多量に不純物を含む尿から高能率、高純度
、低コストでウロキナーゼを精製することができる。

へ、実験例・実施例 本発明をより詳細に説明するために実験例および実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

実験例 本発明法と従来法により回収したウロキナーゼ両分中の
生菌数およびエンドトキシン含有の有無を比較した（第
１表）。

本発明法は、実施例に準じて行った。

従来法は、実施例において、膜に吸着したウロキナーゼ
を押し出し操作を行うことなく（即ち、膜を透過させず
に）濃縮側へ溶出させた。

生菌数は、寒天培地にッスイ製又は栄研製）を使用し１
．Ｊ　Ｉ　Ｓ規格の方法により、エンドトキシンはリム
ラス反応により測定した。

第　　１　　表 実施例１ 蒸圧をｐＨ６，０に調整し、参考例により調製したプリ
ーツ型ポリアクリロニトリル系限外濾過膜（分画分子量
２万、ダイセル■製）を用いて濃縮した後、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で押し出すことにより濃縮
液を除去した。膜を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で洗浄した後に０．２５Ｍ硫酸アンモニウムを用い
て落差圧でウロキナーゼを透過側へ溶出した。第２表に
示す値を得た。

第２表 参考例 プリーツ型ポリアクリロニトリル系限外ろ過膜（分画分
子量２万、ダイセルＱ１製）に０．５Ｎ水酸化ナトリウ
ムを３０分間循環させた後に１０時間静置し、冷精製水
で洗浄し、蒸圧を循環する。これを５回くり返した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルカリ処理したポリアクリロニトリル系限外濾過膜に
   原尿を接触させ、限外濾過による濃縮を行うことにより
   尿中のウロキナーゼを膜に吸着させた後に濃縮液（未吸
   着液）を除去し、次に膜に吸着したウロキナーゼを膜を
   透過して溶出させることを特徴とするウロキナーゼの回
   収方法。