KR930008097B1

KR930008097B1 - 콜로니 형성 자극 인자의 정제방법

Info

Publication number: KR930008097B1
Application number: KR1019860008679A
Authority: KR
Inventors: 가주오 모리모도; 요시아끼 가와바다; 다께히꼬 가와노; 마사유끼 니시다
Original assignee: 가부시끼가이샤 미도리쥬지; 마쯔시다 렌조오; 모리나가뉴교 가부시끼가이샤; 오오노 아끼라
Priority date: 1985-10-18
Filing date: 1986-10-16
Publication date: 1993-08-25
Also published as: KR870004055A; JPH0535160B2; CN86107102A; JPS6293238A

Abstract

내용 없음.

Description

콜로니 형성 자극 인자의 정제방법

제 1 도는 음이온 교환기를 갖는 시트상 소재를 소용돌이상으로 감은 구조물의 개략도이고,

제 2 도는 상기 구조물의 횡단면도이며,

제 3 도는 시트상 소재를 소용돌이상으로 감은 태양의 음이온 교환체의 한 실시예의 수직단면도이고,

제 4 도는 이의 횡단면도이다.

본 발명의 인뇨(人尿)유도된 콜로니 형성 자극인자(이하, CSF로 명명함) 함유액으로부터 고순도 및 고수율로 CSF를 회수하는 방법에 관한 것이다.

CSF는 인뇨중에 극히 미량으로 존재하는 생리활성물질로서, 골수중 전구세포에 작용하여 백혈구 구성 세포의 과립구(顆粒球) 및 단구-대식 세포의 분화, 증식을 촉진하는 당단백이며, 백혈구 감소증 치료제로서의 약효가 기대되고 있다.

CSF의 정제 방법으로서는, 흡착제를 사용하는 방법, 음이온 교환체를 사용하는방법, 한외여과막을 사용하는 방법 등이 있다.

그런데, 인뇨중에는 CSF가 극히 미량 함유되어 있기 때문에, 고효율로 CSF를 분리, 농축, 정제하는 것이 곤란하다. 예를들면, 종래부터 자주 사용된 규산염, 구조토 등의 광물을 뇨 자체에 접촉시켜, CSF를 흡착, 용출하는 방법, 여러 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 회수하는 방법에 있어서는 조작성이 복잡하고, 한번에 처리할 수 있는 뇨도 한정되어 있기 때문에, 미량성분인 CSF를 다량으로 회수하는 것은 비용이 많이 든다는 결점이 있다.

즉, 예를들면, 여러 음이온 교환체에 의한 크로마토그라피에 있어서, 칼럼법일 경우 칼럼에의 흡착제 충진이나, 배치법일 경우, 여과 또는 원심 등에 의한 흡착제 회수 등 조작성이 복잡하여, 공업적 규모일 경우 고효율로 CSF를 수득하는 방법으로서는 바람직하지 않다.

또한 뇨중에는 다량의 불순물이 존재하지만, 종래 방법에서는 이들의 CSF와 함께 회수되기 쉽기 때문에, 그후의 정제에 있어서 바람직하지 않다.

따라서, 본 발명은 뇨 등의, CSF을 미량 밖에는 함유하지 않고, 또한 다량의 불순물을 함유하는 용액으로부터 고수율, 고순도, 저비용으로, 특히 간단한 조작으로 CSF를 회수, 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은, 인뇨 유도된 콜로니 형성 자극 인자를 함유하는 용액에 대하여, 셀룰로우즈를 모체로 하는 시트상 소재를 소용돌이상으로 감은 구조물로서 카트리지 형식으로 된 음이온 교환체를 사용하여 처리함을 특징으로 하는, 인뇨 유도된 콜로니 형성 자극 인자의 정제 방법에 의해 달성된다.

본 발명에서 사용하는, CSF 함유 용액은 CSF 수용액으로만 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를들면, 뇨등과 같이 CSF 함량이 미량이고, 또한 다량의 불순물을 함유하는 것도 적절하다.

음이온 교환체로서는, 예를들면 DEAE-세파댁스, QAE-세파댁스, DEAE-셀룰로우즈, QAE-셀룰로우즈, DEAE-세팔로우즈, DEAE-세파셀, 스페로실-DEA 등을 들 수 있지만, 음이온 교환기를 갖는 셀룰로우즈를 모체로 하는 시트상 소재를 소용돌이상으로 감은 구조물로서 카트리지 형식으로 된 것이 바람직하다.

상기 구조물은,통상 담체(예를들면 셀룰로우즈, 댁스트란, 아가로우즈)를 비닐중합체로 가교시켜, 여기에 이온 교환기로서, QAE-기, DEAE-기, 트리에틸아미노에틸(TAEA)기, 아미노에틸(AE)기, 구아니드에틸(GE)기등을 도입한 것(이온 교환 매트릭스, 제 1 도 참조)을 소용돌이상으로 한 것이다. 이의 바람직한 한 태양은 제 2 도에 나타낸 것과 같은데, 제 2 도에서 (1)은 이온 교환 매트릭스(층두께 : 0.1 내지 1mm), (2)는 수투과성 지지체(층두께 : 0.1 내지 1mm)를 나타낸다. 당해 지지체는, 예를들면 격자상, 직물상인 것이 바람직하고, 그 재료로서는, 예를들면 폴리스티렌, 나일론, 폴리카보네이트, 폴리아세탈,테프론, 스테인레스 등이 사용된다.

제 3 도는 당해 구조물을 사용하는 정제방법의 한 실시예의 단면도인데. 입구(3)에서 들어온 CSF 액은 외부주변으로부터 안쪽을 향하여 중앙 코어(4)에 모아지고 출구(5)를 통해 나간다. 화살표는 CSF 액의 흐름을 나타낸다. (6)은 배출구, (7)은 배수구를 나타낸다. 제 4 도는 횡단면도인데, 외부 주변으로부터 들어온 CSF 액이 코어에 모아지는 상태를 나타낸 것이다.

이것을 사용하는 조건으로서는, 예를들면 CSF 함유용액을 pH 5 내지 7, 전도도 20mS/cm(25℃) 이하로 카트리지를 통해 CSF를 흡착시키는 것이 바람직하고, 이 조건에서 CSF는 흡착되고, 대부분의 불순물은 흡착되지 않고 그대로 통과한다. 그후, pH 5 내지 7의 희박 염용액[예를들면, 전도도 20mS/cm(25℃) 이하의 인산완충액]으로 세정한다. 이러한 세정 조작에 따라 또한 불순물은 제거되지만, CSF는 흡착된 대로 남는다.

흡착된 CSF를 용출시키기 위해서는, pH 5 내지 9의 농염용액[예를들면, 전도도 30mS/cm(25℃) 이상의 인산완충액, 식염용액]을 통과시켜 용이하게 수행할 수있다.

본 발명에 있어서는, 또한 한외여과막에 의한 처리를 조합시키는 것이 바람직하다. 이러한 한외여과막에 의한 처리는 상기 음이온 교환체에 의한 처리를 하기전에 수행한다.

한외여과막으로서는 CSF보다 저분자물질을 제거하는 것(즉, 저분자측 분자량 분획용)과 CSF보다 고분자 물질을 제거하는 것(즉, 고분자측 분자량 분획용)중의 하나 또는 둘다를 사용하는 것이 바람직하고, 저분자측 분자량 분획용으로서는 통상 1×10⁴내지 4×10⁴dalton의 한외여과막을, 또한 고분자측 분자량 분획용으로서는 통상적으로 10⁵내지 10⁶dalton의 한외여과막을 사용한다. 한외여과막으로서는 폴리아크릴니트릴계 한외여과막, 폴리설폰계 한외여과막, 셀룰로우즈계 한외여과막 등을 들 수 있다.

CSF 함유용액을 한외여과막에 통과시킬 경우의 조건은 일반적으로 처리용액의 pH는 5 내지 8이고 조작 압력은 1 내지 5kg/cm²이다.

본 발명에서 한외여과막에 의한 처리는 CSF의 회수, 제조의 임의의 공정으로 행해도 되지만, 먼저 저분자측 분자량 분획용 여과막으로써 처리하고, 그후 고분자측 분자량 분획용 여과막으로써 처리하는 것이 바람직하다.

이와 같이 회수된 CSF는, 바람직하게는 또한 그 자체 공지된 고도 정제 수단[예를들면, 친화(affinity)크로마토그라피, 겔여과 등], 가열(예를들면, 50 내지 80℃, 1 내지 10시간)멸균 처리한 후, 동결건조시켜 의료용 CSF 제제로 할 수 있다. 물론. 동결건조시키지 않고, 공지의 수단으로 단리, 정제시킬 수도 있다.

본 발명에 의해 CSF를 고순도 및 고수율로 회수할 수 있다. 또한, 비(比) 활성이 높고, 발열성 물질을 제거한 CSF를 수득할 수 있다. 또한, 종래방법과 비교할 경우, 용이하고 효율적이며 우수한 조작성, 경제성을 갖는다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해서 하기에 실시예를 들지만, 본 발명은 이에 의해 한정되지는 않는다.

[실시예 1]

신선한 뇨 50ℓ를 폴리아크릴로니트릴계 한외여과막(분획분자량 20.000카트)를 사용하여, 저분자측 불순물을 제거함과 동시에 1ℓ까지 농축시킨다.

그 후 이 농축액을, 미리 0.05M 인산 완충액 (pH 6.5)[전도도 8.5mS/cm(25℃)]으로 평형화시킨 Zetaprep QAE-카트리지 R 250((AMF사 제품)에 통과시켜 CSF를 흡착시킨다.

그후, 이러한 QAE-카트리지를 0,05M 인산 완충액(pH 6.5)으로 충분히 세정시킨 후, 1.0M NaCl 함유 0.05M 인산 완충액(pH 6.5)[전도도 85mS/cm(25℃)]으로 용출시켜 CSF를 함유한 용출액을 수득한다. 또한, 이와는 별도로 비교 대조로서 신선한 뇨 50ℓ를 4배 희석한 다음, 0.05M 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화시킨 DEAE-셀룰로우즈 100g을 가하고, 1시간 교반흡착시켜. 상기와 마찬가지로 세정, 용출시켜 CSF 함유 용출액을 수득한다.

이 용출액에 대해서, 각각 CSF 활성을 측정하고, 비활성 및 회수율을 구하여, 표 1-1 및 표 1-2에 나타낸다.

또한, CSF 활성은 C57BL/6N 마우스 골수세포를 사용하여 단층한천 평판법에 의한 콜로니 형성법으로 측정한다. 즉, 시료를 2용적 % 소혈청 함유 증류수로 적절히 희석시켜, 제균여과(0.45μ 멘블렌 여과기)한후, 3매의 샤알레에 0.1ml씩 분리주입시키고 여기에 0.3중량% 한천, 20용적% 소 태아 혈청 및 C 57BL/6N 마우스 골수세포 10⁵개를 함유하는 멕코이(McCoy) 5A 배지 1ml를 가하여 충분히 혼화시킨 후, 37℃ 7.5용적% 탄산가스 통기하에 부란기에서 7일 동안 배양시킨다. 배양후, 현미경으로 볼 경우 50개 이상의 세포로 된 덩어리를 콜로니로 하여, 형성된 콜로니수를 측정하고, 형성된 콜로니 수(단위)로 CSF 활성을 나타낸다. 즉, CSF 활성, 1단위를 1형성 콜로니로 한다.

표 1-1 및 1-2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 종래 방법과 비교할 경우, 회수율은 같은 정도이지만, 비활성(순도)은 한외여과막에 의해 정제하여 불순물을 미리 제거함으로써 십수배 상승한다.

또한, 종래 방법이 흡착시, 희석에 따른 전도도 조정을 위해 약량이 증가하는 것에 반해, 본 발명의 방법은 전처리로서 한외여과막에 의한 정제를 도입함으로써 액량이 소량화 되는 것과 동시에 전도도 조정도 간단하게 수행하여, 이후의 음이온 교환체에 의한 처리도 조작성이 향상되어 작업효율도 개선할 수 있다. 또한 카트리지 형식의 방법을 도입하여, 음이온 교환체에 의한 크로마토그라피시의 작업성을 향상시킬 수 있다.

[표 1-1] : 본 발명

[표 1-2] : 종래방법

[실시예 2]

CSF 함유용액 4000ml를 평막상 폴리설폰계 한외여과막(분획분자량 1,000,000카트)을 사용하여, 막에 의해 분리시킨다. 용액 4,000ml를 순환여과 시키는데 필요한 시간은 30분이다.

그후, 실시예 1과 마찬가지로 하여 QAE-카트리지에 의해 이온교환 크라마토그라피를 수행한다.

여과전액, 여과후액, QAE-카트리지 용출액에 대해 실시예 1의 방법으로 CSF 활성을 측정하고, 총활성, 비활성, 회수율을 구한다. 또한 제 9 차개정 일본 약전에 따라,토끼에 의한 발열성 물질 제거 효과를 측정한다. 이 측정 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이 고회수율로 CSF 가 회수되고, 비활성(순도)도 상승한다. 또한, CSF에 관해서는, 한외여과막에 의해 저해물질을 제거할 수 있으며 활성이 상승된다.

또한, 발열성 물질의 제거에서도 현저한 효과가 나타난다.

[표 2]

Claims

인뇨(人尿) 유도된 콜로니 형성 자극인자를 함유하는 용액에 대하여, 음이온 교환체를 사용하여 처리하는 인뇨 유도된 콜로니 형성 자극인자의 정제방법에 있어서, 셀룰로우즈 모체로 한 시트상 소재를 소용돌이상으로 감은 구조물로서 카트리지 형식으로 된 음이온 교환체와 콜로니 형성 자극인자로부터 저분자 물질 및 고분자 물질중의 적어도 하나를 배제할 수 있는 한외여과막을 사용하여 처리함을 특징으로 하는, 인뇨 유도된 콜로니 형성 자극인자의 정제방법.