HU222087B1 - Eljárás vírus-inaktivált VIII faktort tartalmazó frakciók előállítására, kromatográfiás módszerrel - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás VIII-as faktort tartalmazó vírusinaktiváltfrakció előállítására kromatográfiás módszerek alkalmazásával, amelysorán oldott krioprecipitátumból vagy vérplazmából indulnak ki, eztadott esetben alumí- nium-hidroxidos kezelésnek vetik alá, a frakciótegy di- vagy trialkil-foszfáttal és nemionos tenziddel kezelve vírus-inaktiválásnak vetik alá, majd legalább egy elválasztási lépéstalkalmaznak porózus hidrofil polimer poli(glicidil-- metakrilát)- vagyhidrofilizált polisztirolmembránokon vagy kompakt lemezeken végzettmembránkromatográfiával. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás VIII-as faktort tartalmazó vírusinaktivált frakció előállítására, kromatográfiás módszerek alkalmazásával, valamint a találmány szerinti eljárással előállított VIII-as faktort tartalmazó frakció.

A VIII-as faktor egy életfontosságú anyag, amely fontos szerepet játszik a véralvadásban. A véralvadási rendellenességeket tehát a VIII-as faktor beadásával lehet kezelni. Ennélfogva nagy az igény a beadható VIIIas faktor készítményekre. Nagyszámú kísérletet tettek a VIII-as faktor erősen dúsított formában való izolálására, természetes forrásokból. Tehát már ismertek a kromatográfiás módszerek, amelyekkel a VIII-as faktort krioprecipitátumokból izolálni lehet. Ez utóbbi egy olyan frakció, amelyet plazmának hidegben való kezelésével lehet előállítani. Az EP 367 840 Bl szabadalmi bejelentésben kromatográfiás módszert írnak le a VIIIas faktor vérplazmából való előállítására, előzetes krioprecipitáció nélkül. A VIII-as faktort tartalmazó frakciót kromatográfiás módszerrel választják el hidrofil kromatográfiás tölteten, amelyet ioncserélő csoportokkal módosítottak. Az EP 0 238 701 szabadalmi bejelentésben egy ultratiszta, fertőző antihemofíliás faktor előállítását írják le, ahol is az előkezelt frakciók fibrinogéntől, globulintól, albuminoktól és egyéb interferáló adalékoktól etanolos kicsapással megszabadított krioprecipitátumok. Az EP 108 458 számú európai szabadalmi bejelentésben kromatográfiás elválasztást írnak le, ioncserélőkkel, a krioprecipitátum-frakció vírusinaktiválása után. Az EP 0 173 242 A szabadalmi bejelentésben leírnak egy módszert VIII-as faktor készítmények előállítására kromatográfiás módszerekkel ioncserélő anyagokon, amelyek tisztán szénhidrátalapúak, és a szénhidrátalapot DEAE-csoportok módosítják. Pontosabban, a DEAE Sepharose-ról és a DEAE-cellulózról írták le, hogy jól használhatók. A GB-A-1,178,958 számú szabadalmi bejelentésben a VIII-as faktor ECTEOLA-cellulóz oszlopos tisztítását írják le. A módosított cellulóz bázikus szubsztituenseket tartalmaz, amelyeket epiklórhidrinnel és trietanol-aminnal való reakcióval visznek be. Az előzőkben említett szakmai előzményekben a kromatográfiás elválasztást vagy batch folyamatok formájában alkalmazzák, vagy oszlopkromatográfiás módszerekkel. Jóllehet meglehetősen jó eredmények kaphatók ezekkel a módszerekkel, azért még kívánatos marad gazdasági és etikai okokból, hogy fokozzuk a biológiailag értékes VIII-as faktor kitermelését.

így a jelen találmányt alátámasztó technikai probléma abban áll, hogy egy olyan eljárásra van szükség, amely a szakterületen összegyűlt ismeretekből kiindulva lehetővé teszi a VIII-as faktor javított előállítását, mind a kitermelés, mind a biológiai aktivitás szempontjából.

Meglepő módon, a problémát egy olyan eljárással lehet megoldani, amely egy krioprecipitátumból vagy vérplazmából indul ki, adott esetben követi egy alumínium-hidroxid-kezelés, majd egy elválasztási lépést alkalmazunk, amely membránkromatográfiát jelent a krioprecipitátum feloldása után.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy oldott krioprecipitátumból vagy vérplazmából indulunk ki, ezt adott esetben alumínium-hidroxidos kezelésnek vetjük alá, a frakciót egy di- vagy trialkil-foszfáttal és nemionos tenziddel kezelve vírusinaktiválásnak vetjük alá, majd legalább egy elválasztási lépést alkalmazunk porózus hidrofil polimer poli(glicidil-metakrilát)- vagy hidrofilizált polisztirolmembránokon vagy kompakt lemezeken végzett membránkromatográfiával.

A találmány szerinti eljárást kereskedelmi forgalomban levő krioprecipitátummal vagy vérplazmával lehet végrehajtani. A megolvasztott krioprecipitátumot alumínium-hidroxiddal kezeljük a minta további tisztításához, azért, hogy előtöményítsük a VIII-as faktort.

Előnyös módon egy vírusinaktiválást végzünk az aktuális kromatográfiás tisztítás előtt, a membránban vagy a membránon található anyagokkal. Ezt a vírusinaktiválást az EP 131 740 Al bejelentésben ismertetett módszer szerint végezzük, biokompatibilis szerves oldószerekkel (detergens), Triton Χ-100/TNBP-vel, előnyösen Tween/TNBP-vel (tri-n-butil-foszfát). Jó eredmények érhetők el nátrium-kolát/TNBP kombinációval is. A további vírusinaktiválást elvégezhetjük azonban a membránkromatográfiával végzett elválasztás után is.

A mintában levő VIII-as faktor tisztítására végzett kromatográfiás elválasztási lépést végezhetjük olyan alapanyagokon is, amelyeket ioncserélő csoportokkal módosítottunk, főleg anioncserélőkkel, vagy immunaffinitási ligandumokkal módosított anyagokkal. Kritikus feltétel, hogy az említett anyagoknak membránokra rendeződve kell lenniük. Ezeket az anyagokat előnyösen egy alapanyagból készítjük, azaz például módosított cellulózból vagy műanyag szálból. Különösen jól használhatók azok a membránok, valamint kompakt korongok, amelyeket porózus poli(glicidil-metakrilát)-okból és/vagy egyéb porózus hidrofil polimerekből készítünk, amelyeknek a szerkezete hasonlít a hidrofilezett polisztiroléra.

Az első esetben egy elválasztásra alkalmas membrán vagy cellulóz-, illetve műanyag szálból készült, egymás mellé helyezett vékony filmrétegekből áll, vagy a második esetben kompakt korongokból áll, amelyek szilikagélből vagy polimer hordozókból állnak. A membránok vagy korongok alapanyagait megfelelő anioncserélő csoportokkal vagy immunaffinitás-ligandumokkal látjuk el. Főleg az anioncserélő csoportokat, azaz például a kvatemer aminokat vagy dietil-amino-etil-csoportokat tekintik ioncserélő csoportoknak. A megfelelő kationcserélők elvileg gyengén és erősen savas kationcserélők, azaz olyan anyagok, amelyeket szulfonsavvagy foszforsavcsoportokkal módosítottak.

Az ioncserélő csoportok hozzáköthetők az alapanyagszálakhoz, egy úgynevezett spacerrel vagy anélkül. A spacerekkel ellátott anyagokra úgy is hivatkoznak, mint „letapogató” anyagokra. A DE 42 04 694 számú szabadalmi bejelentésben említik a megfelelő spacereket és ligandumokat. Például egy glükózamincsoport szolgálhat spacerként is. Az anioncserélő csoportok, úgymint a DEAE vagy a kvatemer aminok is hozzáköthetők a porózus poli(glicidil-metakrilát)-ból készült membránokhoz vagy egyéb említett anyagokhoz. Az anioncserélő csoportok kötődése vagy közvetle2

HU 222 087 Bl nül történik a membránt alkotó anyaghoz, vagy egy spaceren keresztül, például egy glükózamincsoporton keresztül.

A találmány egyéb megvalósítási módja szerint a VlII-as faktorhoz nagy affinitással rendelkező immobilizált anyagokkal végzett affinitás-membránkromatográfiát alkalmazunk. Pontosabban, a monoklonális és/vagy poliklonális ellenanyagok, vagy az ellenanyagok VlII-as faktort kötő fragmensei felelnek meg (immunaffinitás-membránkromatográfia). Az ellenanyagok előnyösen emberekből vagy egerekből származnak.

A VlII-as faktorhoz affinitással rendelkező anyagokat a hordozóra immobilizáljuk, kémiailag reakcióképes anyagokat alkalmazva. Előnyösen a reaktív csoport inkább a spacer végén támad, mint közvetlenül a hordozóanyagon. A VlII-as faktorhoz való anyagok immobilizálása a reaktív csoportokon, azaz például a tozil-, trezil-, hidrazid- és egyéb csoportokon keresztül történik meg. A megfelelő eljárások a következő publikációból ismertek: T. M. Phillips „Affinity chromatography”, in „Chromatography”, szerk.: E. Heftmann, 5. kiadás, Elsevier, Amsterdam (1992).

Az ellenanyagokat előadszorbeáltathatjuk protein A vagy protein G ligandumokat hordozó membránokra. Az ezt követő kovalens keresztkötéssel megelőzhetjük az ellenanyagok eluálódását (leoldódás az oszlopról). Az ellenanyagoknak a protein A vagy protein G membránokhoz való keresztkötéséhez hasonló eljárás alkalmazható, mint a laza hordozókhoz. A protein Anál vagy protein G-nél végzett immobilizációnak előnye, hogy az ellenanyagok kizárólag a molekulának a konstans szegmenséhez (Fc) immobilizálódnak. így tehát az antigénkötő rész (Fab) szabad marad, és a VlIIas faktorral való kölcsönhatását semmi nem gátolja.

Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint olyan anyagokat alkalmazunk a VlU-as faktor elválasztására, amelyek képesek biztosítani egy hidrofób kölcsönhatást. A hidrofób kölcsönhatás biztosítására használható anyagok közé tartoznak előnyösen azok, amelyeknek állítható hidrofobicitásuk van. A hidrofobicitást úgy állíthatjuk be, hogy poláris csoportokat, azaz például protikus és aprotikus poláris csoportokat, úgymint hidroxi-, amino-, cianocsoportokat viszünk be. Előnyösen a szükséges elválasztási körülményeknek megfelelően adaptáljuk.

A vírus inaktiválása elvégezhető hőkezeléssel is. A VlII-as faktort tartalmazó eluált mintát előnyösen pasztörizálási lépésnek vetjük alá, az első membránkromatográfiás lépést követően. Egy megfelelő eljárást a P 43 18 435.9 számú leírásban közölnek. Ebben a VlII-as faktorban dúsított frakciót di- vagy trialkil-foszfátokkal hozzák érintkezésbe, valamint adott esetben nedvesítő ágensekkel stabilizáló ágensek jelenlétében, és ezzel egy időben vagy ez után 5-30 óra hosszat magasabb hőmérsékleten, azaz 55-67 °C-on tartjuk. Előnyös lehet a két vírusinaktiválási módszer, azaz a detergenssel és a hővel való kezelés kombinációja.

Ahhoz, hogy eltávolítsuk a pasztörizálási lépésben alkalmazott vegyszereket, egy második membránkromatográfia alkalmazható. A hozzáadott stabilizáló ágens elválasztása előnyösen DEAE-lel vagy kvatemer ammóniumvegyületekkel módosított membránnal végezhető el, amelyeket a kromatográfiás hordozó felszínén egy spaceren keresztül rendeztek el. Emellett lehetséges az is, hogy a megfelelő ligandumokat a hordozó felszínén rendezzük el, spacer nélkül. A stabilizáló ágenseket a választott körülmények között nem tartja vissza az anioncserélő anyag, míg a VlII-as faktor adszorbeálódik a kromatográfiás anyagon.

Ennek következtében a VlII-as faktort egy vizes oldószer rendszerrel eluáljuk, amelynek fokozatosan növeljük a sókoncentrációját.

Az így kapott, VlII-as faktort tartalmazó frakciót töményítjük, feltöltjük, majd szükség esetén szokványos módszerekkel liofilezzük.

A VlII-as faktort előnyösen egy kis ionerősségű oldatból visszük be az első membránkromatográfiás lépésbe.

A vizes rendszer ionerőssége megfelel 0-150 mmol/1 nátrium-klorid-oldatnak. Ilyen ionerősség mellett a VlII-as faktor még adszorbeálódik a kromatográfiás hordozón, míg a gyengébben kötődő szennyeződések ugyanilyen erősségű vizes rendszerrel kimoshatok.

A jelen találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint az adszorbeált anyag tisztítását egy olyan vizes rendszerrel végezhetjük el, amelynek ionerőssége 200-400 mmol/1 nátrium-klorid-oldaténak felel meg. A VlII-as faktor deszorpcióját és ennek a frakciónak az elúcióját egy olyan vizes rendszerrel végezhetjük el, amelynek ionerőssége 500-1500 mmol/1 nátrium-klorid-oldaténak felel meg, miközben a pH-értékét 4 és 9 között tartjuk. A kationcserélő kromatográfiát előnyösen inkább pH <6 értéknél végezzük el, mint hatnál magasabb pH-értéknél.

Ha VlII-as faktor tisztítását immunaffinitás-membránkromatográfiával végezzük, akkor, eltérően az előzőkben említett, anioncserélő anyagokat alkalmazó eljárástól, az elúciót kaotrop ágensekkel vagy nagyon tömény sóoldatokkal hajtjuk végre. Az elúció előnyösen a kaotrop anyagok vagy sók olyan koncentrációjánál játszódik le, amely elegendő ahhoz, hogy megbontsa a VlII-as faktorhoz nagy affinitással rendelkező anyag és maga a VlII-as faktor közötti kötődést. Az említett anyagok koncentrációja a megfelelő elúciós rendszerekben a VlII-as faktor és a megfelelő kötőkomponens közötti kötődés erősségétől függ. Előnyösen azok az anyagok használhatók immunaffinitás-ligandumokként, amelyeknek nem túl nagy az affinitásuk. Ennek eredményeképpen az elúció lejátszódhat vizes oldatokban, alacsony denaturáló potenciál mellett. Előnyösen olyan oldatokat használunk, amelyeknek a koncentrációja 1-6 mol/1 karbamid, vagy ennek megfelelő erősen koncentrált sóoldatokat használunk a VlII-as faktornak az immunaffinitás-membránról való leoldására.

A hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiában a mintát nagy ionerősségű vizes oldatban visszük az eljárásba, azaz például nagyon tömény ammóniumszulfátban (egészen 4 mol/1 koncentrációig), vagy na3

HU 222 087 BI gyón tömény nátrium-kloridban (egészen 5 mol/1 koncentrációig). Pontosabban, az elúciót vagy fokozatosan végezzük, vagy folyamatosan, alacsonyabb ionerősségű sóoldatokkal. Egy szerves oldószereket tartalmazó oldatot, pontosabban hígított alkoholos oldatot is használhatunk alacsonyabb ionerősségű oldatként a mintáknak a hidrofób kölcsönhatáson alapuló membránkromatográfián alapuló eluálására.

A találmány szerinti eljárás meglepő módon biztosítja a VlII-as faktor gyors és komplikációmentes tisztítását, és a VlII-as faktort nagy tisztaságban és jó kitermeléssel kapjuk meg. Emellett, az ily módon kapott VlIIas faktor specifikus aktivitása meglehetősen magas, ami tulajdonítható annak, hogy a találmány szerinti eljárásban az aktív faktor kevéssé denaturálódik. így tehát a találmány szerinti eljárásban kapott VHI-as faktort tartalmazó frakció is a találmány tárgyát képezi.

Claims (11)

1. Eljárás vírusinaktivált, VlII-as faktort tartalmazó frakció előállítására kromatográfiás módszerekkel, azzal jellemezve, hogy oldott krioprecipitátumból vagy vérplazmából indulunk ki, ezt adott esetben alumínium-hidroxidos kezelésnek vetjük alá, a frakciót egy di- vagy trialkil-foszfáttal és nemionos tenziddel kezelve vírusinaktiválásnak vetjük alá, majd legalább egy elválasztási lépést alkalmazunk porózus hidrofil polimer poli(glicidil-metakrilát)- vagy hidrofilizált polisztirolmembránokon vagy kompakt lemezeken végzett membránkromatográfiával.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett elválasztási lépést egy membránban vagy a membránon elrendezett ioncserélő anyagon, főleg anioncserélő anyagon végezzük.

3. Az 1. és/vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további vírusinaktiválást végzünk pasztörizációs lépéssel, és adott esetben egy további, membránkromatográfiát alkalmazó elválasztási lépést végzünk.

4. Az 1. és/vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett membránkromatográfiát olyan anyagon végezzük, amely nagy affinitással rendelkezik a VlII-as faktorhoz.

5. Az 1. és/vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nagy és/vagy kis molekulasúlyú ligandumokkal módosított, a VlII-as faktorhoz nagy affinitással rendelkező anyagot alkalmazunk.

6. A 4. és/vagy 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VHI-as faktorral szemben nagy affinitással rendelkező immobilizált ligandumot hordozó, a VlII-as faktorral szemben nagy affinitással rendelkező módosított anyagot alkalmazunk.

7. Az 1. és/vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás anyagként az elválasztandó VlII-as faktorral történő hidrofób kölcsönhatást biztosító, illetve a hidrofób kölcsönhatást közvetítő megfelelő ligandumokat hordozó anyagot alkalmazunk.

8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítandó mintát alacsony ionerősségű, 0-100 mmol/1 koncentrációjú nátrium-kloridnak megfelelő vizes rendszerben visszük az ioncserélő anyagot tartalmazó membránra, szükség esetén nagyobb ionerősségű, 200-400 mmol/1 koncentrációjú nátrium-kloridnak megfelelő vizes rendszerrel mossuk, majd egy olyan vizes rendszerrel eluáljuk, amelynek nagyobb, 500-1500 mmol/1 koncentrációjú nátriuro-klöridnak megfelelő az ionerőssége, míg a pH-értékét 4-9 között tartjuk.

9. Az 1., 3. és/vagy 7. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítandó mintát igen magas ionerősségű oldatból visszük fel egy, a felületén hidrofób ligandumokat hordozó membránra, majd alacsonyabb ionerősségű oldószerrendszerekkel eluáljuk.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VHI-as faktort tartalmazó eluált frakciót töményítjük, feltöltjük és liofilezzük.

11. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírus inaktiválását 15 súlyszázalékig terjedő koncentrációjú detergenssel való kezeléssel végezzük.