JP4177905B2 - ウイルス不活化の間の蛋白質の選択的安定化 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的には、治療学的に有効な蛋白質のウイルス不活化に関する。本発明は具体的には、目的の蛋白質（産物）をウイルス不活化法の間親和性樹脂に結合させることにより安定化させ、そしてそのカラムからの選択的溶離により更に精製してもよいウイルス不活化法である。
【０００２】
【従来の技術】
例えば静脈内ガンマーグロブリンおよび因子ＶＩＩＩのような、ヒト血漿に由来する生物学的産物はヒト感染性ウイルスをレシピエントに伝達する可能性を有する。これらの医薬品を用いることでの患者の感染の可能性を最小限に抑えるためには、その産物の生産の際に組み込まれる３つの制御レベルが存在する。第一のものは、ヒト起源の血漿のスクリーニングによりウイルス負荷を最小限にさせることである。第二のものは、源の血漿からその産物を製造するのに用いられる方法により確実に最終産物からすべての潜在性ウイルスを実質的に除去することである。第三の制御レベルは、その産物の生産方法に特定のウイルス不活化法を取り込ませることである。
【０００３】
溶媒と洗剤との混合物での蛋白質の処理は、生物学的もしくは生物工学的のいずれかの起源に由来する蛋白質により包膜ウイルスの伝播を防ぐ上で広く用いられている（Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｐｉｅｔ ｅｔ ａｌ．、１９９０）。この処理は脂質包膜を有するウイルスに対して有効であり、そしてこの構造を含まないウイルスに対してはその有効性が格段に低くなる。近年、溶媒／洗剤処理を施した生物学的産物の使用による少なくとも２つの非包膜ウイルスの伝播が記述されている。非包膜ＲＮＡウイルスであるＡ型肝炎ウイルスは、溶媒−洗剤で処理した因子ＶＩＩＩ産物を用いた場合に悪者に伝播した（Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。また、因子ＶＩＩＩは、ヒトへの非包膜パルボウイルスＢ１９の伝播に関係があるとされてきた（Ｌｅｆｒｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。生物学的産物の安全性を維持および改善するためには明らかに、一層広域スペクトラムの抗−ウイルス活性を有するウイルス不活化法が必要とされる。
【０００４】
乾燥粉末として(Rubinstein, 1984; Thomas, 1985)もしくは水溶液中（Ｓｃｈｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８２）のいずれかの蛋白質の加熱処理が、抗−ウイルス活性のスペクトラムを非包膜ウイルスを含むように拡大させるのに用いられてきた。しかしながら非包膜ウイルスの不活化は一般的には包膜ウイルスのものより困難であり、かつ完全な不活化を確実に実施するためには一層長めの処理時間もしくはより高温が必要とされることがしばしばである。１００℃で３０分間の乾熱処理した因子ＶＩＩＩ産物によりＢ１９が患者に伝播した（Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。６３℃において、１０時間のＦＶＩＩＩの溶液低温殺菌では幾つかの非包膜ウイルスを完全に不活化させるのには不十分であった（Ｂｉｅｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。非包膜ウイルス不活化のためには比較的不十分であることに加え、加熱法は蛋白質産物を変性させる傾向をも有する。小分子の安定化剤の添加にもかかわらず、静脈内用ガンマーグロブリンの乾熱処理は凝集および効力の低下を生じることが示された（Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。ソルビトール中での溶液低温殺菌も静脈内用ガンマーグロブリンの凝集を生じることが示された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。それに加え、例えば糖のような非特異的安定化剤は、不活化中にウイルス構造を安定化させることもあるかも知れない。加熱に基づくウイルス不活化法を効率のよいものにするためには、加熱処理中に蛋白質産物を安定化させる新規の方法が開発される必要がある。
【０００５】
ある蛋白質に結合するリガンドは、多くの場合においてその蛋白質の熱安定性を増加させることが示されてきている。３’ＧＭＰのバルナーゼへの結合には変性温度を約１０℃高める（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。免疫抑制剤ＦＫ５２０はその結合性蛋白質の変性温度を６８℃から８３℃へと移動させる（Ｍａｒｑｕｉｓ−Ｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。ｂＦＧＦへヘパリンを結合させると、蛋白質を変性させるのに必要とされる温度は５９℃から９０℃へと、３１℃の移動を起こす（Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。これらの、時としては劇的となる蛋白質のリガンドに誘導された熱安定性の増加は、蛋白質−リガンド相互作用のエネルギー論に関係があるものと思われている（Ｄｅｎｉｓｏｖ、１９９２）。
【０００６】
リガンドは複雑な混合物からの蛋白質の親和性精製にしばしば用いられている。例えば、固相に連結させたヘパリンがヒト起源の血漿からのＡＴＩＩＩの親和性精製に用いられている（Ｌｅｂｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。固定化させたＦｖ抗体断片が鶏卵のリソソームを単離するのに用いられている（Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。血漿からのフィブリノーゲンの精製のための２つの方法（一つはリストセチン−アガロース上での親和性クロマトグラフィーによるもの（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９８０）およびもう一つのものはプロタミン−アガロース上でのクロマトグラフィーによるもの（Ｄｅｍｐｆｌｅ ＆ Ｈｅｅｎｅ、１９８７））が報告されてきた。
【０００７】
固定化された小ペプチドリガンドも親和性精製戦略には一般的に有用であることが主張されている（Ｂａｕｍｂａｃｈ ＆ Ｈａｍｍｏｎｄ、１９９２）。Ｋｕｙａｓら（１９９０）は、クロマトグラフィー用支持体に結合させた小ペプチドＧＰＲＰＫ（配列番号１）を用いるフィブリノーゲンの精製法を示した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
我々の発明は、例えば加熱のようなウイルス不活化法に対して、蛋白質を結合し、かつ安定化もするリガンドを記述しようと努めている。リガンドを結合することにより加熱に対して蛋白質を選択的に安定化させることで、ウイルスの不活化を達成するに十分なほどその混合物を加熱することが可能となるはずである。それに加え、そのリガンドは論理的には、その標的の精製および安定化の両方について何回も再利用することができる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
今回我々は、ウイルス不活化法に供される溶液内の目的の蛋白質を選択的に安定化させる新規方法を見い出した。非常に驚くべきことに我々は、ある親和性精製段階にウイルス不活化法を組み込むことで、これ以外の状態では蛋白質の活性の低下がもたらされうるウイルス不活化条件を適用させることができることを見いだした。蛋白質の安定化はリガンドへの結合によりもたらされ、この結合はその蛋白質をウイルス不活化条件に対して安定化させ、このことにより一層高いパーセンテージの活性の回収が可能となる。親和性精製は、蛋白質をリガンドへ選択的に結合させ、次いで支持体から溶離できるような支持体上に固定されたリガンドを担持させることからもたらされてもよい。我々は、ペプチドのリガンド安定化およびペプチドの親和性精製の組み合わせにより一層経済的で商業規模でのウイルスの不活化を施した蛋白質産物の生産がもたらされるであろうと予期している。
【００１０】
本明細書では、ある蛋白質（トロンビン）に結合するための小ペプチドセグメントを用いるペプチド親和性カラムを用いる方法が具体的に説明される。親和性カラムに結合されたトロンビンは様々な温度になるまで３０分間加熱される。カラムに結合することによりトロンビンは安定化し、そしてカラムから除去された際にも活性を保ったままでいる。ペプチド親和性マトリックスにより提供される安定化なしではトロンビンは加熱により不活化される。このカラムに添加され、次いで加熱に供されたウイルスは安定化はされないであろうが、なぜならそのリガンドは標的蛋白質のみに特異的であるためである。
【００１１】
本明細書の実施例に用いられるリガンドはポリペプチドであるが、その蛋白質に対する親和性を有し、かつウイルス不活化中にその蛋白質を安定化させる他種の分子を用いてもよい。これらのリガンドは、例えばケイ素ポリマーを基とする樹脂のようなクロマトグラフィー用支持体を初めとする様々な支持体上に結合させることにより固定化してもよい。
【００１２】
本明細書に用いられる場合には「生物学的に活性な蛋白質」は、測定可能な機能もしくは活性を示すか、あるいは意図される結果（特に変性もしくは利用性の無い状態の同一蛋白質と対立させる場合）に有用である蛋白質を意味する。機能、活性、もしくは意図される結果は例えば、酵素活性もしくは結合親和性であることができる。「活性の実質的保持」は、好ましくは少なくとも約５０％、一層好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％の活性がこの方法から回収されうることを意味する。「実質的変性」は、少なくとも約５０％、一層悪い状況では少なくとも約７０％、そして更に一層悪い状況では少なくとも約８０％の蛋白質活性の低下を意味する。実用的な問題では、出来る限り少ない変性状態で蛋白質を回収することが所望される。従って、ウイルス不活化処理の条件下では、本発明の方法を用いないで回収される量に比較すると、本発明の方法から回収される活性量が一層多くなるという場合に、本発明の方法を用いるとよい。
【００１３】
本発明は、水溶液を単に加熱する以外に、蛋白質のウイルス不活化の一層多くの方法にも適用されるものと思われる。この方法は、蛋白質の変性をもたらすウイルスの不活化の様々な化学的方法に適用されてよく、このことにより、用いられるいずれかの化学物質を除去した後固定化されたリガンドからの蛋白質を溶離する追加的利益が得られる。数少ない可能性を挙げると、蛋白質の安定性が選択されたウイルス不活化法に関しての問題となる場合、酸処理、ヘパリン懸濁物中での加熱、カオトロピック剤、もしくは溶媒／洗剤を本方法に組み込んでもよい。
【００１４】
ウイルス不活化の条件は実験系の詳細事項に依存して変化してよい。例えば、高温下での短時間の加熱は、幾分低めの温度での長めの加熱と同様、ウイルスを不活化させるのに効果的である場合も一般的に知られている。従って、時間はリガンドに結合した蛋白質の正味の安定性に依存してよく、これは系ごとに変化するであろう。最大ウイルスクリアランスを伴いながら活性蛋白質の回収を最大にさせるための条件の至適化は、当業者の能力範囲内に含まれるものと見なされる。
【００１５】
ウイルスクリアランスは典型的には、あるモデルウイルスの既知の量を溶液に添加し、ウイルス不活化法を実施し、そして得られる溶液中の活性ウイルスの量を測定することにより測定される。１ ｌｏｇ₁₀単位のウイルス減少は、１０倍の活性ウイルス力価の低下として定義される。実質的ウイルスクリアランスは、好ましくは約３ ｌｏｇ₁₀単位、一層好ましくは少なくとも約４ ｌｏｇ₁₀単位、そして最も好ましくは少なくとも約５ ｌｏｇ₁₀単位を意味する。「実質的にウイルスを含まない」は、ウイルス不活化法により処理されており、実質的なウイルスクリアランスをもたらすことを意味する。
【００１６】
【実施例】
結合性実験
ペプチド、ＶＦＰＹＡＷ、ＹＮＦＥＶＬ、およびＶＴＰＦＡＶ（各々、配列番号２、３、および４）は固相樹脂上で直接合成された（Ｂｕｅｔｔｎｅｒ ｅｔａｌ．、１９９６）。ジャケット付クロマトグラフィーカラムに各１ｍｌの樹脂を充填した。制御温度水槽からの水をカラムジャケットを通して循環させて２５℃の温度を保持した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍｌ ＥＧＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．８（緩衝液Ａ）中のトロンビン（２００μｇ）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ社）をカラムにかけた。非結合物質は、５ｍｌの緩衝液Ａ、緩衝液Ａ中の５ｍｌの１ＭＮａＣｌ、緩衝液Ａ中の５ｍｌの３Ｍ ＮａＣｌ、および最終的には５ｍｌの緩衝液Ａでの洗浄によりカラムから除去した。トロンビンを５ｍｌの２％ 酢酸で溶離させ、そして中和のために１ｍｌのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液を含む試験管内に集めた。試料中のトロンビン活性はＡｘｅｌｓｏｎら（１９７６）に従い、二塩酸Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（Ｓ−２２３８、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社、Ｓｗｅｄｅｎ）を基質として用いてアッセイした。
【００１７】
【表１】

【００１８】
この表に示されるように、ペプチドＶＦＰＹＡＷはカラムにかけられたトロンビンの内の９１％に結合した。ペプチドＹＮＦＥＶＬはトロンビンにあまり強く結合はせず、塩洗浄後にはわずか４６％のみが残存するに過ぎなかった。ペプチドＶＴＰＦＡＶは「陰性」対照として含まれていた。このペプチドはトロンビンには結合せず、塩洗浄後には残留性（２．５％）トロンビンのみが残存するに過ぎなかった。
【００１９】
安定化実験
３本のカラム（各々はペプチド親和性樹脂の内の一つを含む）を指示される温度（図を参照されたい）にまで、３０分間カラムジャケットを通して水を循環させることにより平衡化させた。その後に２００μｇのトロンビンを以前の要領でその樹脂にかけるが；しかしながらその樹脂から塩洗浄によりトロンビンを除去する試みは実施されなかった。所望の温度に３０分置いた後、１ｍｌの２％ 酢酸を添加してそのカラムからトロンビンを溶離させ、そして試料を以前の要領でトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液中に集めた。
【００２０】
図に示されるように７０℃ではトロンビンは、非結合性樹脂に適用した場合にベースラインレベルにまで不活性化された。しかしながらトロンビンを樹脂ＶＦＰＹＡＷ（配列番号２）に適用した場合には、ほぼ７０％のトロンビン活性が７０℃で保持された。樹脂ＹＮＦＥＶＬ（配列番号３）は一層結合性の弱い樹脂であり、８５％の蛋白質活性が７０℃で保持された。７０℃以上ではトロンビン活性の保持力は低下したが、非結合性樹脂と比較すると結合性樹脂上での方が高い値に保持されていた。
【００２１】
【発明の効果】
我々は、ペプチド親和性樹脂への溶液中の蛋白質の結合により加熱に対する、ある蛋白質の安定性を実質的に増加させることができることを示した。具体的には８０％のトロンビン活性がＹＮＦＥＶＬ−樹脂（配列番号３）から、そして約７０％がＶＦＰＹＡＷ−樹脂（配列番号２）から、７０℃で３０分間（この条件は、他の場合にはその蛋白質の変性をもたらす）の後に回収された。６０℃およびそれ以上の温度が、ヒト血漿に由来する産物で汚染されていることがあるウイルスの不活化にしばしば用いられるため、この新規技術は蛋白質を、その蛋白質の実質的変性を伴うことなく熱で蛋白質を処理することを可能とするはずである。従ってこの技術は多くの蛋白質産物の生産法に取り込ませることができる特異的ウイルス不活化段階の基盤を成す。検査予定の蛋白質産物がペプチド親和性樹脂に特異的に結合するため、この技術により、同一の生産段階で、ある蛋白質産物をウイルス不活性にさせかつ親和性精製することの両方の能力がもたらされてもよい。このような方法は、治療学的使用のための蛋白質の生産における規模の経済および効率性をもたらし、そして製造法における恩恵をもたらすであろう。
【００２２】
先の実施例は本発明を詳細に説明することが意図され、かつ当業者には変法が思い浮かぶであろうと思われる。従って本発明の範囲は以下の請求項によってのみ限定されるはずであることが意図される。
【００２３】
本発明の主な特徴または態様は以下のとうりである。
【００２４】
１． 遊離の生物学的活性蛋白質を含む水溶液中に存在する可能性のあるウイルスの不活化方法であって、
ａ） 該溶液を、該蛋白質に結合する固定化されたリガンドと、蛋白質が該リガンドに結合し、そのことにより結合蛋白質がもたらされる条件下で接触させる段階；
ｂ） 該結合蛋白質を、溶液中での遊離蛋白質について実施された場合よりも該蛋白質の変性がより少なくなる条件下でウイルス不活化処理に、供する段階；ならびに
ｃ） 段階ｂ）の結合蛋白質を、溶液内への蛋白質の放出に有利である条件下、かつ回収された蛋白質が実質的にその生物学的活性を保持する条件下で洗浄することにより該蛋白質を溶離させる段階、
を含んでなる方法。
【００２５】
２． 段階ａ）とｂ）との間に一回の洗浄段階、および段階ｂ）とｃ）との間に一回の洗浄段階を更に含み、前記洗浄段階が選択的に不純物を溶離する条件下で実施され、そしてそのことにより段階ｃ）で回収される蛋白質が純度の増加を示すようになる、前記１の方法。
【００２６】
３． 段階ｃ）で回収される蛋白質が実質的に非包膜ウイルスを含まない、前記１の方法。
【００２７】
４． 段階ｃ）で回収される蛋白質が実質的に包膜ウイルスを含まない、前記１の方法。
【００２８】
５． 蛋白質がトロンビンである、前記１の方法。
【００２９】
６． リガンドが、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−ＴｒｐおよびＴｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（各々、配列番号２および３）からなる群より選択される配列を有するポリペプチドを含んでなる、前記５の方法。
【００３０】
７． ポリペプチドが共有結合によりクロマトグラフィー用支持体に結合される、前記６の方法。
【００３１】
８． リガンドが、クロマトグラフィー用支持体に共有結合により結合されることにより固定化される、前記１の方法。
【００３２】
９． ウイルス不活化法が、少なくとも６０℃に一定期間、かつ実質的ウイルスクリアランスがもたらされる条件下で加熱することである、前記１の方法。
【００３３】
１０． ウイルス不活化法が、少なくとも７０℃に一定期間、かつ実質的ウイルスクリアランスがもたらされる条件下で加熱することである、前記９の方法。
【００３４】
【外１】

【００３５】
【外２】

【００３６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】３種のペプチド親和性樹脂の存在下での加熱に対するトロンビンの安定性を示す。

Claims (4)

1. 遊離の生物学的活性蛋白質を含む水溶液中に存在する可能性のあるウイルスの不活化方法であって、
   ａ） 該溶液を、該蛋白質に結合する固定化されたリガンドと、蛋白質が該リガンドに結合し、そのことにより結合蛋白質がもたらされる条件下で接触させる段階；
   ｂ） 該結合蛋白質を、溶液中での遊離蛋白質について実施された場合よりも該蛋白質の変性がより少なくなる条件下でウイルス不活化処理に、供する段階；ならびに
   ｃ） 段階ｂ）の結合蛋白質を、溶液内への蛋白質の放出に有利である条件下、かつ回収された蛋白質が実質的にその生物学的活性を保持する条件下で洗浄することにより該蛋白質を溶離させる段階、
   を含んでなる方法。
2. 蛋白質がトロンビンである、請求項１の方法。
3. リガンドが、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−ＴｒｐおよびＴｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（各々、配列番号２および３）からなる群より選択される配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項２の方法。
4. ウイルス不活化法が、少なくとも６０℃に一定期間、かつ実質的ウイルスクリアランスがもたらされる条件下で加熱することである、請求項１記載の方法。

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