HU211239A9 - Eljárás nagy tisztaságú, vírusbiztos Vili faktor-készítmény előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás vírusbiztos, nagy tisztaságú Vin faktor készítmény előállítására.

A véralvadást különböző proteinek, illetve enzimek egymást követő reakcióinak sora váltja ki. A véralvadásfaktorok hiánya akadályozza a fibrin képződését a fibrinogénből és ezzel a seb záródását, a következmény: vérzések. Ez áll fenn a hemofília A esetében. Ez a leggyakrabban előforduló vérzéses betegség, és a Vin faktor hiánya idézi elő. A VIII faktor a plazmában a von Willebrand faktorral (vWF) mint nem kovalens kötésű VIIIF/vWF komplex fordul elő. Az FVIII és vWF proteineket, valamint az VIIIF/vWF komplexet hemofíliások pótkezelésére használják. A megfelelő gyógyszerkészítményeknél igen nagyok a követelmények a hatásosság és a biztonság tekintetében.

A készítmények előállításához a kiindulási anyag többnyire emberi plazma, ami a VIII faktort, bár csak kis mennyiségekben (körülbelül 0,1-0,2 pg/ml) tartalmazza. A VIII faktor előállításához ezért nemcsak nagy mennyiségű plazmát kell feldolgozni, de - amennyire lehet - el kell különíteni a zavaró, kísérő proteineket is, miközben számos ilyen kísérő protein hasonló fizikaikémiai tulajdonságokkal rendelkezik.

További nehézséget jelent az, hogy a készítményben még a fertőző ágenseket is inaktiválni kell, mivel a kiindulási anyag tartalmazhat például hepatitis vagy HÍV vírust. Ehhez járul még az is, hogy minden egyes eljárási műveletet és minden inaktiválást úgy kell elvégezni, hogy az előállítani kívánt alvadásfaktorok biológiai aktivitása lehetőleg megmaradjon.

A klasszikus gyártási módszereknél lépcsőzetes kicsapásokat (például krioprecipitálást vagy ammóniumnitrát hozzáadásával végzett kicsapásokat) alkalmaznak, amelyek célja a szennyezések, így a protrombinkomplex faktorok, fibrinogén és fibronektin eltávolítása. A kapott VIII faktor-koncentrátumok tisztasága körülbelül 1 E/mg protein, és általában nem haladja meg a 10-20 E/mg protein határokat.

Az EP-A-0 378 208 számú szabadalmi leírásból ismeretes egy eljárás VIII faktor előállítására, amely szerint egy krioprecipitátum-oldatot a Tween 80 oldásközvetítő jelenlétében [trisz(n-butil)-foszfát (TNBP)] szerves oldószerrel kezelve vírus-inaktiválásnak vetnek alá. A VIII faktort ezután két műveletben tisztító kicsapásnak vetik alá, liofilizálják és száraz állapotban felmelegítik.

Az EP-B-0 050 061 számú szabadalmi leírás biológiai és gyógyászati termékek 0,25-10 tömeg% nem denaturáló Amphiphil-lel (detergens) történő kezelését ismerteti.

Az EP-B-0131 740 számú szabadalmi leírásból ismeretes az eljárás proteinek szerves oldószerekkel történő kezelésére, adott esetben detergensek jelenlétében. Itt megfigyelhető, hogy a csak egy detergenssel végzett kezelés önmagában viszonylag hatástalan a vírusinaktiválás szempontjából. A szerves oldószerek pedig csak a membránburokkal bíró vírusok ellen hatásosak. Felléptek már olyan hepatitis fertőzések, amelyek olyan hepatitis A vírussal szennyezett VIII faktorkoncentrátumokra vezethetők vissza, amelyeket a fenti módon vírus-inaktiváltak. A hepatitis A vírusnak nincs lipidtartalmú membránja; ezért nem inaktiválódik [Manucci P. M. et al.: The Láncét 339., 819. (1992.): „Outbreak of hepatitis A among Italian patients with haemophilia”].

A Vili faktort tartalmazó frakciók szerves oldószerekkel való kezelését legtöbbször oly módon végzik, hogy a toxikus hatású oldószert a kezelés megtörténte után költséges úton elkülönítik. Az EP-A-0 343 275 számú szabadalmi leírásban ezért a VIII faktort tartalmazó frakciók extrakcióját olajokkal, így szója- vagy ricinusolajjal javasolják. Ezt követően a VIII faktort ioncserélő anyagokon gélpermeációs kromatográfiának vetik alá.

Az EP-A-0 094 611 számú szabadalmi leírás eljárása szerint a VIII faktort a fertőzőképesség csökkentése céljából száraz állapotban felmelegítik.

Az EP-B-0 159 311 számú szabadalmi leírás szerint a vérkészítményeket szilárd, nedves állapotban hevítik fel a potenciálisan jelenlévő vírusok inaktiválása céljából. Ilyen, „gőzben hevített” VHI faktor koncentrátumoknál egyetlen fertőzés esete sem ismeretes [Manucci P. M. Transfusion 32., 134-138. (1992.): „Low risk of viral infection after vaporheated factor VIH concentrates”].

A nagy tisztaságú VIII faktor koncentrátumok hőkezelése kritikus művelet. Egy kromatográfiásan tisztított VIII faktorhoz az EP-A-0 173 242 számú szabadalmi leírás szerint például stabilizátorok keverékét (szénhidrátok és aminosavak) kell adni, mielőtt azt oldatban felhevítik. Szokásos különben az is, hogy a VIII faktort tartalmazó frakciót még a kromatográfiás tisztítás előtt vírusinaktiváló kezelésnek vetik alá.

A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amellyel egy hatásos vírusinaktiváló kezelés alapján vírusbiztosnak számító, tisztított VIH faktor állítható elő.

Az előállított készítmény specifikus aktivitásának előnyösen legalább 25 E/mg proteinnek kell lennie.

A feladatot a találmány szerint az alábbi műveletek kombinációjával oldjuk meg:

1) VIH faktort tartalmazó frakciót kromatográfiásan tisztítunk,

b) a VIII faktort vizes oldatban tenziddel kezeljük, ahol a tenzid-protein arány 1:1 és 66:1 közötti; és

c) a Vm faktort szilárd állapotban hőkezeljük.

A Vm faktor a találmány szerint előállítható mint VIIIF/vWF-komplex, VHIF, illetve vWF. Az előállítási eljárás során elvégezhető egy kezelés a VIIIF/vWF komplex disszociációja céljából, például kalcium-kloriddal.

Azt találtuk, hogy a találmány szerinti tenzidkezelés meglepően jól használható az eredményes vírusinaktiváláshoz. Tenzidekként alkalmazhatók például nem-ionos tenzidek, így a polioxi-etilén-szorbitán-monooleát (Tween 80), valamint oxi-etil-alkil-fenol alapú tenzidek (például a Triton X-100, Triton X-114), dodecil-maltozid vagy oktil-glükozid, ikerionos tenzidek, így a dimetil-oktil-amin-N-oxid vagy az N-dodecilN,N-dimetil-3-ammónium-l-propán-szulfonát; és ionos tenzidek, így nátrium-dezoxikolát vagy nátriumkólát. A tenzides kezelést mindenekelőtt szerves oldó2

HU 211 239 A9 szerektől mentes vizes oldatban végezzük. Vizes oldatként megfelel például egy krioprecipitátum-oldat, amelyet adott esetben még a protrombinkomplex faktorok adszorpciójával tisztítunk. Egy ilyen oldatban a tenzid/protein arány előnyösen 1:1-10:1.

A tenzides kezelést előnyösen a kromatográfiás tisztítás előtt, előnyösen 3,5:1-10:1 tenzid/protein aránnyal végezzük, a tenzid a kromatográfiás tisztítás alatt egyszerű módon elkülöníthető.

Egy másik kiviteli mód szerint azonban a tenzides kezelés a kromatográfia alatt is elvégezhető. Ennek a változatnak az az előnye, hogy a VIA faktor még az aggregációra és így a nem-kívánatos koadszorpcióra hajlamos proteinek jelenlétében is specifikus módon adszorbeálható.

Annak érdekében, hogy a membránburokkal nem rendelkező vírusok által okozott fertőzéssel szembeni biztonságot növeljük, a találmány szerinti kombináció megvalósításakor a VIII faktor szilárd állapotban végzett hőkezelését javasoljuk. Ezt elvégezhetjük a liofilizált készítményen, a hőkezelést előnyösen a készítmény nedves állapotában végezzük.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint a hőkezelést forró gőzzel végezzük. A VIA faktorkészítményt ilyenkor szilárd állapotban több, mint 5 tömeg% és kevesebb, mint 70 tömeg%, előnyösen kevesebb, mint 40 tömeg% víz-, metanolvagy etanoltartalomra beállítjuk, és zárt edényben, adott esetben inért védőgáz jelenlétében, 50-121 'C hőmérséklettartományban melegítjük.

A Vm faktor liofilizátuma tartalmazhat még albumint, illetve sókat, így nátrium-citrátot, illetve aminosavakat.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ez a hőkezelés az aktivitásban jelentős károsodást nem okoz, így egy viszonylag instabil, nagy tisztaságú VIII faktor is kezelhető ily módon.

A kromatográfiás tisztítás alatt a VIII faktort a kísérő proteinektől messzemenően megszabadítjuk. Az előállítási eljárás egy előnyös kiviteli módja magába foglal egy több műveletből álló kromatográfiás tisztítást, amelynek egyik műveleténél egy, a VIII faktor adszorpciójára szolgáló, és egy másik műveletben egy, a szennyező proteinek adszorpciójára szolgáló anyagot alkalmazunk.

így először használhatunk egy anioncserélő anyagot a Vin faktor adszorpciójához, majd egy fibronektinre nagy affinitású anyagot, így zselatint vagy heparint, oldhatatlan hordozóhoz rögzítve. Akromatográfiát ebben az esetben is előnyösen végezhetjük tenzidek jelenlétében, hogy a Vili faktor nem-specifikus adszorpcióját az affinitáshordozón minimalizáljuk.

Egy albuminmentes VIA faktor készítmény előállításához a VIA faktort tartalmazó oldat adszorpcióját triazingéleken [Cibacron Blue 3GA, oldhatatlan hordozón rögzítve (Bio-Rad); Fractogel TKS-AF-Blue (Merck); Blue-Sepharose CL6B (Pharmacia)] végezhetjük.

Ezek a gélek nagy szelektivitással kötik meg az albumint, amely más módszerekkel a VIA faktortól kvantitative nem választható el, és a VIII faktorban mint szennyeződés van jelen, hacsak a stabilizálódáshoz nem szükséges az albumintartalom.

A kromatográfiás tisztításhoz előnyösen akrilát-, szilikát- vagy szénhidrátalapú anioncserélőket használunk, ilyenek a DEAE-Sephadex (Pharmacia) QAESepharose (Pharmacia), DEAE-Toyo-Pearl (Tosohaas), TMAE-Fractogel (Merck) és hasonlók.

Az akrilátalapú anioncserélők előnyösen mint tapogató („tentakel”) mátrixok vannak kiképezve, [v.ö. Müller W. Journal of Cromatography 570., 133-140. (1990.), „New ion exchangers fór the chromatography of biopolymers”). Az ilyen mátrixoknál a cserélőcsoportok egy polimer oldallánc mentén helyezkednek el, amely utóbbi a mátrix felülettel van összekötve. Ennek eredménye a nagy terhelési kapacitás és a jobb szelektivitás.

A VIII véralvadásfaktor - amit a találmány szerint állítunk elő - vírusbiztos és nagy, legalább 25 E/mg protein specifikus aktivitással rendelkezik. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük.

7. példa

101 liter plazmából kivont 1 kg krioprecipitátumot feloldottunk 3,5 liter 1. pufferban, ami triszlizinnel pufferolt nátrium-klorid-oldat (85 mmol/liter).

A VIII faktort tartalmazó oldat előtisztítása céljából az oldatba alumínium-hidroxidot kevertünk, az alumfnium-hidroxidot eltávolítottuk, az oldatba bárium-szulfátot kevertünk és a bárium-szulfátot elválasztottuk. Ezután a felülúszó pH-értékét 6,5-re beállítottuk, hőmérsékletét 4 ’C-ra csökkentettük, a keletkező csapadékot centrifugálással elválasztottuk és eldobtuk.

liter felülúszóra 110 g Triton Χ-100-at adtunk az oldathoz (55:1 tenzid/protein arány), és az elegyet 25 ’C-on 30 percig kevertük. A VIA faktort ezután 6,8 pH-értéken, 750 ml, az 1. puffénál kiegyensúlyozott, akrilát-alapú (DEAE-Toyopearl 650 M, Tosohaas), 9 cm átmérőjű anioncserélő oszlopon adszorbeáltuk.

A VIA faktort tartalmazó frakciót a gélről 2,25 liter

2. puffénál (citráttal pufferolt, 6,8 pH-értékű, 500 mM NaCl-oldat) eluáltuk.

A specifikus aktivitás 76 NE VHI faktor/mg protein.

A VIII faktort tartalmazó frakciót ultraszűrésnek vetettük alá, liofilizáltuk, majd a VIII faktort 7,5 tömegbe vízzel zárt edényben 10 órán át 60 ’C-on melegítettük. A VIA faktor aktivitása a nem melegített termékének 72%-a. Az albumin jelenlétében végzett hőkezelés után a VIII faktor aktivitása a nem hőkezelt termékének 92%-a.

2. példa kg krioprecipitátumot az 1. példa szerinti módon kivontunk és feloldottunk.

Az előtisztítást alumínium-hidroxiddal és báriumszulfáttal végeztük. A felülúszóhoz literenként 120 g Tween 80-at adtunk (a tenzid/protein arány 4:1), és az elegyet 25 ‘C-on 45 percig kevertük. Ezután a keveréket 1:3 arányban a fenti 1. pufferral felhígítottuk, és az oldatot kromatográfiásan tisztítottuk úgy, hogy a VEI

HU 211 239 A9 faktort 400 ml akrilátalapú anioncserélőn (EMDTMAE Fractogel (Merck)) oszlopon adszorbeáltuk.

A gélt előzetesen az 1. puffénál egyensúlyba hoztuk. A meg nem kötött proteineket az 1. pufferral elkülönítettük, majd a VIII faktort tartalmazó frakciót a 2. pufferral eluáltuk.

A specifikus aktivitás 45 NE VIII faktor/mg protein. Az eluátumot ultraszűréssel koncentráltuk és liofilizáltuk. A VIII faktort 9,5 tömeg% víz jelenlétében, zárt edényben 10 órán át 60 ‘C-on melegítettük.

A Vili faktor aktivitása a nem melegített minta aktivitásának 87%-a.

Az ossz vírusredukciós faktort a Komission dér Europáischen Gemeinschaften EC ΙΠ/8115/89-ΕΝ irányelve szerint a HIV-1 és FSME-vírusok példáján határoztuk meg, amikor is az eljárás alatt többször vittünk be vírusszuszpenziót. Az ossz vírusredukciós faktor legalább

12. Ez az egész eljáráson keresztül az elméleti vírustiter legalább 10¹² csökkenésének felel meg.

3. példa

A 2. példa szerint előállított, 3000 NE aktivitású VIII faktor készítmény 120 E (3960 pg) fibronektint tartalmazott. Ennek a szennyezésnek az eltávolítása céljából a VIII faktort tartalmazó készítményt 1,6 cm átmérőjű, 15 ml heparin-poliszacharid (heparin-sepharose) oszlopon, 260 mM NaCl pufferral kromatográfiásan tisztítottuk.

A VIII faktor nem kötődött meg, a fibronektin a VIII faktort tartalmazó frakcióban nem volt kimutatható. A specifikus aktivitás 46 NE VIII faktor/mg protein. A fibronektint 750 mM NaCl-oldattal eluálva kinyertük.

4. példa kg krioprecipitátumot az 1. példa szerinti módon kinyertünk és feloldottunk. Az előtisztítást alumíniumhidroxiddal és PEG-4000-rel (polietilénglikol-4000) végeztük.

Az oldathoz 0,15% alumínium-hidroxidot adtunk, és az elegyet 25 'C-on 30 percig kevertük. Az alumíniumhidroxidot centrifugálással elválasztottuk és eldobtuk. A felülúszóhoz 3,15% PEG-4000-et adtunk, a pH-értéket

6,6-ra beállítottuk, és a hőmérsékletet 9 °C-ra csökkentettük. Az elegyet 30 percig kevertük, a képződött csapadékot centrifugálással elválasztottuk és eldobtuk.

Ezután a felülúszóhoz literenként 100 g Tween 80-at adtunk (a tenzid/protein arány 50:1) és jól összekevertük. Az 1. pufferral 1:3 arányban végzett felhígítás után az oldatot 1,75 liter poliszacharid alapú anioncserélő gél (QSepharose Fást Flow, Pharmacia) kromatografáltuk.

A VIII faktor adszorbeálódott, a megkötött proteineket 7,9 liter 1. pufferral elkülönítettük. Az oszlopot

5,25 liter nátrium-citráttal pufferolt 500 mM NaCl-oldattal eluálva VIII faktort tartalmazó frakciót kaptunk.

A specifikus aktivitás 89 NE VIII faktor/mg protein volt.

A koncentrált eluátumot liofilizáltuk, majd 8 tömeg% víz jelenlétében, zárt edényben 10 órán át 60 °C-on melegítettük.

A VIII faktor aktivitása a nem melegített anyagénak 81%-a volt.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás nagy tisztaságú, vírusbiztos VIII faktor készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő műveleteket kombináljuk:

   a) a VIII faktort tartalmazó frakciót kromatográfiásan tisztítjuk;

   b) a VIII faktort vizes oldatban tenziddel kezeljük,

   1:1- 1000:1 tenzid/protein arányt használva; és

   c) a VIII faktor készítményt szilárd állapotban hőkezelésnek vetjük alá.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenziddel a kezelést a kromatográfiás tisztítás előtt végezzük, 3,5:1 - 10:1 tenzid/protein arányt használva.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenzides kezelést a kromatográfiás tisztítás alatt végezzük.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést forró gőzzel végezzük, emellett a VIII faktor készítményt szilárd állapotban, több mint 0,05 (5 tömeg%) és kevesebb, mint 0,70 (70 tömeg%), előnyösen kevesebb, mint 0,40 (40 tömeg%) víz-, metanol- vagy etanoltartalomra beállítjuk és zárt edényben, adott esetben inért védőgáz jelenlétében, 50-121 ’C hőmérséklettartományban kezeljük.
5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítást több műveletben végezzük, emellett az egyik műveletben a VIII faktort adszorbeáló anyagot és egy másik műveletben a szennyező proteineket adszorbeáló anyagot használunk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztításhoz akrilát-, szilikát- vagy szénhidrát-alapú anioncserélőt alkalmazunk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan mátrixból álló anioncserélőt alkalmazunk, amelyhez anioncserélő csoportokat tartalmazó polimer oldalláncok kapcsolódnak.
8. 8. VIII véralvadásfaktor készítmény, amelyet az

   1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítottunk elő és specifikus aktivitása legalább 25 E/mg protein.