JP2002504561A - 第VIII因子/vWF複合体の産生方法 - Google Patents
第VIII因子/vWF複合体の産生方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、カチオン交換体におけるクロマトグラフィーによる血漿または血漿画分からの第VIII:C因子/vWF複合体の製造方法に関し、ここで、第VIII:C因子/vWF複合体は、血漿に対して少なくとも300倍に精製され、そして寒冷沈降物または類似の血漿画分に対して、少なくとも50%の収率の第VIII:C因子およびvWFが取得される。
Description
【0001】 本発明は、血漿または1つの血漿画分からカチオン交換クロマトグラフィーを
通じて第VIII:C因子/vWF複合体を産生および精製するための方法に関
する。
通じて第VIII:C因子/vWF複合体を産生および精製するための方法に関
する。
【0002】 血友病患者の治療のためには、第VIII因子調製物が30年よりも多く前か
ら使用されている。第VIII:C因子/vWF複合体は、2つの分子、抗血友
病因子(第VIII:C因子)およびフォン・ビルブラント因子(vWF)から
なる。両タンパク質は、異なる遺伝子の制御下で合成されるが、血漿では、非共
有結合複合体(第VIII:C因子/vWF複合体)として循環する。
ら使用されている。第VIII:C因子/vWF複合体は、2つの分子、抗血友
病因子(第VIII:C因子)およびフォン・ビルブラント因子(vWF)から
なる。両タンパク質は、異なる遺伝子の制御下で合成されるが、血漿では、非共
有結合複合体(第VIII:C因子/vWF複合体)として循環する。
【0003】 抗血友病因子は、糖タンパク質であり、血友病A患者において欠陥があるか、
または欠損している。フォン・ビルブラント因子(vWF)は、多量体糖タンパ
ク質であり、これは、フォン・ビルブラント病に罹患した患者において、低減し
た量でまたは質的に異常に存在する。第VIII:C因子の血漿濃度は、およそ
100ng/mlと200ng/mlとの間であるが、vWFの濃度は、約10
μg/mlである。
または欠損している。フォン・ビルブラント因子(vWF)は、多量体糖タンパ
ク質であり、これは、フォン・ビルブラント病に罹患した患者において、低減し
た量でまたは質的に異常に存在する。第VIII:C因子の血漿濃度は、およそ
100ng/mlと200ng/mlとの間であるが、vWFの濃度は、約10
μg/mlである。
【0004】 薬学的に良好に受容されるFVIII:C/vWF複合体の生産は、安定であ
るが、とりわけ所望されない随伴タンパク質を含まない産物として調製すること
を目的とすべきである。不必要なタンパク質の持込はそれぞれ、その中に所望さ
れない副作用の危険性が潜在している。
るが、とりわけ所望されない随伴タンパク質を含まない産物として調製すること
を目的とすべきである。不必要なタンパク質の持込はそれぞれ、その中に所望さ
れない副作用の危険性が潜在している。
【0005】 現在の技術水準において、第VIII:C因子/vWF複合体を取得するため
に種々のクロマトグラフィーが記載されている(例えば、アニオン交換クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィ
ーの手段)。
に種々のクロマトグラフィーが記載されている(例えば、アニオン交換クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィ
ーの手段)。
【0006】 第VIII:C因子/vWF複合体を、ヒト血漿からカチオン交換クロマトグ
ラフィーを用いて取得する方法は、EP−0 600 480により公知である
。その文献においては、予備精製のために多工程が使用されており(とりわけ、
アニオン交換体に対する2回のクロマトグラフィー精製)、カチオン交換クロマ
トグラフィーは最後に行われる。多工程の精製では、かなりの活性の喪失を甘受
することになる。
ラフィーを用いて取得する方法は、EP−0 600 480により公知である
。その文献においては、予備精製のために多工程が使用されており(とりわけ、
アニオン交換体に対する2回のクロマトグラフィー精製)、カチオン交換クロマ
トグラフィーは最後に行われる。多工程の精製では、かなりの活性の喪失を甘受
することになる。
【0007】 米国特許第5,278,289号において、精製されそして安定な第VIII
因子を1つの生物学的試料から取得する方法が記載されている。ここでは、カチ
オン交換カラムに生物学的試料が供されていたが、不完全に精製されたタンパク
質が得られたのみであった。完全な精製は、後続のアニオン交換カラムを介して
初めて達成された。この産物は、FVIII:Cを含み、このFVIII:Cは
、第VIII:C因子/vWF複合体の解離によって得られた。
因子を1つの生物学的試料から取得する方法が記載されている。ここでは、カチ
オン交換カラムに生物学的試料が供されていたが、不完全に精製されたタンパク
質が得られたのみであった。完全な精製は、後続のアニオン交換カラムを介して
初めて達成された。この産物は、FVIII:Cを含み、このFVIII:Cは
、第VIII:C因子/vWF複合体の解離によって得られた。
【0008】 本発明の課題は、高純度でかつ同時に高収量で、第VIII:C因子/vWF
複合体および単純なクロマトグラフィー方法を介した第VIII:C因子/vW
F複合体の調製を実施可能にすることである。
複合体および単純なクロマトグラフィー方法を介した第VIII:C因子/vW
F複合体の調製を実施可能にすることである。
【0009】 この課題は、本発明に従って、カチオン交換体において、血漿の第VIII:
C因子/vWF複合体を吸着および精製するためにカチオン交換クロマトグラフ
ィーを使用した産生方法によって解決され、ここで、この第VIII:C因子/
vWF複合体は、血漿に対して少なくとも300倍の純度および寒冷沈降物また
は類似の血漿画分に対して少なくとも50%の収率のFVIII:CおよびvW
Fを伴って取得される。
C因子/vWF複合体を吸着および精製するためにカチオン交換クロマトグラフ
ィーを使用した産生方法によって解決され、ここで、この第VIII:C因子/
vWF複合体は、血漿に対して少なくとも300倍の純度および寒冷沈降物また
は類似の血漿画分に対して少なくとも50%の収率のFVIII:CおよびvW
Fを伴って取得される。
【0010】 カチオン交換材料としては、好ましくは、カルボキシ基またはスルフヒドリル
基を有する市販のカチオン交換材料が使用され得る。好ましくは、S−Seph
aroseまたはDM−Sepharose(製造:Amersham Pha
rmacia)、Fractogel EMD−SO3 -もしくはFractog
el EMD−COO-(製造、Merck、Darmstadt)またはSP −ToyopearlもしくはCM−Toyopearl(製造、Tosoha
as)が使用され得る。
基を有する市販のカチオン交換材料が使用され得る。好ましくは、S−Seph
aroseまたはDM−Sepharose(製造:Amersham Pha
rmacia)、Fractogel EMD−SO3 -もしくはFractog
el EMD−COO-(製造、Merck、Darmstadt)またはSP −ToyopearlもしくはCM−Toyopearl(製造、Tosoha
as)が使用され得る。
【0011】 出発材料としては、血漿または1つの血漿画分が使用され得る。血漿画分とし
ては、例えば、寒冷沈降物、可能であればプロトロンビン複合体因子の除去のた
めに予備的に吸着処理をした後のものであるか、または類似の血漿画分(例えば
、Cohn IのようなCohn画分)、またはPoolら(New Engl
and Journal of Medicine,273 1443−144
7)に従って対応する画分などが使用され得る。所定の場合には、フィブリノゲ
ンは、沈降により除去され得る。
ては、例えば、寒冷沈降物、可能であればプロトロンビン複合体因子の除去のた
めに予備的に吸着処理をした後のものであるか、または類似の血漿画分(例えば
、Cohn IのようなCohn画分)、またはPoolら(New Engl
and Journal of Medicine,273 1443−144
7)に従って対応する画分などが使用され得る。所定の場合には、フィブリノゲ
ンは、沈降により除去され得る。
【0012】 好ましくは、出発材料は、カルシウムイオンを含有する緩衝液に溶解される。
この緩衝液はまた、界面活性剤を含有し得る。使用する緩衝液のイオン強度は、
一般的に0〜10mS、好ましくは6〜8mSの範囲である。吸着したFVII
I:C/vWF複合体を洗浄する場合、この洗浄は、好ましくは、そのイオン強
度が吸着緩衝液よりも強い洗浄緩衝液によってされる。第VIII:C因子/v
WF複合体の溶出は、好ましくは分画されず、そのイオン強度の上昇によって達
成される。溶出緩衝液のイオン強度は、通常10〜100mS,好ましくは25
〜60mSの範囲である。溶出緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液またはヒスチジン含有緩衝液が使用され得る。好ましくは、塩化ナトリウ
ム含有溶出緩衝液が使用される。pHは、精製の際は、ほぼ中性であるべきであ
り、例えば、pH6〜8の範囲内に保持されるべきである。
この緩衝液はまた、界面活性剤を含有し得る。使用する緩衝液のイオン強度は、
一般的に0〜10mS、好ましくは6〜8mSの範囲である。吸着したFVII
I:C/vWF複合体を洗浄する場合、この洗浄は、好ましくは、そのイオン強
度が吸着緩衝液よりも強い洗浄緩衝液によってされる。第VIII:C因子/v
WF複合体の溶出は、好ましくは分画されず、そのイオン強度の上昇によって達
成される。溶出緩衝液のイオン強度は、通常10〜100mS,好ましくは25
〜60mSの範囲である。溶出緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液またはヒスチジン含有緩衝液が使用され得る。好ましくは、塩化ナトリウ
ム含有溶出緩衝液が使用される。pHは、精製の際は、ほぼ中性であるべきであ
り、例えば、pH6〜8の範囲内に保持されるべきである。
【0013】 クロマトグラフィー精製中の第VIII:C因子/vWF複合体の起こり得る
解離を阻害するために、好ましくは、カルシウム濃度が例えば、0.5〜10m
Mである緩衝液が使用される。
解離を阻害するために、好ましくは、カルシウム濃度が例えば、0.5〜10m
Mである緩衝液が使用される。
【0014】 ヒト病原体感染原、とりわけ、血液によって伝染するウイルス(例えば、HI
Vおよび肝炎ウイルス(例えば、HAV、HBV、HCV、HGV)およびパル
ボウイルスのみならずBSEおよびCJDの感染原)の伝染の危険を回避するた
めに、一連の処置がされ得る。第VIII:C因子/vWF複合体は、クロマト
グラフィー精製の前または後に、ヒト病原体の不活化および除去のための方法に
供され得る。抗ウイルス性化学物質を使用する方法は、特にクロマトグラフィー
精製方法の前および間に行うことが好ましく、それによって、第VIII:C因
子/vWF複合体の精製とともに、抗ウイルス剤を有効に除去することを同時に
行い得る。好ましくは、ウイルスの不活化および除去が異なる機構に基づいて作
用する、少なくとも2つの処置が使用される。このためには、化学的、物理化学
的および物理学的方法が含まれる。
Vおよび肝炎ウイルス(例えば、HAV、HBV、HCV、HGV)およびパル
ボウイルスのみならずBSEおよびCJDの感染原)の伝染の危険を回避するた
めに、一連の処置がされ得る。第VIII:C因子/vWF複合体は、クロマト
グラフィー精製の前または後に、ヒト病原体の不活化および除去のための方法に
供され得る。抗ウイルス性化学物質を使用する方法は、特にクロマトグラフィー
精製方法の前および間に行うことが好ましく、それによって、第VIII:C因
子/vWF複合体の精製とともに、抗ウイルス剤を有効に除去することを同時に
行い得る。好ましくは、ウイルスの不活化および除去が異なる機構に基づいて作
用する、少なくとも2つの処置が使用される。このためには、化学的、物理化学
的および物理学的方法が含まれる。
【0015】 ウイルスの不活化のための有効な処置には、例えば、有機溶媒および/または
界面活性剤での処理(EP−0 131 740、EP−0 050 061)
、カオトロピック剤での処理(EP−0 431 129)、熱処理方法(好ま
しくは、EP−0 159 311に記載されるように、凍結乾燥、乾燥または
湿潤条件下で)、EP−0 519 901のような組合せ方法および物理学的
方法が含まれる。最後のものは、ウイルスの不活化を、例えば光で、おおよそ光
感作因子の存在下で作用する(EP−0 471 794またはWO97/37
686)。
界面活性剤での処理(EP−0 131 740、EP−0 050 061)
、カオトロピック剤での処理(EP−0 431 129)、熱処理方法(好ま
しくは、EP−0 159 311に記載されるように、凍結乾燥、乾燥または
湿潤条件下で)、EP−0 519 901のような組合せ方法および物理学的
方法が含まれる。最後のものは、ウイルスの不活化を、例えば光で、おおよそ光
感作因子の存在下で作用する(EP−0 471 794またはWO97/37
686)。
【0016】 ヒト病原体の除去方法としてはまた、とりわけ、限外濾過フィルターの使用、
細密フィルター(Tiefenfilter)またはナノフィルター(A341
/98)の使用による濾過が挙げられる。しかし、沈降工程および他のタンパク
質精製処理(例えば、吸着)もまた、存在する可能性のある病原体の除去のため
に寄与する。
細密フィルター(Tiefenfilter)またはナノフィルター(A341
/98)の使用による濾過が挙げられる。しかし、沈降工程および他のタンパク
質精製処理(例えば、吸着)もまた、存在する可能性のある病原体の除去のため
に寄与する。
【0017】 本発明の方法は、工業的規模で第VIII:C因子/vWF複合体を1つの血
漿画分から精製することに特に適している。なぜなら、有効な位置工程精製のた
め、例えばさらなるクロマトグラフィー精製工程のような多数のさらなる精製工
程が必要とされないからである。現在、大規模技術での生物学的調製物の製造で
は、そのような高収率およびそのような高純度が達成され得る本発明のような簡
便な1工程の方法が所望される。
漿画分から精製することに特に適している。なぜなら、有効な位置工程精製のた
め、例えばさらなるクロマトグラフィー精製工程のような多数のさらなる精製工
程が必要とされないからである。現在、大規模技術での生物学的調製物の製造で
は、そのような高収率およびそのような高純度が達成され得る本発明のような簡
便な1工程の方法が所望される。
【0018】 驚くべきことに、第VIII:C因子/vWF複合体は、単純なカチオン交換
クロマトグラフィーによって、血漿に対して少なくとも300倍の純度、好まし
くは、少なくとも400倍の純度で、同時に、寒冷沈降物または類似の血漿画分
に対してFVIII:CおよびvWFについて少なくとも50%、好ましくは少
なくとも60%、最も好ましくは70%の高い収率で取得され得ることが示され
た。さらに、唯一のクロマトグラフィー精製、すなわちカチオン交換でのクロマ
トグラフィー精製のみが使用されるような精製方法を設計することが好ましい。
クロマトグラフィーによって、血漿に対して少なくとも300倍の純度、好まし
くは、少なくとも400倍の純度で、同時に、寒冷沈降物または類似の血漿画分
に対してFVIII:CおよびvWFについて少なくとも50%、好ましくは少
なくとも60%、最も好ましくは70%の高い収率で取得され得ることが示され
た。さらに、唯一のクロマトグラフィー精製、すなわちカチオン交換でのクロマ
トグラフィー精製のみが使用されるような精製方法を設計することが好ましい。
【0019】 クロマトグラフィー前の活性に対して90%を超える第VIII:C因子/v
WF複合体の収率が取得され得ることが示された。それゆえ、クロマトグラフィ
ー精製の間、変性によるかなりの喪失を恐れる必要なく、第VIII:C因子/
vWF複合体の通常の安定化剤(例えば、抗トロンビンIIIおよび/またはヘ
パリン)を回避し得る。
WF複合体の収率が取得され得ることが示された。それゆえ、クロマトグラフィ
ー精製の間、変性によるかなりの喪失を恐れる必要なく、第VIII:C因子/
vWF複合体の通常の安定化剤(例えば、抗トロンビンIIIおよび/またはヘ
パリン)を回避し得る。
【0020】 第VIII因子;CおよびvWFの活性は、カチオン交換クロマトグラフィー
の間殆ど影響を受けない。第VIII:C因子の活性は、例えば、色素原アッセ
イ(Immunochrom FVIII:C、製造、IMMUNO AG)を
用いて確認される。vWFの活性は、Thomasら(Haemostaseo
logie、14、133−139(1994))によるコラーゲン結合試験ま
たはELISAによって確認される。
の間殆ど影響を受けない。第VIII:C因子の活性は、例えば、色素原アッセ
イ(Immunochrom FVIII:C、製造、IMMUNO AG)を
用いて確認される。vWFの活性は、Thomasら(Haemostaseo
logie、14、133−139(1994))によるコラーゲン結合試験ま
たはELISAによって確認される。
【0021】 薬学的な第VIII:C因子/vWF複合体調製物の処方のために、通常とお
りに濾過し、そして滅菌し、ならびに必要に応じて凍結乾燥する。
りに濾過し、そして滅菌し、ならびに必要に応じて凍結乾燥する。
【0022】 本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明される。
【0023】 (実施例1) FVIII/vWF複合体のカチオン交換による単離 (実施例1A) 210gの寒冷沈降物を、950mlのCaCl2−ヘパリン含有クエン酸緩 衝液中に溶解し、そしてpH6.0に調整する。不溶部分(大部分はフィブリノ
ゲン)は分離した。存在する可能性のある病原ウイルスの不活化のために、この
明澄な溶液を1% Triton X100および0.3% TNBP(トリ(
n−ブチル)ホスファート)で処理した。100mlのFractogel E
MD−SO3 -−650(M)(製造、Merck,Darmstadt(DE)
)に、予め、伝導率を10mS/cmに平衡化した酢酸緩衝化NaCl溶液で、
pH6.0に合わせた、ウイルス不活化したFVIIIを吸着させた。このFV
IIIは、500mlの150mM NaCl溶液での洗浄を行った後、ゲルの
イオン強度を500mM NaClに上昇させて溶出させるた。
ゲン)は分離した。存在する可能性のある病原ウイルスの不活化のために、この
明澄な溶液を1% Triton X100および0.3% TNBP(トリ(
n−ブチル)ホスファート)で処理した。100mlのFractogel E
MD−SO3 -−650(M)(製造、Merck,Darmstadt(DE)
)に、予め、伝導率を10mS/cmに平衡化した酢酸緩衝化NaCl溶液で、
pH6.0に合わせた、ウイルス不活化したFVIIIを吸着させた。このFV
IIIは、500mlの150mM NaCl溶液での洗浄を行った後、ゲルの
イオン強度を500mM NaClに上昇させて溶出させるた。
【0024】 (実施例1B) Fractogel EMD−SO3 -の代わりに、この実施例においてはTo
yopearl SP−550Cを使用した。
yopearl SP−550Cを使用した。
【0025】 (結果) 収率/血漿 血漿に対する精製倍率 FVIII:C vWF 実施例1A 62% 68% 450倍 実施例1B 56% 62% 370倍 FVIII:CおよびvWFは、同様の画分において取得された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB ,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE,G H,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP ,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR, LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,M W,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD ,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR, TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW Fターム(参考) 4C084 AA06 BA34 CA36 DC15 NA06 ZA531 4C087 AA05 DA23 NA06 ZA53 4H045 AA10 AA20 BA53 CA42 EA24 FA71 GA23
Claims (4)
- 【請求項1】 第VIII:C因子/vWF複合体を含む調製物を産生する
方法であって、以下の工程: 血漿、寒冷沈降物または類似の血漿画分から選択した第VIII:C因子/v
WF複合体を含む出発物質を、カチオン交換体を用いて処理する工程であって、
ここで、該第VIII:C因子/vWF複合体が該カチオン交換体に結合する、
工程; 結合していない該出発物質を分離する工程;および 該第VIII:C因子/vWF複合体を、該カチオン交換体から溶出する工程
であって、ここで、該第VIII:C因子/vWF複合体が、血漿に対して少な
くとも300倍の純度、ならびに寒冷沈降物または類似の血漿画分に対して少な
くとも50%の収率の第VIII:C因子およびvWFを含有する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 カチオン交換体におけるクロマトグラフィーが唯一のクロマ
トグラフィー精製として行われる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記クロマトグラフィーが、抗ウイルス性殺傷物質の存在下
で行われる、請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記第VIII:C因子/vWF複合体が一工程で溶出され
る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/AT1998/000043 WO1998038220A1 (de) | 1997-02-27 | 1998-02-27 | Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie |
AT866/98 | 1998-05-20 | ||
AT0086698A AT408443B (de) | 1998-02-27 | 1998-05-20 | Verfahren zur gewinnung von gereinigtem faktor viii:c/vwf-komplex |
AT9800043 | 1998-05-20 | ||
PCT/AT1999/000048 WO1999043712A1 (de) | 1998-02-27 | 1999-02-25 | Verfahren zur herstellung von faktor viii/vwf-komplex |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002504561A true JP2002504561A (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=25594143
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000533462A Withdrawn JP2002504561A (ja) | 1998-02-27 | 1999-02-25 | 第VIII因子/vWF複合体の産生方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1056779B1 (ja) |
JP (1) | JP2002504561A (ja) |
AT (2) | AT408443B (ja) |
AU (1) | AU2503099A (ja) |
DE (1) | DE59913361D1 (ja) |
WO (1) | WO1999043712A1 (ja) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5200510A (en) * | 1987-06-16 | 1993-04-06 | Zymogenetics, Inc. | Method for purifying factor viii:c, von willebrand factor and complexes thereof |
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FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
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