JP2002504561A - 第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ複合体の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、カチオン交換体におけるクロマトグラフィーによる血漿または血漿画分からの第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体の製造方法に関し、ここで、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体は、血漿に対して少なくとも３００倍に精製され、そして寒冷沈降物または類似の血漿画分に対して、少なくとも５０％の収率の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子およびｖＷＦが取得される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、血漿または１つの血漿画分からカチオン交換クロマトグラフィーを
通じて第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を産生および精製するための方法に関
する。

【０００２】 血友病患者の治療のためには、第ＶＩＩＩ因子調製物が３０年よりも多く前か
ら使用されている。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体は、２つの分子、抗血友
病因子（第ＶＩＩＩ：Ｃ因子）およびフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）から
なる。両タンパク質は、異なる遺伝子の制御下で合成されるが、血漿では、非共
有結合複合体（第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体）として循環する。

【０００３】 抗血友病因子は、糖タンパク質であり、血友病Ａ患者において欠陥があるか、
または欠損している。フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、多量体糖タンパ
ク質であり、これは、フォン・ビルブラント病に罹患した患者において、低減し
た量でまたは質的に異常に存在する。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の血漿濃度は、およそ
１００ｎｇ／ｍｌと２００ｎｇ／ｍｌとの間であるが、ｖＷＦの濃度は、約１０
μｇ／ｍｌである。

【０００４】 薬学的に良好に受容されるＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｖＷＦ複合体の生産は、安定であ
るが、とりわけ所望されない随伴タンパク質を含まない産物として調製すること
を目的とすべきである。不必要なタンパク質の持込はそれぞれ、その中に所望さ
れない副作用の危険性が潜在している。

【０００５】 現在の技術水準において、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を取得するため
に種々のクロマトグラフィーが記載されている（例えば、アニオン交換クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィ
ーの手段）。

【０００６】 第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を、ヒト血漿からカチオン交換クロマトグ
ラフィーを用いて取得する方法は、ＥＰ−０ ６００ ４８０により公知である
。その文献においては、予備精製のために多工程が使用されており（とりわけ、
アニオン交換体に対する２回のクロマトグラフィー精製）、カチオン交換クロマ
トグラフィーは最後に行われる。多工程の精製では、かなりの活性の喪失を甘受
することになる。

【０００７】 米国特許第５，２７８，２８９号において、精製されそして安定な第ＶＩＩＩ
因子を１つの生物学的試料から取得する方法が記載されている。ここでは、カチ
オン交換カラムに生物学的試料が供されていたが、不完全に精製されたタンパク
質が得られたのみであった。完全な精製は、後続のアニオン交換カラムを介して
初めて達成された。この産物は、ＦＶＩＩＩ：Ｃを含み、このＦＶＩＩＩ：Ｃは
、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体の解離によって得られた。

【０００８】 本発明の課題は、高純度でかつ同時に高収量で、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ
複合体および単純なクロマトグラフィー方法を介した第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷ
Ｆ複合体の調製を実施可能にすることである。

【０００９】 この課題は、本発明に従って、カチオン交換体において、血漿の第ＶＩＩＩ：
Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を吸着および精製するためにカチオン交換クロマトグラフ
ィーを使用した産生方法によって解決され、ここで、この第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／
ｖＷＦ複合体は、血漿に対して少なくとも３００倍の純度および寒冷沈降物また
は類似の血漿画分に対して少なくとも５０％の収率のＦＶＩＩＩ：ＣおよびｖＷ
Ｆを伴って取得される。

【００１０】 カチオン交換材料としては、好ましくは、カルボキシ基またはスルフヒドリル
基を有する市販のカチオン交換材料が使用され得る。好ましくは、Ｓ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅまたはＤＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（製造：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＳＯ₃ ^-もしくはＦｒａｃｔｏｇ
ｅｌ ＥＭＤ−ＣＯＯ^-（製造、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）またはＳＰ −ＴｏｙｏｐｅａｒｌもしくはＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（製造、Ｔｏｓｏｈａ
ａｓ）が使用され得る。

【００１１】 出発材料としては、血漿または１つの血漿画分が使用され得る。血漿画分とし
ては、例えば、寒冷沈降物、可能であればプロトロンビン複合体因子の除去のた
めに予備的に吸着処理をした後のものであるか、または類似の血漿画分（例えば
、Ｃｏｈｎ ＩのようなＣｏｈｎ画分）、またはＰｏｏｌら（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２７３ １４４３−１４４
７）に従って対応する画分などが使用され得る。所定の場合には、フィブリノゲ
ンは、沈降により除去され得る。

【００１２】 好ましくは、出発材料は、カルシウムイオンを含有する緩衝液に溶解される。
この緩衝液はまた、界面活性剤を含有し得る。使用する緩衝液のイオン強度は、
一般的に０〜１０ｍＳ、好ましくは６〜８ｍＳの範囲である。吸着したＦＶＩＩ
Ｉ：Ｃ／ｖＷＦ複合体を洗浄する場合、この洗浄は、好ましくは、そのイオン強
度が吸着緩衝液よりも強い洗浄緩衝液によってされる。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖ
ＷＦ複合体の溶出は、好ましくは分画されず、そのイオン強度の上昇によって達
成される。溶出緩衝液のイオン強度は、通常１０〜１００ｍＳ，好ましくは２５
〜６０ｍＳの範囲である。溶出緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸
緩衝液またはヒスチジン含有緩衝液が使用され得る。好ましくは、塩化ナトリウ
ム含有溶出緩衝液が使用される。ｐＨは、精製の際は、ほぼ中性であるべきであ
り、例えば、ｐＨ６〜８の範囲内に保持されるべきである。

【００１３】 クロマトグラフィー精製中の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体の起こり得る
解離を阻害するために、好ましくは、カルシウム濃度が例えば、０．５〜１０ｍ
Ｍである緩衝液が使用される。

【００１４】 ヒト病原体感染原、とりわけ、血液によって伝染するウイルス（例えば、ＨＩ
Ｖおよび肝炎ウイルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＧＶ）およびパル
ボウイルスのみならずＢＳＥおよびＣＪＤの感染原）の伝染の危険を回避するた
めに、一連の処置がされ得る。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体は、クロマト
グラフィー精製の前または後に、ヒト病原体の不活化および除去のための方法に
供され得る。抗ウイルス性化学物質を使用する方法は、特にクロマトグラフィー
精製方法の前および間に行うことが好ましく、それによって、第ＶＩＩＩ：Ｃ因
子／ｖＷＦ複合体の精製とともに、抗ウイルス剤を有効に除去することを同時に
行い得る。好ましくは、ウイルスの不活化および除去が異なる機構に基づいて作
用する、少なくとも２つの処置が使用される。このためには、化学的、物理化学
的および物理学的方法が含まれる。

【００１５】 ウイルスの不活化のための有効な処置には、例えば、有機溶媒および／または
界面活性剤での処理（ＥＰ−０ １３１ ７４０、ＥＰ−０ ０５０ ０６１）
、カオトロピック剤での処理（ＥＰ−０ ４３１ １２９）、熱処理方法（好ま
しくは、ＥＰ−０ １５９ ３１１に記載されるように、凍結乾燥、乾燥または
湿潤条件下で）、ＥＰ−０ ５１９ ９０１のような組合せ方法および物理学的
方法が含まれる。最後のものは、ウイルスの不活化を、例えば光で、おおよそ光
感作因子の存在下で作用する（ＥＰ−０ ４７１ ７９４またはＷＯ９７／３７
６８６）。

【００１６】 ヒト病原体の除去方法としてはまた、とりわけ、限外濾過フィルターの使用、
細密フィルター（Ｔｉｅｆｅｎｆｉｌｔｅｒ）またはナノフィルター（Ａ３４１
／９８）の使用による濾過が挙げられる。しかし、沈降工程および他のタンパク
質精製処理（例えば、吸着）もまた、存在する可能性のある病原体の除去のため
に寄与する。

【００１７】 本発明の方法は、工業的規模で第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を１つの血
漿画分から精製することに特に適している。なぜなら、有効な位置工程精製のた
め、例えばさらなるクロマトグラフィー精製工程のような多数のさらなる精製工
程が必要とされないからである。現在、大規模技術での生物学的調製物の製造で
は、そのような高収率およびそのような高純度が達成され得る本発明のような簡
便な１工程の方法が所望される。

【００１８】 驚くべきことに、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体は、単純なカチオン交換
クロマトグラフィーによって、血漿に対して少なくとも３００倍の純度、好まし
くは、少なくとも４００倍の純度で、同時に、寒冷沈降物または類似の血漿画分
に対してＦＶＩＩＩ：ＣおよびｖＷＦについて少なくとも５０％、好ましくは少
なくとも６０％、最も好ましくは７０％の高い収率で取得され得ることが示され
た。さらに、唯一のクロマトグラフィー精製、すなわちカチオン交換でのクロマ
トグラフィー精製のみが使用されるような精製方法を設計することが好ましい。

【００１９】 クロマトグラフィー前の活性に対して９０％を超える第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖ
ＷＦ複合体の収率が取得され得ることが示された。それゆえ、クロマトグラフィ
ー精製の間、変性によるかなりの喪失を恐れる必要なく、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／
ｖＷＦ複合体の通常の安定化剤（例えば、抗トロンビンＩＩＩおよび／またはヘ
パリン）を回避し得る。

【００２０】 第ＶＩＩＩ因子；ＣおよびｖＷＦの活性は、カチオン交換クロマトグラフィー
の間殆ど影響を受けない。第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の活性は、例えば、色素原アッセ
イ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍ ＦＶＩＩＩ：Ｃ、製造、ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）を
用いて確認される。ｖＷＦの活性は、Ｔｈｏｍａｓら（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｅｏ
ｌｏｇｉｅ、１４、１３３−１３９（１９９４））によるコラーゲン結合試験ま
たはＥＬＩＳＡによって確認される。

【００２１】 薬学的な第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体調製物の処方のために、通常とお
りに濾過し、そして滅菌し、ならびに必要に応じて凍結乾燥する。

【００２２】 本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明される。

【００２３】 （実施例１） ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のカチオン交換による単離 （実施例１Ａ） ２１０ｇの寒冷沈降物を、９５０ｍｌのＣａＣｌ₂−ヘパリン含有クエン酸緩 衝液中に溶解し、そしてｐＨ６．０に調整する。不溶部分（大部分はフィブリノ
ゲン）は分離した。存在する可能性のある病原ウイルスの不活化のために、この
明澄な溶液を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および０．３％ ＴＮＢＰ（トリ（
ｎ−ブチル）ホスファート）で処理した。１００ｍｌのＦｒａｃｔｏｇｅｌ Ｅ
ＭＤ−ＳＯ₃ ^-−６５０（Ｍ）（製造、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ（ＤＥ）
）に、予め、伝導率を１０ｍＳ／ｃｍに平衡化した酢酸緩衝化ＮａＣｌ溶液で、
ｐＨ６．０に合わせた、ウイルス不活化したＦＶＩＩＩを吸着させた。このＦＶ
ＩＩＩは、５００ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液での洗浄を行った後、ゲルの
イオン強度を５００ｍＭ ＮａＣｌに上昇させて溶出させるた。

【００２４】 （実施例１Ｂ） Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＳＯ₃ ^-の代わりに、この実施例においてはＴｏ
ｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−５５０Ｃを使用した。

【００２５】 （結果） 収率／血漿 血漿に対する精製倍率 ＦＶＩＩＩ：Ｃ ｖＷＦ 実施例１Ａ ６２％ ６８％ ４５０倍 実施例１Ｂ ５６％ ６２％ ３７０倍 ＦＶＩＩＩ：ＣおよびｖＷＦは、同様の画分において取得された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA06 BA34 CA36 DC15 NA06 ZA531 4C087 AA05 DA23 NA06 ZA53 4H045 AA10 AA20 BA53 CA42 EA24 FA71 GA23

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を含む調製物を産生する
   方法であって、以下の工程： 血漿、寒冷沈降物または類似の血漿画分から選択した第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖ
   ＷＦ複合体を含む出発物質を、カチオン交換体を用いて処理する工程であって、
   ここで、該第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体が該カチオン交換体に結合する、
   工程； 結合していない該出発物質を分離する工程；および 該第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体を、該カチオン交換体から溶出する工程
   であって、ここで、該第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体が、血漿に対して少な
   くとも３００倍の純度、ならびに寒冷沈降物または類似の血漿画分に対して少な
   くとも５０％の収率の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子およびｖＷＦを含有する、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 カチオン交換体におけるクロマトグラフィーが唯一のクロマ
   トグラフィー精製として行われる、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記クロマトグラフィーが、抗ウイルス性殺傷物質の存在下
   で行われる、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記第ＶＩＩＩ：Ｃ因子／ｖＷＦ複合体が一工程で溶出され
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。