KR20060070543A - 알파-１-항트립신 용액의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

하기 단계를 포함하는, AlAT 함유 용액으로부터 A1AT를 제조하는 방법:

(a) AlAT 함유 용액을 이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

(b) 지질 외피의 바이러스를 불활성화시키기 위해 세정제 및 임의로 용매를 첨가하는 단계;

(c) 세정제를 염석시키기 위해 염 농도를 증가시키는 단계.

A1AT는 이의 활성 형태로 90% 이상의 순도를 가지며, 0.8 PEU/mg 이상의 활성을 가진다.

Description

알파-１-항트립신 용액의 제조 방법{Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution}

본 발명은 알파-1-항트립신(A1AT)을 포함하는 용액의 제조 방법, 및 A1AT에 관한 것이다.

A1AT는 분자량이 약 55,000 달톤이며, 세린-프로테아제 저해제의 패밀리에 속하는 당단백질이다. A1AT는 수많은 프로테아제, 예를 들면, 저해제의 이름이 역사적인 이유에 기초한 트립신의 활성을 저해할 수 있다. 생리학적으로, 엘라스타아제는 특히 조직 및 기질 재구성 및 분해 과정에 관여되며, 과립백혈구와 같은 세포에 의해 방출되며, 염증 과정에 관여하는 표적 프로테아제이다. 엘라스타아제 활성의 지속은 시간 및 공간적으로 제한되며, 본질적으로 저해제 A1AT에 의해 조절된다. 상기 활성의 조절곤란은 조직의 빠른 분해를 초래하며, 병태생리학적 결과를 가질 수 있다. 게다가, 염증 과정이 시작되고/되거나 개선된다. 엘라스타아제의 감소되거나 결여된 조절의 알려진 예는 동반하는 염증 현상을 갖는 폐에서 진행성 국부 조직 분해이며, 이는 점진적으로 폐기종을 초래하므로, 부분적으로 현저하게 제한된 폐 기능을 동반한다. 최종 단계에서, 이는 환자의 사망을 초래할 수 있으며, 이는 궁극적으로 폐 이식에 의해 단지 예방될 수 있다.

상기 환자는 결여된 A1AT 또는 이의 기능이 제한된 A1AT로부터 고생한다. 상기 저해제는 간에 의해 비교적 대량으로 통상 제조되고 분비되며, 비교적 고농도로 혈장에서 순환한다 (전형적인 농도는 1.3 mg/ml이다). 게다가, A1AT의 생리학적으로 효과적이고 충분한 농도는 건강한 사람의 기관, 특히 폐액(상피벽액)에서 발견된다. 상기 A1AT 농도가 현저하게 감소되거나 또는 존재하는 A1AT가 이의 기능이 제한되거나 또는 불활성화되면, 전술한 결과를 갖는 폐 조직의 조절되지 않는 퇴행이 존재한다.

결여된 A1AT 또는 이의 저해 기능이 감소된 A1AT에 대한 이유는 주로 유전적인 결함이다. 특히 동형접합(PiZZ) 개인에서, 소위 "Z" 돌연변이는 이를 합성하는 세포에서 이미 A1AT 분자의 중합을 초래한다. 따라서, A1AT는 더 이상 순환에 도달할 수 없거나 또는 단지 매우 소량으로 도달할 수 있다. 이는 한편으로는, 결여된 저해 활성을 초래하며, 이는 장기간에 걸쳐 폐에서 특히 명백하며, 다른 한편으로는, 간세포에서 중합체의 농축을 초래하여, 해당하는 기능성 장애를 초래한다. 이형접합 PiZ 개인은 대응하여 감소된 저해능을 가진다. 유사한 결함을 갖는 추가의 돌연변이가 공지되어 있다.

현재 평가에 따라, 미국에서 PiZZ 돌연변이의 유병률은 인구의 1/1600 정도이며; 따라서, 돌연변이의 보균자의 수는 현저하게 더 높으며, 이 중에서 추측상 단지 10%가 확인되었다.

A1AT 결핍 또는 기능이 감소된 A1AT에 기초한 폐 기능성 장애 (진행성 폐기종)으로 고생하는 환자 중에서, 모든 환자가 현재로 치료될 수 있는 것은 아닌데, 이는 치료 및/또는 예방용 A1AT가 인증된 약물로서 충분히 유용하지 않기 때문이다. 확립된 치료는 공여자 혈장으로부터 제조된 AlAT 함유 용액의 정맥내 투여에 기초한다. 확립되고 현재 추천된 투여량은 매달 환자당 16-20 그램의 A1AT의 평균 소비에 해당하는 주당 체중 kg 당 60 mg의 A1AT이다. 이는 차례로 평균하여 15 리터의 혈장에 포함되는 양에 해당한다. 출발 물질의 혈장에 포함된 저해제의 단지 부분이 제제로서 순수한 형태로 수득되는 것을 고려하면, 복수의 15 리터의 정상적인 혈장이 매달 한 명의 환자에 대한 원료로서 요구된다. A1AT의 회복 및 환자의 영원한 치료를 위한 원료로서 요구되는 혈장의 총 부피는 따라서 크다.

A1AT 제제를 제조하는 확립된 제조 방법은 출발 물질로서 소위 Cohn IV1 페이스트를 이용한다. 후자는 본질적으로 첨가된 에탄올 농도가 변하며, pH 값이 조절되며, 용액의 온도가 변하는 혈장 단백질의 분획 분리에 기초한 당업자에게 친숙한 Cohn-Oncley 방법, 또는 이의 변형을 통해 제조된다. AlAT 외에, 소위 분획 IV1은 통상적으로 부분적으로 이전의 침전 단계에 의해 이미 감소된 양으로 다양한 기타 혈장 단백질을 포함한다. 상기 방법의 변이는 Kistler-Nitschmann 방법이다. 따라서, Cohn IV1 분획과 유사한 분획뿐만 아니라, 기타 AlAT 함유 분획, 예를 들면, 소위 상층액 I+II+III이 또한 출발 물질로서 이용될 수 있다.

다소 순수한 A1AT 제제를 제조하는 다양한 방법이 기재되어 왔다. 특히 음이온 교환기를 통한 A1AT의 농축을 위한 이온 교환 크로마토그래피의 이용이 반복적으로 보고되어 왔다 (Gray et al., 1960; Crawford et al., 1973; Chan et al., 1973; 등). 그러나, 상기 제조 단계 단독으로는 당업계의 상태에 해당하는 순도를 갖는 A1AT 제제를 수득하지 못한다. 그러므로, 기타 제조 단계가 부분적으로 이온 교환기와 조합하여 이용된다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(US-A-4,379,087), 징크 킬레이트 또는 헤파린 흡착제(US-A-4,629,567) 또는 기타와 함께 인큐베이션하는 것과 같은 흡착 또는 침전 방법이 이용된다. 상기 방법은 A1AT의 (추가의) 정제에 이용되나, 이의 각각에서 산물 수율의 다소 큰 손실을 감수해야 한다. 원칙적으로, 산물 손실은 제조 단계의 수가 증가할수록 증가한다. 게다가, 이는 종종 제조 시간의 연장을 동반하는데, 이는 A1AT의 완전성 및 활성을 손상시킬 수 있으며, 제조 비용을 증가시킨다.

단백질 제조 단계 외에, 소위 바이러스 불활성화 단계 또는 고갈 단계가 혈장으로부터 제조된 단백질 산물의 제조 공정의 본질적인 부분이다. 이의 보호하는 지질 외피를 손상시킴으로써 해당하는 바이러스를 불활성화시키는 소위 SD(용매/세정제) 방법 외에, 열 불활성화 방법, 예를 들면, 저온살균 (60℃에서 10시간 동안 열 처리)이 바이러스 안전성을 증가시키기 위해 적용된다. "나노필터"를 통한 여과는 통상 바이러스의 크기에 의존하여 지질 외피이든지 지질이 없든지 간에 바이러스를 보유한다. 이의 각각이 그 자체로 효과적이며, 최대 바이러스 안전성을 위한 하나의 제조 공정으로 함께 상이한 원리에 기초한 2개의 공정 단계를 통합하는 것이 당업계의 현실이다.

단백질에 의존하여, 안정화제, 예를 들면, 아미노산 또는 당이 단백질을 안정화시키기 위해 상기 제조 단계 동안 첨가된다. 따라서, 상기는 이후에 AlAT 함유 용액으로부터 제거되어야 한다. SD 방법에서, 세정제가 바이러스 불활성화를 위한 활성 물질로서 첨가되는데, 이는 적당한 방법에 의해 제조 공정의 과정에서 제거되어야 한다. 상기 목적을 위해, 소수성 기질에 흡착, 예를 들면, 고정화된 C18 사슬을 이용한 크로마토그래피가 확립되었다. 상기 크로마토그래피는 다시 산물 수율 손실을 동반하며, 방법에서 각각의 (추가의) 크로마토그래피 단계의 전술한 결점을 포함한다. 게다가, 상기 기질은 대체로 반복적으로 이용되는데, 즉, 비용 집약적이고 시간 소모하는 기질 재생 단계가 요구된다.

따라서, 하나의 대안인 크로마토그래피 단계를 필요 없게 하는 세정제의 정성적인 제거를 위한 효과적이고 신속한 방법이 기재되어 왔다 (WO 94/26287, US-A-5,817,765). 그리하여, 세정제 함유 단백질 용액을 초생리학적 농도 (≥0.5 M)의 염, 예를 들면, Na 시트레이트으로 가져와 예를 들면, 간단히 여과에 의해 분리하여 제거할 수 있는 세정제 함유 입자를 형성한다. 하기에서, 상기 방법은 "세정제/염석" 방법으로서 언급된다.

WO 94/26287의 실시예에서, "세정제/염석" 방법이 트랜스페린, 항트롬빈 III 및 알부민인 용액 중의 3가지 분리된 단백질에 적용된다. 상기 실시예에서, 방법은 각각 95%의 단백질 활성의 회복을 초래하며, 세정제 농도의 감소를 초래한다. 상기 방법이 표적 단백질의 수율이 너무 많이 영향을 받지 않는 조건하에 적용된다면, 자주 산물 중의 Triton의 농도는 여전히 높다. WO 94/26287의 실시예 4에서, 발명가는 알부민 활성의 95%를 회복할 수 있으나, 250 ppm Triton X-100 및 35 ppm TNBP를 포함하는 산물을 수득할 수 있다. 특히 의약 제제를 제조할 때, 50 ppm 이상, 바람직하게는 10 ppm 이상의 Triton X-100 농도를 피해야 하며, 세정제 함량을 가능한 한 많이 감소시키는 것이 일반적으로 바람직하다.

본 발명의 목적은 가능한 한 효과적이며 신속하게 고 품질 및 안전성 산물을 초래하는 A1AT 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 방법 동안 A1AT의 활성 및/또는 품질은 악영향을 받아서는 안 되며, 세정제는 의약 제제에 허용가능한 수준으로 제거되어야 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 기타 단백질 성분이 제거되는 동안, A1AT를 함유하는 용액의 정제 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, A1AT 용액은 또한 지질 또는 바이러스와 같은 기타 성분이 제거되어야 한다.

상기 목적은 하기 단계를 포함하는, AlAT 함유 용액으로부터 A1AT를 제조하는 방법에 의해 달성된다:

(a) AlAT 함유 용액을 이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

(b) 지질 외피의 바이러스를 불활성화시키기 위해 세정제 및 임의로 용매를 첨가하는 단계;

(c) 세정제를 염석시키기 위해 염 농도를 증가시키는 단계.

더욱이, 본 발명의 문제는 제 1 항 내지 제 19 항에 의해 정의된 구현예에 의해 해결된다. AlAT 함유 용액, 예를 들면, 재구성된 혈장 분획 IV1 (Cohn)으로부터 A1AT의 제조 방법은 A1AT의 농축의 면에서 단지 2가지 매우 효율적인 제조 단계로 원칙적으로 이루어지는데; 즉, 음이온 교환기를 통한 크로마토그래피, 및 Triton X-100 및 TnBP를 이용한 SD 바이러스 불활성화 처리에 이은, 상기 바이러스 불활성화 물질의 염석이다.

최종 언급된 단계가 또한 AlAT 함유 용액에 매우 효과적으로 이용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 방법은 A1AT 함유 용액이 A1AT와 상이한 현저한 양의 단백질을 포함할 때 특히 유용하다. 놀랍게도, 제조 조건하에, 상기 제조 단계는 바이러스 불활성화를 위한 세정제를 제거하는데 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 부가적으로 A1AT의 수율에 악 영향을 주지 않으면서, 임의의 단백질, 지질단백질 및 지질 불순물의 분리에 대해 현저한 정제 효과를 가진다. 전술한 음이온 교환 크로마토그래피와 조합하여, 본질적으로 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 순도를 가지며, 이의 활성화 형태로 A1AT를 포함하는 A1AT 산물이 수득된다. 용매 세정제 처리 및 염석의 제조 단계는 80% 이상의 수율로 활성 A1AT를 회수한다. 재구성된 페이스트 IV1가 예를 들면 출발 물질로서 이용된다면, 본 발명의 방법은 A1AT를 함유하는 용액으로부터 α-2-마크로글로불린, 합토글로빈, α-1 산성 당단백질, IgG, IgA 및 IgM의 제거로 인한 A1AT의 정제를 허용한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 염석 단계 후의 A1AT 함유 용액은 예를 들면, 이전의 음이온 교환 크로마토그래피의 용출액인 용매/세정제 처리 전의 A1AT 용액을 참고로, 10% 이하의 α-2-마크로글로불린, 40% 이하의 합토글로빈, 10% 이하의 α-1 산성 당단백질, 10% 이하의 IgG, 10% 이하의 IgA 및/또는 10% 이하의 IgM을 회수한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 초기 A1AT 함유 용액은 50% 이하, 20% 이하 또는 10%(w/w) 이하의 기타 단백질을 포함한다. 초기 용액은 바람직하게는 1, 2 또는 5 % (w/w) 이상의 기타 단백질을 포함한다.

더욱이 추가로, 또한 놀랍게도 본 발명의 방법은 또한 바이러스 불활성화 및/또는 고갈 단계로서 유용하다는 것이 관찰되었다. A1AT가 고 수율로 회수될지라도, 상기 산물은 기타 단백질 성분으로부터 뿐만 아니라, 바이러스로부터 고갈되거나 감소된다. 이는 비지질 코팅된 바이러스에 대해 특히 유용한데, 이는 지질 코팅된 바이러스가 이미 세정제 처리에 의해 불활성화될 것이기 때문이다. 본 발명의 방법은 그리하여 또한 A1AT를 포함하는 용액에서 특히 비지질 코팅된 바이러스의 바이러스 불활성화 방법이다.

WO 94/26287에 기재된 바와 같이 "세정제/염석" 방법이 본 발명의 경우에 적용가능하며, 의약 제제에서 허용가능한 수준으로 세정제의 제거를 초래하며, 더욱이 A1AT의 매우 특이적인 농축을 초래한다는 발견은 놀랍다. WO 94/26287의 방법이 감소된 세정제 농도를 갖는 산물을 초래할 수 있다는 것을 가정할 수 있는데, 이는 그럼에도 불구하고 약품에 대해 여전히 너무 높으며, 세정제를 제외한 모든 단백질 및 기타 성분이 유사한 속도로 회수된다. 그러므로, WO 94/26287의 방법은 기타 단백질로부터 단백질의 정제에 유용할 것이라는 것을 가정할 수 없을 것이다.

예를 들면, Phenyl-Sepharose

상의 소수성 (상호작용) 크로마토그래피 (HIC)의 이용은 여전히 더욱 높은 순도를 갖는 A1AT 산물을 달성하고자 한다면 바람직하다. 상기 단계의 수행은 세정제/염석 처리에 이어서 특히 자체로 제안되는데, 이는 소수성 기질 또는 리간드에 대한 단백질 결합이 통상 초생리학적 염 농도의 존재하에 매개되기 때문이다. 결합된 단백질의 용출은 이어서 예를 들면, 염 농도를 감소시킴으로써 수행된다. 대응하여, "염석된" 세정제의 직접 제거 후에 또는 염 농도의 합당한 감소 후에(희석 또는 한외여과/정용여과; UF/DF에 의해), AlAT 함유 용액은 소수성 기질과 접촉될 수 있으며, 당업자에게 친숙한 크로마토그래피가 수행될 수 있다.

AlAT 함유 용액의 SD 처리 외에, 바이러스 불활성화, 바이러스 제거 및/또는 프리온 제거를 위한 하나 이상의 추가 단계가 상기 방법에 통합될 수 있는데, 예를 들면, A1AT 함유 용액의 열 바이러스 불활성화이다. 상기 단계는 특히 염석의 제조 단계에 이어 용액에서 직접 수행될 수 있는데, 이는 용액에 포함된 염의 양, 특히 소듐 시트레이트가 열 처리 동안 안정화제로서 이용되기 때문이다. 또 다른 가능성으로서, 동결건조된 산물의 열 처리는 그 자체로 제안된다. 대안적으로 또는 게다가, 바이러스 또는 프리온의 제거를 위한 임의의 적당한 여과 방법이 포함될 수 있다. 특히 나노여과가 당업자에게 친숙하며, 바람직하게는 15 내지 20 nm 범위의 공극 크기를 갖는 시판되는 필터 또는 바이러스 및/또는 프리온을 제거하기 위한 임의의 적합한 여과를 갖는 방법에 통합될 수 있다. 상기 바이러스 제거는 바람직하게는 각 아미노산에 대해 0.1M의 농도로 아미노산의 첨가에 의해 개선될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 글리신은 0.2M의 농도로 첨가된다. 바람직한 방법은 Yokoyama 등 (2004, Vox Sanguinis 86,225-229)에 의해 기재된다.

본 발명에 따른 AlAT 함유 제제는 원칙적으로 하기 단계의 조합의 특징이 있는 방법에 의해 수득가능하다:

(a) AlAT 함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

(b) 임의로 헤파린 친화성 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)하는 단계;

(c) 지질 외피의 바이러스를 불활성화시키기 위해 세정제 및 임의로 용매를 첨가하는 단계;

(d) 상기 화학물질 및 단백질 불순물을 염석하는 단계;

(e) 하나 이상의 바이러스 불활성화 및/또는 제거 단계를 수행하는 단계.

일반적으로, 혈장 및 이의 분획 또는 재조합 또는 트랜스제닉으로 발현된 A1AT로부터 수득된 AlAT 함유 용액이 적합하다.

상기 방법의 바람직한 구현예에서, 페이스트 IV1 (Cohn)은 물 또는 완충 용액, 더욱 바람직하게는 20 mM 트리스 완충 용액을 이용하여 재구성하여 용액 대 페이스트의 비율이 3:1 이상 (바람직하게는 >10:1)에 도달하게 한 후, 이온 교환 겔, 바람직하게는 음이온 교환 겔, 바람직한 구현예에서 DEAE Sepharose

(Amersham), 더욱 바람직하게는 DEAE-Sepharose

Fast Flow와 접촉되며, 겔을 세정하고, A1AT를 이온 강도를 증가시킴으로써 용출한다. 바이러스 불활성화는 예를 들면, EP-A-0 131 740에 따른 방법에 의해 수행된다. 안정화제의 임의의 첨가에 이어 바이러스 불활성화제, 바람직하게는 0.1%(w/w) 이상의 Triton 및 Tween 80, 0.03%(w/w) 이상의 TnBP, 0.1 mM 이상의 카프릴산/카프릴레이트의 최종 농도로 Triton X-100, 폴리소르베이트 80 (Tween 80), TnBP 및/또는 카프릴산/카프릴레이트를 첨가한다. 4℃ 이상에서, 더욱 바람직하게는 15℃ 이상에서, 적당한 인큐베이션 시간, 바람직하게는 0.1 시간 이상, 더욱 바람직하게는 1 시간 이상 후에, 염 농도는 특히 시트레이트를 이용하여 0.5M 이상의 농도로 증가된다. 이렇게 형성된 입자를 특히 여과에 의해 제거한다. 필터 또는 분리된 입자를 재세정하는 것은 A1AT 수율의 증가를 초래할 수 있다. 이는 추가의 바이러스-불활성화 단계, 바람직하게는 0.5 M 이상의 소듐 시트레이트, 아미노산, 당 또는 상기 물질의 혼합물의 존재하에 저온살균이 뒤따를 수 있다. 첨가된 물질의 농도의 이은 감소는 바람직하게는 한외여과/정용여과에 의해 수행된다. 더욱 바람직하게는, 바이러스 입자의 이은 분리는 나노필터, 바람직하게는 15-20 nm의 공극 크기를 갖는 필터를 통해 수행된다. 상기 수득된 A1AT는 액체 또는 동결된 제제로서 저장되거나 또는 당업자에게 친숙한 방법에 의해 동결건조될 수 있다.

제 12 항 내지 제 17 항에 의해 정의된 본 발명의 A1AT는 선행 기술의 제제와 상이하다. EP436086 및 DE4407837의 제제는 본 발명의 제제의 고순도를 갖지 않으며, lmg/ml 이하의 IgA 함량을 가진다.

상기 수득된 A1AT 산물은 용액으로서 피하로, 근육내로, 국부적으로 또는 에어로졸로서, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 건조된 물질로서, 또한 분말 형태로 흡입용으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 정맥내 적용을 위해, 기타 용액과의 혼합물로 적용이 가능하다. 가능한 투여량은 예를 들면, 주당 체중 kg당 60 mg, 또는 매달 250 mg/kg이다.

또 다른 바람직한 방법은 전술한 제조 단계 외에 HIC, 바람직하게는 전술한 바와 같이 바이러스 사멸제 및 기타 불순물의 SD 처리 및 염석 후에, 바람직하게는 페닐 기질을 통한 HIC를 포함한다. 바람직하게는, 역 정제가 수행되는데, 즉, 귀중한 물질인 A1AT이 크로마토그래피 기질을 결합되지 않은 상태로 통과하고, 바람직하지 못한 물질이 결합되고, 제조 용액으로부터 제거된다.

전술한 HIC를 포함할 수 있는 또 다른 바람직한 방법에서, 고정화된 헤파린 상의 크로마토그래피, 바람직하게는 헤파린-세파로오스 또는 헤파린-프락토겔을 통한 크로마토그래피가 수행된다. 그리하여, AlAT 함유 용액을 칼럼 또는 배취 방법으로 헤파린 겔과 접촉한다. 농축된 A1AT는 결합되지 않은 상태로 칼럼을 통과하거나, 또는 겔 분리 후에 상층액에 발견된다. 상기 제조 단계는 바람직하게는 전술한 이온 교환 크로마토그래피 전 또는 후에, 또는 세정제의 염석 및 예를 들면, 투석에 의한 용액의 이온 강도의 감소 후에 수행된다.

본 발명에 따라 또한 청구되는 것은 항염증제, 바람직하게는 스테로이드인 NSAID와 조합하여 또는 유일한 활성 성분으로서 본 발명에 따른 A1AT를 포함하는 약물 및 A1AT 결핍, 폐의 퇴화 현상, 예를 들면, 폐 섬유증 및 폐기종의 치료용 약물의 제조를 위한 본 발명에 따른 A1AT의 용도이다.

AlAT 함유 약물의 적당한 적용 형태는 그 자체로 당업자에게 알려져 있다. 특히, 단백질에 대한 모든 적용 형태가 적합한데, 예를 들면, 비경구적 적용, 정맥내 또는 흡입기 투여이다.

도 1은 환원 조건, 구배 4-20%, 쿠마시 염색, 5㎍ 단백질/레인하에 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 용매/세정제 처리 전에 실시예 1에 따른 용액의 프로브; 레인 3: 염석 단계 후에 실시예 1에 따른 용액의 프로브.

실시예 1:

재구성을 위해, 동결된 Cohn IV1 페이스트를 알칼리 pH에서 3 시간 동안 교반하면서 1:9의 중량비로 20 mM Tris 용액에 용해한다.

음이온 교환 크로마토그래피

상기 제조 단계를 위한 바람직한 크로마토그래피 물질은 DEAE-Sepharose FF (Fast Flow)이나 조건은 또한 각각의 음이온 교환 물질에 대해 당업자에 의해 변형될 수 있다. 팩킹된 DEAE-Sepharose FF 크로마토그래피 칼럼을 20 mM Tris 용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨다. 그 후에, 용해된 Cohn IV1 페이스트를 pH 8.0에 적용한다. 세정을 평형 완충액으로 수행한 후, 완충 용액으로 세정 단계를 수행한다.

상기 기질에 결합된 A1AT는 이어서 상기 칼럼을 20 mM Tris, 0.075 M NaCl, pH 8.0로 세정함으로써 용출될 수 있다. 상기 수득된 A1AT 용액의 비활성은 약 0.5 PEU/mg 단백질이다 (PEU: 혈장 당량 단위는 인간 혈장의 1 밀리리터에 평균하여 발견되는 A1AT의 활성의 양에 해당한다). 상기 칼럼을 높은 염 완충액(예를 들면, 2M NaCl)을 이용하여 용출하며, 크로마토그래피 겔은 이어서 그 자체로 공지된 방법에 의해 재생될 수 있다.

용매/세정제 처리

상기 수득된 용출액을 한외여과로 농축한다. 이어서, Triton X-100, TnBP 및 약학 용도의 물(WFI)의 예비혼합된 용액을 1% (w/w) Triton X-100 및 0.3% (w/w) TnBP의 최종 농도에 도달하도록 첨가한다. 상기 SD 처리를 부드럽게 교반하 면서 20℃에서 4 시간 동안 수행한다.

염석

SD 시약을 제거하고, 바람직하지 않은 동반되는 단백질을 침전시키기 위해, AlAT 함유 용액을 1.5 M 소듐 시트레이트 및 20 mM Tris, pH 7.0을 포함하는 용액을 이용하여 희석한다. 1M의 시트레이트 농도의 첨가는 교반하면서 15분 이상에 걸쳐 수행된다. 이어서, 제조 용액을 부드럽게 교반하면서 1시간 이상 동안 인큐베이션한다. 형성된 백색 침전물을 이어서 여과로 분리하여 제거한다. 이는 SD 시약의 농도를 10 ppm 미만으로 감소시키며, 바람직하지 않은 동반되는 단백질 및 변성된 A1AT가 또한 분리되어 제거된다.

상기 제조 단계 후에, A1AT의 비활성은 0.8 PEU/mg 이상이다 (PEU: 혈장 당량 단위는 인간 혈장의 1 밀리리터에 평균하여 발견되는 A1AT의 활성의 양에 해당한다).

나노여과

UF/DF를 통한 저분자량 물질의 제거 후에, 상기 수득된 용액을 15-20 nm의 명목상의 배제 크기를 갖는 필터, 예를 들면, Pall 사의 DV20 필터를 통해 여과하여, A1AT 산물의 바이러스 안전성을 추가로 증가시킨다.

결과:

여과 후의 산물 중의 Triton X-100 및 TNBP의 농도는 5 ppm 미만이었다. 산물 중의 A1AT 및 기타 단백질 성분의 양을 측정하고, 용매/세정제 처리 전에 측정된 양과 비교하였다. 하기 회수율이 계산되었다:

A1AT > 80%

α-2-마크로글로불린 < 10%

합토글로빈 < 40%

α-1 산성 당단백질 < 10%

IgG < 10%

IgA < 10%

IgM < 10%

상기 결과는 산물에서 A1AT는 특이적으로 높은 양으로 회수된 반면, 산물은 기타 단백질 성분으로부터 현저하게 고갈되었다는 것을 보여준다. 이는 추가로 도 1에 예시되는데, 이는 용매/세정제 처리 전(레인 2) 및 염석 단계 후(레인 3)의 용액의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. A1AT는 50kD 위의 약간 넓은 밴드에 해당한다 (레인 1에서의 분자량 마커와 비교하여). 출발 용액에서 명백하게 검출가능한 다양한 기타 단백질 성분이 현저하게 감소된다.

실시예 2

실시예 1에 기재된 방법을 변형하여, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 AlAT 함유 용출액을 헤파린-세파로오스와 접촉시킨다. A1AT는 결합되지 않고 헤파린-세파로오스 칼럼을 통과한다. 배취 작업이 이용된다면, A1AT는 상층액에 남아 있다. 칼럼 용출액 또는 배취 변이체로부터의 상층액의 추가의 가공은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된다. 상기 수득된 산물은 증가된 순도의 특징이 있다.

Claims (19)

1. 하기 단계를 포함하는, AlAT 함유 용액으로부터 A1AT의 제조 방법:

   (a) AlAT 함유 용액을 이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

   (b) 지질 외피의 바이러스를 불활성화시키기 위해 세정제 및 임의로 용매를 첨가하는 단계;

   (c) 세정제를 염석시키기 위해 염 농도를 증가시키는 단계.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 AlAT 함유 용액이 혈장 또는 이의 분획, 바람직하게는 재구성된 혈장 분획 IV1 (Cohn)으로부터 수득되거나, 또는 재조합적으로 또는 트랜스제닉으로 발현된 A1AT 제제 또는 발효 상층액으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 및/또는 제 2 항에 있어서,

   이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 겔, 바람직하게는 DEAE-Sepharose

   

   또는 DEAE-Sepharose

   

   Fast Flow 상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   단계 (b)에 따른 상기 바이러스 불활성화는 4℃ 이상에서, 특히 15℃ 이상에 서, 0.1 시간 이상, 바람직하게는 1 시간 이상의 인규베이션 시간으로, 바람직하게는 0.1%(w/w) 이상의 Triton 및 Tween 80, 0.03%(w/w) 이상의 TnBP, 0.1 mM 이상의 카프릴산 또는 카프릴레이트의 최종 농도로 Triton X-100, 폴리소르베이트 80 (Tween 80), TnBP 및/또는 카프릴산 또는 카프릴레이트를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 용액의 염 농도를 단계 (c)에서 0.5 M 이상으로 가져오며, 상기 형성된 입자는 바람직하게는 여과로 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

   소수성 크로마토그래피 물질 상에서 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   고정화된 형태의 헤파린을 포함하는 물질(헤파린 겔)을 이용한 AlAT 함유 분획의 처리를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

   추가의 바이러스 불활성화 단계가 바람직하게는 0.5 M 이상의 소듐 시트레이 트, 아미노산, 당 또는 이의 혼합물의 존재하에 저온살균 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 용액의 이온 강도가 바람직하게는 한외여과/정용여과에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

    바이러스 입자의 분리가 바람직하게는 15-20 nm의 공극 크기를 갖는 필터를 이용한 나노여과에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,

    수득된 A1AT 분획이 액체로서 저장되거나, 동결되거나 또는 동결건조된 제제인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 90% 초과의 순도, 이의 활성 형태로 0.8 PEU/mg 이상의 활성, 1 mg/ml 이하의 IgA 함량, 50 ppm 미만, 특히 10 ppm 미만의 잔존 세정제 함량, 및 A1AT 총량 기재로 90% 초과의 단량체 함량을 갖는 A1AT.
13. 제 12 항에 있어서,

    하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 A1AT:

    - 혈장 분획 IV1 (Cohn)을 재구성하는 단계;

    - DEAE-Sepharose

    

    Fast Flow 상에서 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

    - 임의로 고정화된 형태의 헤파린을 포함하는 고체상에서 크로마토그래피(헤파린 친화성 크로마토그래피)하는 단계;

    - 임의로 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)하는 단계;

    - 15℃ 이상에서 1 시간 이상의 인큐베이션 시간으로 0.1% (w/w) 이상의 Triton/0.03%(w/w) 이상의 TnBP를 이용하여 바이러스를 불활성화시키는 단계;

    - 용액의 이온 강도를 증가시키기 위해 염의 첨가 단계; 및

    - 상기 형성된 입자를 여과로 제거하는 단계.
14. 제 13 항에 있어서,

    추가의 바이러스 불활성화 단계가 바람직하게는 0.5 M 이상의 소듐 시트레이트, 아미노산, 당 또는 이의 혼합물의 존재하에 저온살균 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 A1AT.
15. 제 13 항에 있어서,

    상기 용액의 이온 강도가 바람직하게는 한외여과/정용여과에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 A1AT.
16. 제 13 항에 있어서,

    바이러스 및/또는 프리온 고갈(depletion) 또는 불활성화 단계가 바람직하게는 15-20 nm의 공극 크기를 갖는 필터를 이용한 나노여과에 의한 바이러스 입자의 분리를 포함하는 것을 특징으로 하는 A1AT.
17. 제 13 항에 있어서,

    상기 수득된 A1AT 분획이 액체로서 저장되거나, 동결되거나 또는 동결건조된 제제인 것을 특징으로 하는 A1AT.
18. 항염증제, 바람직하게는 스테로이드인 NSAID와 조합하여 또는 유일한 활성 성분으로서 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 A1AT를 포함하는 약물.
19. A1AT 결핍, 폐 섬유증 및 폐기종과 같은 폐의 퇴화 현상의 치료용 약물의 제조를 위한 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 A1AT의 용도.

Images