DE4407837C1

DE4407837C1 - Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem alpha¶1¶-Antitrypsin mittels Anionenaustauscher-Chromatographie

Info

Publication number: DE4407837C1
Application number: DE4407837A
Authority: DE
Inventors: Alex Strancar; Djuro Dr Josic; Israel Nur
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1994-03-09
Publication date: 1995-08-17
Anticipated expiration: 2014-03-10
Also published as: AU1811195A; WO1995024428A1; IL112752A0; ZA951904B

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem α₁-Anti trypsin mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus diesen Faktor enthaltenden Quellen.

α₁-Antitrypsin gehört zur Superfamilie der Serpine und ist ein Serumprotein (Antienzym) α₁-Antitrypsin besitzt Anti-elastase-Aktivität. Bei Verlust der Inhibitor-Akti vität infolge eines genetischen Defekts kommt es zum Abbau des Struktur-Proteins Elastin und infolgedessen zu Lungenemphysemen.

Die EP 0 282 363 A2 betrifft ein Verfahren zur Herstel lung eines α₁-Antitrypsin-Konzentrats aus einer Fraktion menschlichen Plasmas. Die Isolierung erfolgt dabei mit Hilfe der Chromatographie und liefert eine Fraktion α₁- Antitrypsin mit einer Ausbeute von mindestens 80%. Die Chromatographie erfolgt an DEAE-Sepharose CL.

M.H. Coan et al. beschreibt in Vox Sang. 48 : 333 bis 342 (1985) die Reinigung von α₁-Proteinase Inhibitor ausge hend von einer Cohn-Fraktion IV-1 durch eine Polyethylen glykol-Präzipitation mit nachfolgender Chromatographie an DEAE-Sepharose. Die Ausbeuten an α₁-Antitrypsin betragen ungefähr 60% (bestimmt durch spezifische Aktivität ge genüber 100% reinem Protein).

Die Cohn-Fraktion wird erhalten gemäß Cohn E.J. et al., Preparation and properties of serum and plasmaproteins IV. A System for the preparation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids, Journal of American Chemical Society 68 : 459 bis 457, 1946.

Die DE 42 06 694 beschreibt die Eignung eines Materials, welches aus der EP 0 337 144 bekannt ist, zur Isolierung von Faktor VIII aus entsprechenden Fraktionen.

Die WO 90/14886 beschreibt Materialien zur Chromatogra phie mit Polyalkylaminketten, die an der Oberfläche eines chromatographischen Trägers verankert sind. Dies bedeu tet, daß unbedingt die den endständigen funktionellen Rest tragende Gruppe über Stickstoffatome mit dazwischen liegenden Alkylengruppen an diese Oberfläche gebunden sind. Diese Polyamingruppierungen sind über Kupplungs reagenzien mit der das Chromatographiematerial bildenden Matrix verbunden. Dazu werden Substanzen wie Cyanogen bromid, Epichlorhydrin, Carbonyldiimidazol oder 1,4-Bu tandioldigylcidylether verwendet. Diese "linking group" wird dadurch charakterisiert, daß sie bis zu 10 Kohlen stoffatome enthalten soll, die durch Sauerstoffatome unterbrochen sein kann und weitere Substituenten wie Hy droxyl oder Oxo-Gruppen enthalten kann.

Die EP 0 343 275 A1 beschreibt die Reinigung von Faktor VIII mit Hilfe der Anionenaustauscher-Chromatographie, wie beispielsweise TSK DEAE-Fratogel.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Isolierung von biologisch aktivem α₁-Antitrypsin aus diesen Faktor enthaltenden Quellen verbessern läßt und eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährleistet.

Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unter ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen wie sie in der EP-A-0 337 144 offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxyl gruppen, auf die über die alpha-C-Atome der Hydroxylgrup pen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Träger teilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekun däre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Dabei sind bevorzugt hydrophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele, Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulosede rivate oder Polymere auf Dextran-Basis. Es können aber selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylverbindungen, Acrylamid, (Meth)-Acrylsäureestern oder (Meth)-Acrylni tril in hydroxylierter Form eingesetzt werden.

Das polymere Material, das über die α-C-Atome der Hydro xylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder III.

Diese Monomeren stellen (Meth)Acrylsäure (Y = -COOH), (Meth)-Acrylsäurederivate

Allylamine (Y = -CH₂NH₂, -CH₂NR²R³), (Meth)-Acrylnitrile (Y = -CN), Acroleine (Y = -CHO), Vinylcarboxylate (Y = -OCOCHR⁵R⁶) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.

Alle diese Monomere stellen in wäßriger Lösung radika lisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel binden den Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.

Werden als Monomere Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR⁷R⁸ = CR¹-OCOCHR⁵R⁶ der Formel II ein gesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt an schließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen über führt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K₂CO₃-Lösung bei Raumtemperatur, beschrie ben z. B. von Y. Tezuka et al., in Macromol. Chem. 186, 685-694 (1985), durchgeführt werden.

In den Formeln I, II und III bedeutet R¹ vorzugsweise H, d. h. die Acrylsäurederivate sind bevorzugt.

Y in Formel II bedeutet vorzugsweise

-OCOCHR⁵R⁶ oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO. Dementsprechend bedeutet Y in Formel I in erster Linie bevorzugt

-OH (da vorzugsweise die -OCOCHR⁵R⁶-Gruppe in eine Hydro xylphase umgewandelt wird) oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO.

R⁵ und R⁶ bedeuten unabhängig voneinander H oder eine Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen. Vorzugsweise ist min destens einer der Reste R⁵ und R⁶ H. Folgende Reste sind besonders bevorzugt: Acetyloxy-, Propionyloxy-, Butyry loxy-, Valeryloxy- und Hexanoyloxy-Rest.

X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -OR⁴, -OH oder -NR²R³, vorzugsweise -NR²R³.

Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR²R³ be deutet und einer der Reste R² und R³ H ist.

Die Reste R² und/oder R³ bedeuten bevorzugt eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach, insbesondere bevorzugt einfach, substituiert sein kann durch einen Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammoni um-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetamino- Rest.

Die Reste R² und/oder R³ bedeuten bevorzugt Alkyl, Alkoxy alkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoal kyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäu realkyl mit bis zu 10 C-Atomen, bevorzugt bis zu 6 C- Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R² und/oder R³ bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxyme thyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-, 4- oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Iso propyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2- Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-Oxa- 4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxahexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.

Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor liegen. Demnach bedeuten R² und/oder R³ bevorzugt Cyano methyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl, Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carbox ylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-me thylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-me thylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3- methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3- methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.

Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substi tuiert durch eine Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe. Die Akylgruppen können dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C- Atomen, besitzen und bedeuten demnach vorzugsweise Dime thylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammoniu methyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethy lammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl oder Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substituierten Alkyl gruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenylgruppe.

Bevorzugt für R² und/oder R³ ist auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO₂-(CH₂)-S-(CH₂)_nOH mit n = 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4.

Vorzugsweise hat R² und/oder R³ auch die Bedeutung einer Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammo niumalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sul fonsäurealkyl. Die bevorzugten Bedeutungen dieser Sub stituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevor zugten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p- Stellung.

p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R² und/oder R³.

Bevorzugt für R² und/oder R³ ist ferner eine Alkylphenyl oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.

Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen bei spielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4- Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)-phenyl, 4-(N,N-Dial kylaminoethyl)-phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethylphe nyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl, 4-Sul fonsäurephenyl, Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenylpropyl oder 4-Cyanophenylethyl.

Des weiteren sind Einheiten der Formel I bzw. Monomere der Formel II bevorzugt, in denen R² und/oder R³ einen cyclischen oder bicyclischen Rest, der aromatisch oder gesättigt sein kann, mit 5 bis 10 C-Atomen, worin ein- oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.

R² und R³ bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyridin rest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einen Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochino linrest.

R² und/oder R³ können beispielsweise auch einen Thiazol-, Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzothia zol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxa zol-Rest bedeuten.

Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen, hete rocyclischen Reste.

Die Reste R² und R³ müssen, um zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden, daß entwe der beide Reste eine saure oder basische Gruppe enthalten oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann be reitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit geeignete Reste für R² und R³ zusam menzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des gewünsch ten Ionenaustauschers.

Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R² und R³ ein neutraler Rest.

R⁴ bedeutet bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-Ato men, vorzugsweise mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R⁴ bedeutet demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Methox ymethyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4- Oxapentyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-me thylbutyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl oder 2-Methyl-3-oxahexyl.

Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor liegen. Demnach bedeutet R⁴ bevorzugt Cyanomethyl, Cyano ethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxymethyl, Carboxyl ethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäure ethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäure pentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.

Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenylgrup pe.

Vorzugsweise hat R⁴ auch die Bedeutung einer Phenylgrup pe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cya no, Cyanoalkyl, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Carboxy, Car boxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl. Die bevor zugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und sub stituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenyl gruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.

R⁷ und R⁸ in den Monomeren der Formel II bedeuten vorzugs weise H, und damit haben auch R′ und R′′ in Formel I vor zugsweise die Bedeutung Wasserstoff.

Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in For mel I Y = -OH ist und einer der Reste R′ und R′′ ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres muß dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und das bei der Polyme risation entstandene Produkt anschließend in eine Hydro xylphase überführt werden.

R⁷ und R¹ in Formel III bedeuten vorzugsweise H. n in Formel I stellt die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von hoch reinem, virusinaktiviertem α₁-Antitrypsin mittels Anio nenaustauscher-Chromatographie geht vorzugsweise davon aus, daß die sogenannte Cohn IV-l-Fraktion aus einem Auftragungspuffer auf eine Chromatographie-Säule gegeben wird, welche mit einem Anionenaustauscher, wie oben be schrieben, beschickt ist. Der Auftragungspuffer ist eine wäßrige Lösung mit relativ geringer Ionenstärke. Nach dem Auftragen der Cohn-Fraktion aus dem wäßrigen System ge ringer Ionenstärke wird das Chromatographiematerial gege benenfalls mit einer Lösung entsprechend einer Ionenstär ke von 5 bis 35 mM Natriumchlorid und Natriumacetat bei pH 4 bis 5,5, vorzugsweise bei pH 4,5. Damit können mit dem α₁-Antitrypsin vergesellschaftete Proteine entfernt werden.

Nach gegebenenfalls einem oder mehreren Waschschritten folgt dann die Elution des noch an dem chromatographi schen Material adsorbierten α₁-Antitrypsins. Die wäßrige Lösung, die zur Elution des α₁-Antitrypsins eingesetzt werden kann (Elutionspuffer), zeichnet sich durch eine relativ hohe Ionenstärke aus, vorzugsweise entsprechend einer 50 bis 300 mM Natriumchloridkonzentration in einem geeigneten Puffer wie 25 bis 37 mM Tris/HCl in alkali schem Milieu (pH 7,4 bis 9,2). An die Elution kann sich dann gegebenenfalls eine weitere Prozeßierung anschließen wie Entsalzungsschritte und andere übliche Konzentrie rungsschritte bis hin zur Gefriertrocknung des Eluats.

Es kann vorteilhaft sein, an die erste Chromatographie eine zweite Chromatographie an Umkehrphasen-Materialien durchzuführen. Als besonders geeignet, hat sich hierbei Octyl-Sepharose herausgestellt.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemä ßen Verfahrens können die chromatographischen Schritte mittels der Membran-Chromatographie durchgeführt werden. Dabei kommen sowohl Membranen aus Cellulose oder synthe tischen Fasern, als auch kompakte Disks z. B. aus Polygly cidylmethacrylat in Frage. Vorzugsweise weisen die Mem bran-Systeme covalent gebundene Anionenaustauschergruppen der oben genannten Art auf zur Durchführung des erfin dungsgemäßen Verfahrens. Falls ein zweiter chromatogra phischer Trennungsschritt mittels Membran-Chromatographie eingesetzt wird, werden solche Membran-Systeme einge setzt, die eine hydrophobe Wechselwirkung mit dem zu trennenden α₁-Antitrypsin eingehen können. Vorzugsweise sind diese hydrophoben Gruppen kovalent an das die Mem bran bildende Material gebunden.

Zur Vermeidung der Übertragung infektiöser viraler Er krankungen empfiehlt sich ein Virusinaktivierungs- oder Virusentfernungsschritt. Ein allgemein anerkanntes Ver fahren ist hierbei die Virusinaktivierung mit Di- oder Trialkylphosphaten und nicht ionischen Detergenzien wie sie von Horowitz et al. in EP 0 131 740 beschrieben wird.

Woods, K. und Orme, Th. beschreiben in der EP-A-0 239 859, daß es von Vorteil ist-, nach der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen Tren nung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinöl und/oder Baumwollsamenöl.

Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals möglich, in hohen Ausbeuten hochreines α₁-Antitrypsin herzustellen, das eine bisher nicht erreichte spezifische Aktivität aufweist.

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von α₁-Antitrypsin soll im folgenden die Cohn IV-1-Fraktion dienen. Diese wird aufgenommen in 35 mM Tris/HCl, bei einem pH von 8,2 (Puffer 1). Die Fraktion wird vorzugsweise bei etwas erhöhter Temperatur mit dem Puffer 1 behandelt.

Daran schließt sich die Virusinaktivierung an, indem etwa 10 g/l Tween 80 und 3 g/l TNBP 6 Stunden bei 30°C mit der Probe im Auftragungspuffer (Puffer 1) gerührt werden
An diesen Schritt können sich dann gegebenenfalls Schrit te zur Vorreinigung und Entfernung der Detergenzien an schließen, wie in der EP 0 239 859 beschrieben.

Gewünschtenfalls kann auch eine Inaktivierung von Viren, die nicht mit Lipidhüllen versehen sind, erfolgen. Dies erfolgt vorzugsweise gemäß einem Verfahren wie es in der P 43 18 435.9 vorgeschlagen wird. Dabei wird die entspre chende zu behandelnde Fraktion mit einer wirksamen Menge von Di- oder Trialkylphosphaten und gegebenenfalls Benet zungsmitteln gleichzeitig oder aufeinanderfolgend bei einer erhöhten Temperatur im Bereich von 55°C bis 77°C für eine Zeitdauer von 5 bis 30 Stunden behandelt.

Die Menge an Detergenz kann vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 15 Gew.-% eingesetzt werden.

Die erste Chromatographie erfolgt dann an einem Anionen austausch-Chromatographiematerial, welches vorzugsweise das kommerziell erhältliche Fraktogel® EMD-DEAE (M) ist.

Die Chromatographie-Säule mit dem oben genannten Material wird mit dem Auftragungspuffer (Puffer 1) äquilibriert. Dann wird die Cohn IV-1-Fraktion auf die Säule gegeben und vorzugsweise mit einer 10 mM Natriumchloridlösung, die mit 20 mM Natriumacetat bei pH 4,6 gepuffert ist, gewaschen. Daran schließt sich dann die Elution der α₁- Antitrypsin enthaltenden Fraktion, beispielsweise mit 150 mM Natriumchloridlösung, die mit 30 mM Tris/HCl bei pH 8,2 gepuffert ist, an. Die erhaltene Fraktion wird gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt an Octyl- Sepharose unterworfen. Eine Entsalzung kann ebenfalls durchgeführt werden beispielsweise durch Diafiltration oder andere an sich bekannte Entsalzungsmaßnahmen. Danach kann die mit α₁-Antitrypsin hoch angereicherte Fraktion beispielsweise durch Lyophilisation getrocknet werden.

Die Chromatographie-Säule kann mit einer 0,5 M Natrium chloridlösung mit 30 mM Tris/HCl bei pH 8,2 gepuffert, regeneriert werden.

Die Ausbeute an aktivem α₁-Antitrypsin beträgt 70 bis 80% (gemessen durch elektrophoretische Analyse).

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti viertem α₁-Antitrypsin mittels Anionenaustauscher- Chromatographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauscher material ein Trennmaterial verwendet wird auf Basis von hydroxylgruppenhaltigen Trägern, deren Oberflä chen mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, die Polymeren gleiche oder verschiedene wie derkehrende Einheiten der Formel I enthalten, worin
R¹ H oder CH³ R′ und R′′ jeweils H oder CH₃, und falls Y = -OH kann einer der Reste R′ und R′′ auch -OH sein,
X -OH, -NR²R³ oder -OR⁴,
R² und R³ jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphen ylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl-, Sulfonsäure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5 bis 10 C-Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH₂- Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO₂-(CH₂)_n S(CH₂)_nOH mit n = 2-6 bedeuten und einer der Reste
R² und R³ auch H bedeuten kann,
wobei R² und R³ so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind,
n 2 bis 100,
und R⁴ eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Al kylphenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub stituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Carbo xyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 mit X = -NR²R³ ist,
worin
R² und R³ jeweils Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Car boxyalkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C- Atomen in der Alkylgruppe,
unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Al kyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl, Cyano-, Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trial kylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfon säure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetamino- Gruppe(n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C- Atomen in der Alkylgruppe,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5 bis 10 C-Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH₂- Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO-(CH₂)_n- S-(CH₂)_nOH mit n = 2-6 bedeuten und einer der Reste R² und R³ auch H bedeuten kann, wobei R² und R³ so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.

3. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti viertem α₁-Antitrypsin mittels Anionenaustauscher- Chromatographie,

- wobei die α₁-Antitrypsinhaltige Fraktion, ins besondere Cohn IV-1-Fraktion, aus einer wäßri gen Lösung (Auftragungspuffer) auf eine Chroma tographie-Säule, die mit einem Anionenaustau scher wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 beschrieben, beschickt ist, gegeben wird
- unter Bedingungen relativ geringer Ionenstärke,
- gefolgt von mindestens einem Waschschritt mit einer Lösung entsprechend 5 bis 35 mM Natrium chlorid und Natriumacetat in der Nähe des pK_s- Wertes der Essigsäure,
- gefolgt von einer Elution mit einer Lösung hö herer Ionenstärke entsprechend 50 bis 300 mM Natriumchlorid in 25 bis 37 mM Tris/HCl in al kalischem Milieu (pH 7,4 bis 9,2), gegebenen falls gefolgt von Entsalzungsschritten und üb licher Konzentrierung wie Lyophilisation.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei vor der chromato graphischen Reinigung eine Virusinaktivierungs und/ oder alkalische Vorbehandlung der Cohn IV-1-Fraktion erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die chroma tographischen Reinigungsschritte mittels Membran- Chromatographie durchgeführt werden, wobei im ersten Chromatographieschritt mit Anionenaustauschergruppen modifizierte Membranen und im zweiten Chromatogra phieschritt mit hydrophoben Gruppen modifizierte Membranen eingesetzt werden.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Membranen als Disks ausgebildet sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Membranen aus modifizierten Cellulose- und/oder synthetischen Fasern und/oder aus Kunstfasern aus Polyglycidylmethacrylat aufgebaut sind.