DE2719912A1

DE2719912A1 - Verfahren zur isolierung von 0 geschweifte klammer auf -4,6-dideoxy-4 eckige klammer auf eckige klammer auf 1 s-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl eckige klammer zu -amino eckige klammer zu -alpha-d-glucopyranosyl geschweifte klammer zu -(1- pfeil nach rechts 4)-0- alpha-d-glucopyranosyl-(1- pfeil nach rechts 4)-d-glucopyranose aus kulturbruehen

Info

Publication number: DE2719912A1
Application number: DE19772719912
Authority: DE
Inventors: Erich Dr Rauenbusch; Delf Dr Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1977-05-04
Filing date: 1977-05-04
Publication date: 1978-11-16
Also published as: DE2719912B2; JPS53136590A; JPS5718797B2; US4174439A; DE2719912C3

Description

Bayer Aktiengesellschaft

91

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

5090 Leverkusen. Bayerwerk PG/mo

3. MH 1977

Verfahren zur Isolierung von O- £ 4,6-Dideoxy-4 Ql 1 S- (1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl J -aminoj -JL- D-glucopyranosyl_y (1- -^ 4 )-O-<>£-D-glucopyranosyl- (1--> 4) -D-glucopyranose

aus Kulturbrühen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, vorteilhaftes Verfahren zur Isolierung von 0-{_ 4,6-Dideoxy-4-[Ti S-(1,4,6,/6)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl J -amino 1 -^C- D-glucopyranosylj (1- -£-4) -0-oC -D-glucopyranosyl- (1--> 4) -D-glucopyranose aus Kulturbrühen, wie sie durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae, insbesondere von Stämmen der Gattung Actinoplanes, anfallen.

Die DT-OS 2064092 lehrt, daß eine Reihe von Actinomyceten Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlehydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes, bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide.

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In reiner Form zeigen einige dieser Inhibitoren eine außerordentlich starke Saccharasehemmung. 2 · i L¹ 9

Die Titelverbindung der Formel I

OH OH CH₃ CH₂OH CH,OH HO-/ >-N-/ >-0-( >-0-( >-0H

ist ein besonders wirksamer Saccharaseinhibitor. (DT-OS 23 47 782) .

Die Isolierung dieses Inhibitors in reiner Form aus den Kulturbrühen der Fermentation war bisher nur in sehr aufwendigen Anreicherungs- und Reinigungsverfahren möglich, da im Verlauf der Fermentation chemisch und physikalisch sehr ähnliche Komponenten (Homologe) mitgebildet werden, die jedoch weniger stark saccharaseinhibitorisch, dafür aber stärker amylaseinhibitorisch wirksam sind.

So gelangt man zu dem Aminozuckerderivat der Formel I gemäß der DT-OS 2347782 über folgende Stufen, wobei teilweise die Bearbeitung des ganzen Fermentationsvolumens über mehrere Schritte notwendig wird:

1. Abtrennung des Mycels,

2. Entfärbung der Kulturlösung,

3. Adsorption des Inhibitorgemisches an Aktivkohle,

4. Desorption mit geeigneten organischen Lösungsmitteln von der Kohle

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■J P '⁷ 1 O η -ι ->

5. Adsorption des Kohledesorbats an stark sauren Kationenaustauschern zur Abtrennung inerter Saccharide,

6. Desorption des Kationenaustauschers mit verdünntem Ammoniak,

7. Einengen des Desorbats,

8. Lyophilisation oder Fällung des Konzentrats,

9. Feinreinigung dieses 30-50 %igen Rohprodukts über Molekularsiebchromatographie (z.B. über Biogel),

10. Vereinigung der aktiven Fraktion, Einengen und Fällen oder Lyophilisieren.

Diese aufwendigen Reinigungsverfahren bedingen, daß die Aktivitätsausbeute an der Verbindung der Formel I nur etwa 20 % beträgt. Da zudem die Kapazität der Molekularsiebchromatographie sehr begrenzt ist (0,5 g Rohinhibitor pro 5 cm χ 95 cm Säure), sind sehr viele Säulentrennungen notwendig, um ausreichende Mengen der Verbindung zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung von 0- ■£4, 6-Dideoxy-4 [_Li S-(1,4,6,/5)-4,5, e-trihydroxy-B-hydroxymethyl^-cyclohexen-i-yll] -amino] -tfC-D-glucopyranosyl^ -(1-> 4)-Ο-β^-D-glucopyranosyl-(1->·4)-D-glucopyranose aus Kulturbrühen, die durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae, insbesondere von Stämmen der Gattung Actinoplanes, anfallen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Kulturbrühe, vorzugsweise ohne vorherige Abtrennung des Mycels,

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a) mit einem Gemisch aus einem stark sauren Kationen- und einem Anionenaustauscher in der sauren bzw. basischen Form versetzt,

b) das Harz vom Kulturfiltrat und gegebenenfalls vom Mycel abtrennt und wäscht,

c) das Harz zur Elution des Aminozuckerderivats

mit verdünnten kationenhaltigen Lösungen behandelt,

d) das Eluat über eine Kombination aus einem hochvernetzten, das Aminozuckerderivat schwach bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H ^ -Form mit einem Anionenaustauscher in der basischen Form leitet,

e) das Eluat auf einen das Aminozuckerderivat gut bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H vt)-Form leitet,

f) den derart beladenen Kationenaustauscher mit Wasser wäscht und anschließend mit 0,01 - 0,05 N Mineralsäuren unter fraktionierender Elution behandelt,

g) die wirkstoffhaltigen Fraktionen auf einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 7 bringt, konzentriert, filtriert und trocknet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden in der Reihenfolge der oben genannten Einzelschritte erläutert.

Die einsetzbaren Fermentationsbrühen sind z.B. aus der DT-OS 23 47 782 bekannt. Sie enthalten neben 20 - 30 % Mycel und anderen Bestandteilen das Aminozuckerderivat der Formel I, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 000 - 100 000 SIE/1 Lösung (SIE = Saccharase-Inhibitor-

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Einheit (en). 15 πι Fermentationsbrühe ergeben nach Abzug des Mycels 11-12 m Lösung mit einem Gehalt von 600 - 1 000 MSIE an Wirkstoff.

Im Adsorptionsschritt (a) wird die Kulturbrühe, vorzugsweise ohne vorherige Abtrennung des Mycels, mit einem stark sauren Kationenaustauscher in der sauren Form und gleichzeitig mit einem Anionenaustauscher in der Basenform behandelt.Besonders bewährt für diesen Adsorptionsschritt haben sich Kationenaustauscher auf Polystyrolbasis, die zu 2-6 %, vorzugsweise 3-4 % vernetzt sind. Als Beispiele für besonders geeignete Kationenaustauscher seien genannt: Lewatit^-^S 1040 W,

Lewatit^SC 104, LewatitC^J TSW 40. Als Anionenaustauscher eignen sich im besonderen Maße schwach basische Austauscher auf Polystyrolbasis, wie z.B. QyMP 62.

Es zeigte sich, daß die Adsorption des Aminozuckerderivates der Formel I an einen Kationenaustauscher in der Na^- und NH. ^-Form in Analogie zu der glatten Adsorption strukturverwandter Aminoglykosidantibiotika wie Streptomycin nicht möglich ist. Auch bei alleinigem Einsatz eines Kationenaustauschers in der H U-Form ist nur eine geringe Adsorption erreichbar. Überraschenderweise ist jedoch eine 80-90 %ige Adsorption möglich, wenn man gleichzeitig Kationenaustauscher in der Säureform und Anionenaustauscher in der Basenform einsetzt.

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Die Abtrennung des Mischharzes vom Kulturfiltrat (Schritt b) und gegebenenfalls auch vom Mycel geschieht in üblicher Weise. Nach der Abtrennung kann der Ionenaustauscher, der den Wirkstoff der Formel I trägt, mit entionisiertem Wasser gewaschen und somit in technisch einfacher Weise von anhaftenden Verunreinigungen befreit werden.

Auch die Elution des Aminozuckerderivates der Formel I gemäß Verfahrensschritt (c) lässt sich technisch einfach realisieren. Die Elution kann mit den verschiedenartigsten kationenhaltigen Lösungen wie Säuren, Basen und Salzlösungen vorgenommen werden. Es empfiehlt sich, mit Elutionslösungen möglichst geringer Konzentration zu arbeiten, wobei die minimale Konzentration, die gerade noch zu einer vollständigen Elution des adsorbierten Aminozuckerderivates führt, in Vorversuchen unschwer ermittelt werden kann. Besonders schonend und selektiv läßt sich die Elution mit verdünnten salzhaltigen Lösungen, vorzugsweise Lösungen der Alkali-, Erdalkali- und/oder Amminoumsalze schwacher Säuren, beispielsweise verdünnten Natrium- oder Calciumacetatlösungen, die Basen oder Säuren wie beispielsweise Ammoniaklösung oder Essigsäure enthalten können, durchführen.

Das Eluat wird im Verfahrensschnitt (d) über eine Kombination aus einem hochvernetzten, das Aminozuckerderivat schwach bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H ^ -Form und anschließend mit einem Anionenaustauscher in der basischen Form, die zweckmäßigerweise in einer

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Säule in übereinanderliegenden Schichten angeordnet sind, geleitet. Die Austauscher können natürlich auch in getrennten, hintereinander geschalteten Säulen verwendet werden. Als Kationenaustauscher findet im Schritt (d) vorzugsweise ein Kunstharzaustauscher auf Polystyrolbasis Verwendung, der einen Vernetzungsgrad von 7-20 %, vorzugsweise 8-15 %, aufweist; als Beispiel sei Lewatit v> S 100 genannt. Weitere geeignete Kationenaustauscher lassen sich in einfachen Vorversuchen durch Prüfung ihrer Bindekapazität für den Wirkstoff ermitteln. Die Wahl des Anionenaustauschers ist im Prinzip beliebig; überraschenderweise erwiesen sich schwach basische Anionenaustauscher, wie etwa LewatitviyMP 62, ein makroporöser, monofunktioneller, schwach basischer Anionenaustauscher auf Polystyrolbasis, als besonders wirksam. Auch bei den Anionenaustauschern sollte Kunstharzaustauschern der Vorzug gegeben werden.

Im Verfahrensschritt (e) erfolgt die eigentliche Trennung des Aminozuckerderivates der Formel I von anderen Komponenten, insbesondere Homologen-Verbindungen. Dazu leitet man das nach der Entsalzung im Schritt (d) anfallende Eluat auf einen das Aminozuckerderivat gut bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H^- Form. Besonders bewährt für die chromatographische Trennung haben sich Kationenaustauscher auf Polystyrolbasis, die einen geringen Vernetzungsgrad von etwa 2 bis 6 % aufweisen wie beispielsweise Lewatit \£/TSW 40, Lewatit Q9sC 104, Lewatitv£)s 1040 W.

Der beladene Austauscher wird anschließend mit 0,01 0,1 N Mineralsäuren, vorzugsweise 0,025 N Salzsäure, fraktionierend eluiert (f) und das Eluat durch Zusatz

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7 I 9 ^{Ci ;} '-^;

von Basen oder mit einem Anionenaustauscher in der basischen Form auf einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 7 gebracht, filtriert und getrocknet.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber dem aus der Literatur bekannten Verfahren zur Isolierung des Aitiinozuckerderivates eine Vielzahl überraschender Vorteile auf, eignet sich insbesondere zur Darstellung der Verbindung im technischen Rahmen und ist in hohem Maße wirtschaftlich.

Es wurde schon erwähnt, daß überraschenderweise durch Kombination eines Kationenaustauschers in der Säureform und eines Anionenaustauschers in der Basenform im Adsorptionsschritt (a) eine 80-90 %ige Adsorption des Amxnozuckerderivates zu erreichen ist.

Des weiteren ist erwähnenswert, daß die Abtrennung des Mycels von der Fermentationslösung entfallen kann. Dieser Abtrennungsschritt bereitet je nach Mycelgehalt große technische Schwierigkeiten, da Separatoren bedingt durch den hohen Feststoffanteil sehr häufig rückgespült werden müssen, wobei Verluste unvermeidbar sind. Die Abtrennung des Mycels durch Dekanter ist unvollständig.

Die Verwendung der körnigen Austauscherharze als Adsorptionsmittel bringt gegenüber der aus der DT-OS 23 47 782 bekannten Verwendung von Aktivkohlepulver den Vorteil der sauberen und bequemeren Handhabbarkeit. Die angenehmer verarbeitbare, gekörnte Aktivkohle hat

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8 0 '·· -i 4 6 / C 0 7 3

eine zu schlechte Bindekapazität. Darüber hinaus muß die einmal desorbierte Kohle verworfen werden, wogegen die Ionenaustauscherharze regeneriert und oftmals wiederverwendet werden können. Die Elution des Wirkstoffes von der Aktivkohle erfordert die Verwendung brennbarer organischer Lösungsmittel (z.B. Aceton); dagegen wird das Gemisch der Ionenaustauscher mit wäßrigen Lösungen eluiert.

Eine Entfärbung des im Verfahrensschritt (c) erhaltenen Eluats etwa mit Aktivkohle oder Adsorptionsharzen, wie sie nach der Arbeitsweise der DT-OS 20 64 empfohlen wird, kann beim erfindungsgemäßen Verfahren entfallen.

Die im Verfahrensschritt (e) erfolgende Trennung der Homologen ist im besonderen Maße technisch vorteilhaft. So haben die erfindungsgemäß für die Homologentrennung eingesetzten Austauschersäulen eine etwa 40-fach höhere Trennkapazität als die bei der Chromatographie gemäß der Arbeitsweise der DT-OS 23 47 782 verwendeten Molekularsiebe·

So lassen sich auf einer Säule mit einem Bettinhalt von 2 1 Molekularsieb (Biogel ^ P 2) 500 mg Rohprodukt

trennen, während über eine Säule mit 2 1 stark saurem

(R)

Kationenaustauscher (z.B. Lewatit^SC 104) 20 g trennbar sind.

Insgesamt zeigt das erfindungsgemäße Verfahren gegen über der aus der DT-OS 23 4 7 782 bekannten Arbeitsweise

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eine Ausbeuteverbesserung von 20 % auf 40 - 50 % sowie eine technisch entscheidend vereinfachte Herstellung des Aminozuckerderivates, die sich durch geringeren Arbeitsaufwand, geringeren Aufwand an Materialien, keine Verwendung organischer Lösungsmittel, Möglichkeit der kontinuierlichen Arbeitsweise und der Regeneration und Wiederverwendbarkeit der Ionenaustauscher auszeichnet.

Figur 1 zeigt ein Fließchema zur technischen Isolierung der Titelverbindung aus Kulturbrühen. In einem Behälter (1) werden in die Fermentationsbrühe mit Mycel der stark saure Kationenaustauscher sowie der Anionenaustauscher eingetragen. Die Abtrennung des gemischten Ionenaustauschers von der Fermentationsbrühe mit Mycel geschieht über eine Siebschneckenzentrifuge (2). Der Ionenaustauscher mit dem adsorbierten Wirkstoff kann dabei in der Maschine mit entionisiertem Wasser nachgewaschen werden. Zur Elution wird der Ionenaustauscher in einen mit Düsensieben ausgestatteten Kessel (3) eingetragen und anschließend der Wirkstoff durch Zugabe einer 0,1 M-N Salzlösung eluiert. Die abfließende Lösung wird in einer Säule mit einem hochvernetzten, das Aminozuckerderivat schwach bindenden, stark sauren Kationenaustauscher (4) von kleinen und stärker basischen Kationen befreit und anschließend die stark saure Lösung in einer Säule mit einem Anionenaustauscher in der basischen Form (5) wieder auf pH-Werte über gebracht.

Die entsalzte Lösung wird jetzt auf eine Säule mit einem das Aminozuckerderivat qut bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H^ -Form (6) aufgetragen.

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//3 2 / ι j j ;

wobei der Wirkstoff in den oberen Teilen der Säule angereichert wird. Man wäscht mit wenig entionisiertem Wasser nach und beginnt die Trennung der verschiedenen Komponenten, vorzugsweise mit verdünnter Salzsäure. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, auf den Wirkstoff hin analysiert und die das Aminozuckerderivat der Formel I enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.

Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen werden in einem Behältnis (7) durch Zugabe eines Anionenaustauschers in der basischen Form auf einen pH-Wert von 6,0 bis 6,5 gebracht und die Lösung im Vakuum (8) konzentriert und in entsprechenden Vorrichtungen (9, 10) sterilfiltriert und gefrier- oder sprühgetrocknet.

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Adsorption '

Beispiel 1

300 ml Kulturbrühe mit einem Mycelgehalt an 25 % und einem Inhibitorgehalt von 50 SIE/ml in der Lösung wurden mit 50 g

(R) eines Kationenaustauschers (Lewatit S 1040 W) in der

ι ^ (κ)

H -Form und 30 g eines Anionaustauschers (Lewatit ^ M 6OO) in der OH-Form versetzt. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 50 Min. gerührt. Die Lösung mit dem Mycel wurde mit einer Siebdüse mit 0,1 mm Schlitzen abgesaugt. Zum Test wurde eine Probe der abgesaugten Brühe zentrifugiert und im Überstand auf den Saccharaseinhibitor geprüft. Die Lösung enthielt noch 2,5 SIE/ml, d.s. 5 % der Ausgangsaktivität.

Das Austauschgemisch mit dem adsorbierten Wirkstoff wurde zur Überprüfung des Adsorptionsvorganges in eine Säule gefüllt, mit 100 ml Wasser gewaschen und der InI ibitor mit 200 ml 0,1 M-Natriumchloridlösung eluiert. Es wurden 2O5 ml Eluat erhalten mit einer Aktivität von 44 SIE/ml, d.s. insgesamt 9020 SIE. Die Ausgangsaktivität in 300 ml Kulturbrühe oder nach Abzug des Mycels in 22 5 ml Kulturlösung betrug 1125O SIE. Die Ausbeute an eluierbarem Inhibitor betrug 80 %.

* Die Ionenaustauscher wurden in gequollenem Zustand abgesaugt und davon die Einwaagen in feuchtem Zustand vorgenommen .

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Beispiel 2 »c. ·; ~? -» c O 1 "■■

300 ml Kulturbrühe mit einem Mycelgehalt von 28 % und einem Inhibitorgehalt von 74 SIE/ml wurden bei ständiger Rührung mit 27 g Lewatit ® S 1040 W (H⁺-Form) und 4 g Lewatit MP (Basenform) versetzt. Nach 30 Min. wurde das Harz wie in Beispiel 1 beschrieben abgesaugt und mit 50 ml Wasser nachgewaschen. Die Brühe enthielt nach Entfernung des Mycels noch 5,3 SIE/ml. Bei einem Volumen von 24 5 ml Lösung waren das 1300 SIE oder 8,1 % der eingesetzten Aktivität von 16.ΟΟΟ SIE.

Beispiel 3

100 ml Kulturbrühe mit einem Mycelgehalt von 28 % und einem Inhibitorgehalt von 7 4 SIE/ml wurde bei ständiger Rührung mit 10 g Lewatit ® S 100 (H⁺-Form) und 11 g Lewatit ® M (OH-Form) versetzt. Nach 30 Min. wurde das Harz wie in Beispiel 1 beschrieben abgesaugt. Die Brühe enthielt nach Entfernung des Mycels noch 71 SIE/ml. Bei einem Volumen von 68 ml waren das 4800 SIE oder 90 % der eingesetzen Aktivität von 53 30 SIE. Der Inhibitor wurde damit nur in ganz geringem Maß an diese Ionenaustauscher adsorbiert.

Beispiel 4

200 ml Kulturbrühe mit einem Mycelgehalt von 22 % und einem Inhibitorgehalt von 61 SIE/ml wurde bei ständiger Rührung mit 18 g Lewatit ® SC 104 (H⁺-Form) und 9 g Lewatit ® MP versetzt. Nach 100 Min. wurde das Harz wie in Beispiel 1 beschrieben abgesaugt. Die Brühe enthielt nach Abtrennung des Mycels 7,5 SIE/ml. Bei einem Volumen von 150 ml waren das 1125 SIE oder 12 % der eingesetzten Aktivität von 9520 SIE.

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Beispiel 5

1600 1 Fermentationsbrühe mit einem Mycelgehalt von 22 % ergeben ein Lösungsvolumen von 1248 1. Der Inhibitorgehalt betrug 65 SIE/ml. Damit ist der Ausgangsgehalt 81,1 MSIE. Die Fermentationsbrühe wurde crerührt und bei Raumtemperatur j..,. ^^.v- v,^,^ ^m₁₁UW ...^₁. *.ww j. ^„«...k. SC 104 (H -Form) und 90 1 Lewatit^MP 62 (Basenform) versetzt. Man rührt noch 2 Stunden nach und entnimmt eine Probe zum Inhibitortest. In der Lösung wurde ein Gehalt von 5,0 SIE/ml festgestellt. Auf den gesamten Ansatz bezogen sind Jas 6,24 MSIE oder 7,7 % der Ausgangsaktivität. Das Harz mit dem adsorbierten Wirkstoff wird über eine Siebschneckenzentrifuge von der Fermentationsbrühe abgetrennt und auf derselben Zentrifuge gleichzeitig mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Fermentationsbrühe und das Waschwasser wurde verworfen. Das Ionenaustauschergemisch wurde aufgefangen und man erhielt 300 1 (215 kg). Zum Test wurden 10 g des Austauschergemisches in einer Säure mit 120 ml 1 M-Natriumchloridlösung eluiert. Es wurden 115 ml Eluat erhalten mit einem Gehalt von 26,9 SIE/ml. Das ergibt für die 10 g Probe 3094 SIE und für die Gesamtmenge 66,5 MSIE oder 82 % des Gehaltes in der Fermentationsbrühe.

Elution und Entsalzung

Die folgenden Versuche wurden mit einer Kombination von 2 bis 3 hintereinander geschalteten Säulen durchgeführt. Die zur Elution dienende Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 70 ml/h durchgepumpt. Das Eluat wurde fraktioniert aufgefangen und zunächst qualitativ mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie auf die Anwesenheit des Saccharaseinhibitors geprüft. Die entsalzten Inhibitor-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und quantitativ auf ihren Inhibitorgehalt geprüft. Als Maß für den Salzgehalt diente

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/// 9 ^Γϊ "j Π -"j ; '"'

die Leitfähigkeit. Fraktionen mit einer Leitfähigkeit unter 1,5 mS . cm bei Raumtemperatur gelten als entsalzt.

Beispiel 6

60 g des nach Beispiel 5 erhaltenen Austauschergemisches mit dem adsorbierten Inhibitor (309 SIE/g) wurden in eine Säule mit 2 cm Durchmesser und 30 cm Höhe gefüllt. Der Auslauf der Säule wurde mit einer 2. Säule mit 2 cm Durchmesser und 20 cm Höhe verbunden, die unten eine Schicht von 5 g Lewatit ^ mp 62 in der Basenform und darüber eine Schicht von 20 g Lewatit ^ S 100 in der Säureform enthielt. Die Fließrichtung beider Säulen geht von oben nach unten. Der Auslauf wurde fraktioniert aufgefangen und dabei die Leitfähigkeit der Lösung gemessen. Zur Elution wurde eine Lösung von 1,5 1 0,025 M-Calciumacetat, 0,025 M-Essigsäure auf die 1. Säule aufgetragen. Die Fraktionen 20-40 (358 ml) enthielten Esplanin in einer Konzentration von 31,5 SIE/ml, die Leitfähigkeit betrug 0,325 mS . cm pH 4,54. Die gesamte eluierte Inhibitormenge betrug 11277 SIE d.s.

61 % der Ausgangsmenge von 18 540 SIE.

Beispiel 7

Säule 1: 60 g des nach Beispiel 5 erhaltenen Austauschergemisches mit dem adsorbierten Inhibitor (309 SIE/g).

Säule 2: untere Schicht 5 g Lewatit ^ MP 62 (Basenform), obere Schicht 20 g Lewatit ^ S 1OO (Säureform), Elutionsmittel: 0,025 M-Calciumacetat, 0,025 M-Ammoniak, Verfahrensweise wie in Beispiel 6,

Fraktionen 1-36 wurden vereinigt (620 ml), Leitfähigkeit 0,31 mS . cm pH 4,28, Inhibitorgehalt 17 SIE/ml d.s. 10540 SIE oder 57 % des im Austauschergemisch enthaltenen Inhibitors.

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Beispiel 8

■* 27 IS;·!

Säule 1: 60 g des nach Beispiel 5 erhaltenen Austauschergemisches mit dem adsorbierten Inhibitor. Säule 2: untere Schicht 5 g Lewatit ® MP 62 (Basenform) ,

obere Schicht 20 g Lewatit ^ S 100 (Säureform) Elutionsmittel 0,05 M-Ammoniak,
Verfahrensweise nach Beispiel 6,

Fraktionen 1-36 wurden vereinigt (630 ml), Leitfähigkeit 0,29 mS . cm~ pH 5,23, Inhibitorgehalt 17 SIE/ml d.s. 10710 SIE oder 58 % des im Austauschergemisch enthaltenen Inhibitors.

Beispiel 9

Säule 1: 60 g des nach Beispiel 5 erhaltenen Austauschergemisches mit dem adsorbierten Inhibitor.

Säule 2: untere Schicht 4 g Lewatit ^ MP 62 (Basenform), obere Schicht 12 g Lewatit ^ S 1OO (Säureform), Elutionsmittel 0,025 M-Calciumacetat, O,O1 M-Ammoniak, Verfahrensweise nach Beispiel 6,

Fraktionen 1-36 wurden vereinigt (625 ml), Leitfähigkeit 0,23 mS . cm"¹ pH 4,57, Inhibitorgehalt 19 SIE, ml d.s. 11875 SIE oder 64 Ϊ des im Austauschergemisch enthaltenen Inhibitors.

Beispiel 10

Säule 1: 60 des nach Beispiel 5 erhaltenen Austauschergemisches mit dem adsorbierten Inhibitor. Säule 2: untere Schicht 3 q Iewatit ™ MP 62 (Basenform),

obere Schicht 9 g Lewatit ^ S 100 (Säureform), Elutionsmittel O,O35 M-Calciumacetat, O,O1 M-Ammoniak, Verfahrensweise nach BeisDiel 6,

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80984ß/007! °^r

Fraktionen 1-32 wurden vereinigt (557 ml), Leitfähigkeit 0,45 mS . cm~¹ pH 4,6, Inhibitorgehalt 26 SIE/ml d.s. 14482 SIE oder 78 % des im Austauschergemisch enthaltenen Inhibitors.

Zur Isolierung des Inhibitors wurde die Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 1,3 g Substanz mit einer spezifischen Aktivität von 11 SIE/mg.

Elution, Entsalzung mit nachfolgender Chromatographie

Die Beispiele 6-10 dienten zur Ermittlung der günstigen Elutions- und Entsalzungsart des Inhibitors. Zur weiteren Reinigung kann daran direkt eine weitere Säule zur Chromatographie des Inhibitors angeschlossen werden.

Beispiel 11

Es wurden 3 hintereinander geschaltete Säulen mit folgender Füllung verwendet.

1. Säule: 15 cm Durchmesser, 60 cm Höhe,

6,86 kg Austauschergemisch nach Beispiel 5 mit dem adsorbierten Inhibitor (2,12 MSIE)

2. Säule: 10 cm Durchmesser, 60 cm Höhe,

untere Schicht 0,66 kg Lewatit ™ MP 62 (Basenform), obere Schicht 2,0 kg Lewatit ^ S 100 (Säureform).

3. Säule: 10 cm Durchmesser, 100 cm Höhe, 4,0 kg Lewatit ^

TSW 40 (Säureform),
Elutionslösung: 80 1 0,35 M-Calciumacetat,

0,01 M-Ammoniak.

Fließrichtung bei allen Säulen von oben nach unten. Die Elutionslösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 l/h auf die Säule 1 gepumpt. Der Auslauf aus Säule 3 wurde verworfen. Die Leitfähigkeit und das pH wurden am Auslauf der

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2. Säule, nach der Entsalzung, gemessen. Steigt die Leitfähigkeit nach etwa 12-14 Stunden über 1,5 mS . cm , dann ist der ganze Inhibitor auf die Säule 3 aufgetragen. Man stoppt die Aufgabe der Elutionslösung, trennt die Säule von der vorigen und wäscht diese mit 5 1 entsalztem Wasser nach. Dann folgt die chromatographische Reinigung des Inhibitors in der Säule 3 durch Aufpumpen von 0,025 N-Salzsäure mit 5 l/h. Das Eluat wird fraktioniert aufgefangen. Durch eine genaue Leitfähigkeitsmessung oder durch ein Differential-Refraktometer kann die Elution des Inhibitors beobachtet werden. Die Fraktionen von je etwa 9 1 wurden Dünnschicht-chromatographisch auf die Anwesenheit des Inhibitors bzw. seiner Homologen untersucht und die geeigneten Fraktionen (14 - 17 ) vereinigt. Es wurden 36 1 mit einem Inhibitorgehalt von 46 SIE/ml d.s. 1,66 M SIE oder 78 % des Inhibtorgehaltes des Austauschergemisches erhalten.

/β)

Zur weiteren Aufarbeitung wurde die Lösung mit Lewatit ^ M 600 (Basenform) auf einen pH-Wert von 6,5 angehoben, dann abgesaugt, im Vakuum konzentriert auf 2,65 1 und gefriergetrocknet. Es wurden 22,2 g Inhibitor mit einer spezifischen Aktivität von 67 SIE/mg erhalten, das sind 1,49 MSIE oder 70 % des Inhibitorgehaltes des Austauschergemisches oder 58 % des Inhibitorgehaltes der Fermentationsbrühe.

Beispiel 12

1600 1 Fermentationsbrühe mit einem Mycelgehalt von 27 %, entsprechend einem Lösungsvolumen von 1168 1, hatte einen Saccharase-Inhibitorgehalt von 68 SIE/ml. Der Gesamtgehalt beträgt dann 79,4 MSIE. In die gerührte Fermentationsbrühe wurden in 1 Stunde eingetragen 2 50 1 Lewatit ^ SC 104

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(Säureform) und 120 1 Lewatit ^ MP 62 (Basenform). Es wurde noch 2 Stunden nachgerührt und anschließend eine Probe
entnommen. In der Lösung wurde ein Inhibitorgehalt von
7,4 SIE/ml gefunden. Im gesamten Ansatz wurden damit 8,6
MSIE nicht adsorbiert (11 %).

Das Ionenaustauschergemisch mit dem adsorbierten Wirkstoff wurde über eine Siebschneckenzentrifuge von der Fermentationsbrühe abgetrennt und gleichzeitig mit entionisiertem
Wasser gewaschen. Die Fermentationsbrühe wurde verworfen. Das Ionenaustauschergemisch (390 1) wurde aufgefunden und in einen 500-1-Kessel gefüllt. An der tiefsten Stelle des Kessels war zuvor ein Saugkopf mit Düsensieben angebracht worden, der später das Absaugen der Lösung gestattet. Die zwischen dem Harz befindliche Luft wurde durch von unten
zugegebenes entionisierte Wasser verdrängt. Die Absaugleitung des Kessels wurde über eine Pumpe und ein Rotameter mit einer Säule von 30 cm Durchmesser und 150 cm Höhe verbunden, die 76 1 Lewatit S 100 (Säureform) enthielt. Der ι Jalauf dieser Säure wurde mit einer 2. Säule (30 cm Durchmesser, 100 cm Höhe) verbunden, die mit 32 1 Lewatit ® MP 62 (Basenform) gefüllt war. Der Ablauf der 2. Säule geht auf die Trennsäule (20 cm Durchmesser, 150 cm Höhe), die 76 1 Lewatit ^ TSW 40 (Säureform) enthielt.

Die Elutionslösung, bestehend aus 200 1 0,1 M Natriumacetat, wurde mit derselben Geschwindigkeit (80 l/h) auf das im
Kessel befindliche Harz oben aufgetragen wie die Lösung über dem Saugkopf mit der Pumpe von unten abgezogen wurde. Die Lösung durchströmt nacheinander den Kessel und die Säulen solange, bis die Leitfähigkeit gemessen nach der 2. Säule (MP 62-Säule) 1,5 mS . cm übersteigt. Der Inhibitor befindet sich dann auf der Trennsäule. Diese wird von den

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anderen Säulen getrennt, für sich mit 20 1 entionisiertem Wasser nachgewaschen und der Inhibitor mit 1600 1 0,025 M-Salzsäure chromatographiert. Die Elutionsgeschwindigkeit wurde auf 40 l/h reduziert. Das Eluat wurde fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen wurden Dünnschichtchromatographisch auf den Wirkstoff untersucht und entsprechend vereinigt. Es wurde eine Hauptfraktion von 220 erhalten, die 236 SIE/ml enthielt. (51,9 MSIE; 65 % des Gehaltes der Fermentationslösung).

Die Hauptfraktion wurde in einem 500 1 Rührkessel mit Lewatit ^ M 600 (Basenform) versetzt, bis ein pH-Wert von 5,0 erreicht wurde. Die Lösung wurde über einen Saugkopf mit Düsensieben in eine Destillationsblase gesaugt, der Austauscher mit 40 1 entionisiertem Wasser nachgewaschen und im Vakuum auf 20 1 eingeengt. Das Konzentrat hatte eine Leitfähigkeit von 4,5 mS . cm und wurde durch Zugabe von Lewatit ® S 100 {Säureform) und Lewatit ® M 600 (Basenform) auf 1,2 mS . cm entsalzt und auf einen pH-Wert von 6,0 gebracht. Die Lösung wurde abgesaugt, durch ein Sterilfilter filtriert und gefriergetrocknet.

Ausbeute 631 g, spez. Aktivität 65 SIE/mg, Gesamtaktivität: 41 MSIE, 52 % des Gehaltes der Fermentationslösung.

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Claims

Patentansprüche 2 7 I 3 J I I ·... :. ' ; ■* * "■ "-· · -

1. Verfahren zur Isolierung von 0-|4,6-Dideoxy-4/^S-(1 , 4, 6/ 5) -4 , 5, e-trihydroxy-S-hydroxymethyl^-cyclohexen-1 -yiy-aminq/- -/^-D-glucopyranosyl J- - (1—■> 4) -0-J_-D-glucopyranosyl-(1—^ 4)-D-glucopyranose aus Kulturbrühen, die durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae, insbesondere von Stämmen der Gattung Actinoplanes anfallen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe, vorzugsweise ohne vorherige Abtrennung des Mycels,

a) mit einem Gemsich aus einem stark sauren Kationen- und einem Anionenaustauscher in der sauren bzw. basischen Form versetzt,

b) das Harz vom Kulturfiltrat und gegebenenfalls von Mycel abtrennt und wäscht,

c) das Harz zur Elution des Aminozuckerderivats mit verdünnten kationenhaltigen Lösungen behandelt,

d) das Eluat über eine Kombination aus ein<«m hochvernetzten, das Aminozuckerderivat schwach bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H ^-Form mit einem Anionenaustauscher in der basischen Form leitet,

e) das Eluat auf einen das Aminozuckerderivat gut bindenden, stark sauren Kationenaustauscher in der H ^-Form leitet,

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χ- 2713912

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als stark saurer, das Aminozuckerderivat bindender Kationenaustauscher ein Kunstharzaustauscher auf Basis Polystyrol, der zu 2 - 6 %, vorzugsweise 3-4, vernetzt ist, verwendet wird.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als hochvernetzter, das Aminozuckerderviat schwach bindender Kationenaustauscher ein Kunstharzaustauscher auf Basis Polystyrol, der zu 7 - 20 %, vorzugsweise 8 - 15 %, vernetzt ist, verwendet wird.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den beladenen Kationenaustauscher im Verfahrensschritt f) mit 0,01 - 0,1 N, vorzugsweise 0,025 N Salzsäure, eluiert.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man im Verfahrensschritt c) mit verdünnten Salzlösungen, vorzugsweise Lösungen der Alkali-, Erdalkali- und/oder Ammoniumsalze schwacher Säuren eluiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man verdünnte Natriumacetatlösung verwendet.

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