DE2549688A1

DE2549688A1 - Verfahren zum abtrennen von flavonoidaglykonen und -glykosiden

Info

Publication number: DE2549688A1
Application number: DE19752549688
Authority: DE
Inventors: Alois Dr Phil Hiermann; Theodor Prof Dr Phil Kartnig
Original assignee: Lentia GmbH
Current assignee: Lentia GmbH
Priority date: 1975-11-05
Filing date: 1975-11-05
Publication date: 1977-05-12

Description

Verfahren zum Abtrennen von Flavonoidaglykonen
und -glykosiden.
Die Abtrennung von Flavonoidaglykonen und'-glykosiden aus Drogenextrakten bereitet in der Regel auf Grund der Begleitstoffe gewisse Schwierigkeiten. Diese sind dann besonders gravierend, wenn eine Isolierung und gleichzeitige Auftrennung der Flavonoide mittels omplexbildung und Adsorptionschromatographie dieses tomplexes erfolgen soll. (siehe J.E.Watkin, Chemistry and Industry, April 2, 1960, 378) da manche Begleitstoffe, insbesondere die Gerbstoffe, sowohl die tomplexbildung als auch die Elution des tom.plexes stören.
Es ist zwar möglich, aus flavonoidhältigen Extrakten in organischen Lösungsmitteln durch Zusatz von Äthylacetat einen Teil dieser Begleitstoffe auszufällen, doch ist der Reinigungseffext dieser Fällung, vor allem bei hohem Gehalt an Begleitstoffen, oft nicht ausreichend.
Es konnte nun gefunden werden, daß eine Abtrennung störender Begleitstoffe aus flavonoidhältigen Drogenauszgen oder lonzentraten mittels Gelfiltration sehr gut möglich ist, wobei zum Aufbringen und Eluieren bestimmte Lösungsmittel bzv. Lösungsmittelgemische verwendet werden.
Dadurch gelingt es, im Gegensatz zu früheren Bemühungen, zunächst einen Großteil der Begleitstoffe aus dem Drogenextrakt zu entfernen, bevor die Isolierung und Auftrennung der darin enthaltenen Flavonoide in Angriff genommen wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Abtrennen von Flavonoidaglykonen und -glykosiden aus Drogen und Pflanzenauszügen von störenden Begleitstoffen, insbesondere Gerbstoffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Lösung des zu trennenden Stoffgemisches in einem Alkohol mit 1 - 4 C-Atomen, einem niederen aliphatischen keton, einem Niederalkylester einer niederen aliphatischen Monocarb onsäure oder Gemischen dieser Alkohole mit den Estern und/ oder retonen mittels einer Gelfiltration in Fraktionen zerlegt und die flavonoidhAltige Fraktion abgetrennt wird, wobei zur Elution ebenfalls Alkohole mit 1 - 4 C-Atomen, niedere aliphatische retone, Niederalkylester einer niederen aliphatischen Monocarbonsäure oder Gemische davon dienen.
Als Biogel für die Gelfiltration sind in erster Linie gekörnte, vernetzte Zellulosen geeignet, die man in den Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen aus der gleichen Gruppe quellen gelassen hat, die der Aufbringung und Elution der Flavonoide dienen. Es sind aber auch quellbare Acryl gel e, Polystyrol gel e oder alkylierte bzw.
acylierte Dextrangele geeignet.
Dieser Abtrennung können Flavonoidaglykone oder -glykoside unabhängig von ihrer Struktur unterworfen verden. Es sind also sowohl Flavonoide mit mit 51-Hydroxy-Carbonylgruppierung als auch solche mit 3'-Hydroxy-Chromongruppierung geeignet.
Da die Elutionsgeschwindigkeit vom Molekulargewicht beeinflußt wird, das bei Aglykonen und Glykosiden sehr verschieden ist, empfiehlt es sich, vor der Durchführung des erfindungsgem'äßen VefEahrens das Elutionsvolumen der zu isolierenden Flavonoide zu ermitteln. Da ja bei bestiften Pflanzenauszügen die darin vorkommenden Flavonoide meist bekannt sind, ist diese Bestimmung leicht zu bewerkstelligen, indem man aus Testsubstanzen ein Gemisch derjenigen Flavonoide herstellt, die im zu isolierenden Gemisch etwa das niedrigste und das höchste Holekulargewicht besitzen. Das Gemisch dieser beiden Flavonoide wird dann der Säure aufgegeben und sowohl das Erscheinen des kleinsten als auch des größten Testflavonoids wird registriert, vas am besten durch spektralphotometrische kontrolle erfolgen kann.
Ist das Elutionsvezinögen somit bestimmt, kann dann mit der Trennungsoperation begonnen werden, vobei entweder das ermittelte Gesamtelutionsvolumen aufgefangen wird, oder aber iraktionen, z.B. zu je S0 ml genommen werden.
Die so erhaltenen Plavonoidgemische sind für eine veitere, z.B. säulenchromatographische Reinigung geeignet.
Beispiel 1: Ein Glasrohr von 40 cm Länge und 2,5 cm Durchmesser wird mit Biogel Sephadex LH 20R bepackt, welches vorher 6 Stunden in einem Gemisch von Äthylacetat»<ethanol (2/1) quellen gelassen wurde. Vor der Aufgabe des Drogenextraktes wird die Säule mit 200 ml Äthylacetat/Methanol (2/1) durchgewaschen.
10 g Fructus Crataegi, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Methanol (99 %) bei 600 C am Wasserbad erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird heiß filtriert und auf ein Volumen von etva 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von 20 ml Äthylacetat wird ein Teil der Gerbstoffe, sowie der anderen Begleitstoffe gefällt, worauf der Niederschlag abfiltriert wird. Das Filtrat (etwa 30 ml) wird der vorbereiteten Biogelsäule aufgegeben und mit 400 ml eines Methanol/Äthylacetatgemisches (1/2) eluiert, wobei nach einem Vorlauf von 130 ml 250 ml Eluat gesammelt werden Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels verbleibt ein Flavonoidgemisch als RUckstand, das nun der Feinreinigung oder Trennung unterzogen werden kann. Zur Prüfung des Elutionsvolumens wurde 3 mg Gemisch der Flavonoide Vitexin-4'-Rhamnosid, Vitexin und Hyperosid herangezogen.
Beispiel 2: Ein Glasrohr von 40 ci Länge und 2,5 cm Durchmesser wird mit Biogel Sephadex LH 20P bepackt, welches vorher 6 Stunden in einem Gemisch von Athanol/Ameisensäureäthylester (1/1) quellen gelassen wurde. Vor der Aufgabe des Drogenextraktes wird die Säule mit 200 ml Äthanol/Ain.sensäure-Ethylester (1/1) durchgevaschen. 10 g Folium Crataegi, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Äthanol (99 %) bei ° 60 C am Vasserbad erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird heiß filtriert und auf ein Volumen von etva 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von 20 ml Ameisensäureäthylester wird ein Teil der Gerbstof£e, sowie der anderen Begleitstoffe gefällt, worauf der Niede-rschlag abfiltriert vird.
Das Filtrat (etwa 30 ml) wird der vorbereiteten Biogelsäule aufgegeben und mit 400 ml eines Äthanol/Ameisensäureäthylestergemisches (1/1) eluiert, vobei nach einem Vorlauf von 140 ml 244 ml Eluat gesammelt werden. Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels verbleibt ein Flavonoidgemischals RUckstand, das nun der Feinreinigung oder Trennung unterzogen werden kann. Zur Prüfung des Elutionsvolumens wurde 3 mg Gemisch der Flavonoide Vitexin-4'-Rhamnosid, Vitexin und Hyperosid herangezogen.
Beispiel 3: Ein Glasrohr von 40 cm Länge und 2,5 cm Durchmesser wird mit Biogel Sephadex LR 20R bepackt, velches vorher 6 Stun -den in einem Gemisch von Isopropanol/Methyläthylketon (1/2) quellen gelassen vurde. Vor der Aufgabe des Drogenextraktes wird die Säule mit 1 1 Isopropanol/kethyl äthylketon (1/2) durchgeuaschen. 10 g Flos Prunus spinosa, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Methanol (99 %) bei 600 C am Wasserbad erschöpfend extrahiert. Der Extrakt wird heiß filtriert und auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von 20 ml Methyläthylketon wird ein Teil der Gerbstof£e, sowie der anderen Begleitstoffe gefällt, vorauf der Niederschlag abfiltriert vird.Das Filtrat (etwa 30 ml) wird der vorbereiteten Biogelsäule aufgegeben und mit 450 ml eines Isopropanol/Methyläthylketongemisches (1/2) duiert, wobei nach einem Vorlauf von; 220 ml 210 ml Eluat gesammelt werden. Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels verbleibt ein Flavonoidgemisch als Rückstand, das nun der Feinreinigung oder Trennung unterzogen werden kann.
Zur Prüfung des Elutionsvolumens wurde 3 mg Gemisch der Flavonoide taempPerol-7- + L-thamnoBuranosid, taexpferol-3-Rhamnosido-4'-arabinosid, DihydrokaempEerol und Taxifolin herangezogen.

Claims

Patentansprüche: Verfahren zum Abtrennen von Flavonoidaglykonen und -glykosiden aus Drogen und Pflanzenauszügen von störenden Begleitstoffen, insbesondere Gerbstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des zu trennenden Stoffgemisches in einem Alkohol mit 1-4 C-Atomen, einem niederen aliphatischen keton, einem Niederalkylester einer niederen aliphatischen MonocarbonsAure oder Gemischen dieser Alkohole mit den Estern und/oder retonen mittels einer Gelfiltration in Fraktionen zerlegt und die flavonoidhAltige Fraktion abgetrennt vird, wobei zur Elution ebenfalls Alkoholemit 1 - 4 C-Atomen, niedere aliphatische retone, Niederalkylester einer niederen aliphatischen Monocarbonsäure oder Gemischen derselben als Lösungsmittel dienen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelfiltration an gekörnten, vernetzten Zellulosen durchsefUhrt wird, vobei diese Gele mit Lösungsmitteln aus der gleichen Gruppe vorbehandelt werden, die zur Aufgabe und Elution dienen.
3. Vcrfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Elutionsvolumen der abzutrennenden Flavonoide durch Vortestung lit dem Gemisch von Test-Blavonoiin ermittelt wird, die den Flavonoiden mit dem niedrigsten und höchsten Elutionsvolumen im zu trennenden Gemisch entsprechen.