CH647533A5

CH647533A5 - Cundurango-glycosid-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung sowie diese verbindungen enthaltende tumorbekaempfende mittel.

Info

Publication number: CH647533A5
Application number: CH7326/81A
Authority: CH
Inventors: Hiroshi Mitsuhashi; Denichi Mizuno; Kouji Hayashi; Shigeru Abe; Muneaki Takase; Toshiharu Narita
Original assignee: Zenyaku Kogyo Kk
Priority date: 1980-03-05
Filing date: 1981-03-05
Publication date: 1985-01-31
Also published as: SE8202140L; IT1144136B; GB2093032A; US4452786A; EP0054570A4; AU6780081A; WO1981002577A1; EP0054570A1; GB2093032B; IT8167295A0; BE887793A; CA1169852A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Cun-durango-glycosid-Verbindungen, welche aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil. erhalten werden, und die nachfolgende allgemeine Formel (I) aufweisen, sowie auf Verfahren für die Herstellung der neuen Verbindungen und auch auf tumorbekämpfende Mittel, die als Wirkstoffkomponente mindestens eine dieser Verbindungen enthalten.

worin

I*

eine Gruppe der folgenden Formeln darstellt

CH3 1 xGH CH3 cCg

.XH3 "och3

CH

40

50

,0CH3

ch3

oder

,.-CH3 CH

55

CE

OH

Die Verbindungen der obigen allgemeinen Formel,

abhängig von der Bedeutung des Substituenten, werden als 60 Cundurango-glycosid Ao, Cundurango-glycosid Co, Cundurango-glycosid Bo, 20-0-Methyl-cundurango-glycosid Do, 20-Iso-0-methyl-cundurango-glycosid Do und Cundurango-glycosid Do bezeichnet.

65

Stand der Technik

Die Marsdenia cundurango Reichenbach fil., gehörend zu der Familie Asclepiadaceae, ist eine Staude mit einem gewissen Windencharakter, welche natürlich auf und zwischen Bergen im Nordwesten von Südamerika gedeiht. Ihre Rinde wird als aromatisches aber bitteres Magenmittel im Falle von Verdauungsstörungen und/oder Appetitlosigkeit (Anorexie) üblicherweise in Form des Fluidextraktes angewandt (Kommentar in der neunten Japanischen Pharmacopeia). Die Komponenten der Rinde von Marsdenia cundurango Reichenbach fil. enthalten Cundurangogenin-A, Cundurangógenin-C und viele andere Verbindungen des Pregnan-Typs und ihre Ester und Glycoside und die Extraktion, Abtrennung, deren Strukturen und ähnliche bekannte Tatsachen sind beispielsweise in den folgenden Dokumenten zusammengefasst, jedoch sind in vielen Punkten die detaillierten Fragen noch unklar: R. Tschesche et al., Tetrahedron, 21, S. 1777 (1965); 21, S. 1797 (1965); 23, S. 1461 (1967); und 24, S. 4359 (1968). M. Pailar et al., Monatshefte für Chemie, 106, S. 37 (1975). Hiroshi Mitsuhashi et al., Chem. Pharm. Bull., 16, S. 2522 (1968).

Als Resultat neuer Untersuchungen wurden nun neue Verbindungen aufgefunden, welche durch die oben erwähnte allgemeine Formel (I) dargestellt werden und welche eine tumorbekämpfende Wirksamkeit aufweisen.

Darstellung der Erfindung

Bei der Herstellung der neuen Verbindungen wird die Rinde von Marsdenia cundurango Reichenbach fil. bevorzugt. Diese Rinde ist handelsüblich erhältliche, aber vorzugsweise wird eine nach dem Sammeln gut getrocknete und fein verteilte Rinde verwendet.

Die neuen Verbindungen, nämlich Cundurango-glycosid

647 533

10

Bo, 20-0-Methyl-curdurango-glycosid Do, Cundurango-glycosid Ao und Cundurango-glycosid Co werden nach Extraktionsverfahren erfindungsgemäss hergestellt, wie sie in den Ansprüche 2 bis 5 definiert sind. 20-Iso-0-methyl-cunduran-goglycosid Do wird durch Alkoholyse mit Methanol erfindungsgemäss aus Cundurango-glycosid Bo erhalten und Cundurango-glycosid Bo wird erfindungsgemäss durch Hydrolyse in Cundurango-glycosid Do überführt.

Bezüglich der Herstellungsart der Extrakte ist die Reihenfolge der Anwendung von Lösungsmitteln nicht kritisch und ebenso bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann die Reihenfolge entsprechend der Einfachheit bzw. Bequemlichkeit der Durchführung geändert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens stellt sich wie folgt dar:

Erster Arbeitsschritt:

Marsdenia cundurango Reichenbach fil. wird fein verteilt und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, und der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Als organisches Lösungsmittel kann Methanol, Ethanol, Isopropanol oder irgendein anderer niederer Alkohol angewandt werden, aber Methanol ist bevorzugt.

An dieser Stelle kann vor der Extraktion Marsdenia cundurango Reichenbach fil. durch Behandlung mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie z.B. Pentan, Hexan, Hep-tan, Ligroin oder Petrol-Ether, entfettet werden. Bei dieser Vorbehandlung ist es vor allem erwünscht, dass sie durch Hexan bewirkt wird, und zwar in einer Menge vom 4-7fachen Volumen pro Gewicht bezüglich Marsdenia cundurango Rei-chenbach fil.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Extraktionsschrittes wird die Extraktion zuerst bewirkt, indem man die Mischung aus Ausgangsmaterial und Lösungsmittel bei Zimmertemperatur während einigen bis einigen Zehnstunden bei Zimmertemperatur stehenlässt. Sodann wird die Mischung filtriert, wodurch man ein Filtrat erhält. Der Rückstand wird der gleichen Extraktions-Filtration mehrmals unterworfen und alle Filtrate werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man einen Extrakt erhält.

Die Extraktion wird normalerweise bei Umgebungstemperaturen ausgeführt, aber sie kann auch bewirkt werden, während man heizt, um die Extraktionszeit zu verkürzen. Diese Extraktion unter Erwärmung wird vorzugsweise auf einem Wasserbad mit einer Wasserbadtemperatur von 35-55 °C während 4-6 Stunden unter Verwendung eines Rückflusskühlers ausgeführt. Sie kann nach dem Perkulier-Verfahren ausgeführt werden.

Die Menge an Lösungsmittel, die angewandt wird,

umfasst gewöhnlich das 2- bis 5fache (Volumen/Gewicht) bezüglich der angewandten Menge von Marsdenia cundurango Reichenbach fil. Der Extraktionsrückstand wird vorzugsweise der Extraktion, die unter gleichen Bedingungen abläuft wie oben erwähnt, drei oder mehrmals unterworfen, wobei man das Lösungsmittel in einer Menge von 0,4-0,8fachen (Volumen/Volumen) im Vergleich mit der zuerst angewandten Lösungsmittelmenge anwenden kann.

Die Abtrennung kann durch Papierfiltration, Zentrifuga-tion oder ähnliches erfolgen. Bessere Resultate können erhalten werden, indem man die Abtrennung durch Unterdruck-Filtration ausführt, indem man handelsüblich erhältliche Filtrationshilfsmittel, wie z.B. Radiolite (Showa Chemical Indu-stry Co. Ltd. in Japan), Celite (Wako Junyaku Industry Co. Ltd. in Japan), Fibra Cel (Johns Manville Co. Ltd. in USA) und ähnliches anwendet.

Die Druckverminderung kann in üblicher Weise ausgeführt werden, beispielsweise durch Anwendung einer Wasserstrahlpumpe, einer Vakuumpumpe oder ähnlichem.

Als Extraktionsbehälter wird vorzugsweise ein Behälter mit Glasauskleidung oder mit emaillierter innerer Oberfläche oder ein Behälter aus rostfreiem Stahl angewandt.

Zweiter Verfahrensschritt:

Zum Extrakt der im ersten Verfahrensschritt erhalten wurde, wird ein chlorierter Kohlenwasserstoff zugegeben, der nicht Tetrachlorkohlenstoff ist, wie z.B. Chloroform oder Dichlormethan und anschliessend kann heftig geschüttelt werden, um den unlöslichen Anteil zu entfernen. Der unlösliche Anteil wird der gleichen Behandlung mehrmals unterworfen. Alle verbleibenden Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und zwar direkt oder nach Unterdruckfiltration. Die Menge an Lösungsmittel, die angewandt wird, ist das 2-4fache (Volumen/Gewicht) bezüglich der Menge des im ersten Verfahrensschritt erhaltenen Extraktes. Die jeweiligen unlöslichen Anteile werden vorzugsweise den gleichen Behandlungen 4-oder 5mal unterworfen, jedoch mit einer Lösungsmittelmenge in einem Ausmass des 0,2-0,4fachen (Volumen/Volumen), verglichen mit dem zuerst angewandten Lösungsmittel. Die Unterdruckfiltration kann in der gleichen Weise ausgeführt werden, wie dies beim ersen Verfahrensschritt beschrieben ist.

Dritter Verfahrensschritt:

Der Extrakt, welcher im zweiten Verfahrensschritt erhalten wurde, wird in einem chlorierten Kohlenwasserstoff, welcher nicht Tetrachlorkohlenstoff ist, z.B. Chloroform oder Dichlormethan ist gelöst, und zwar in der minimal nötigen Menge, um den Extrakt vollständig zu lösen. Der so erhaltenen Lösung wird ein aliphatischer Kohlenwasserstoff, wie z.B. Pentan, n-Hexan oder Heptan, in einer Menge des 2-4fachen (Volumen/Volumen) des ersten Lösungsmittels zugesetzt, und man rührt anschliessend gründlich, und lässt dann während einer Zeitspanne von einigen Stunden bis einigen Zehnstunden stehen, um den unlöslichen Anteil zu sammeln. Alternativerweise können Tetrachlorkohlenstoff oder ein aromatischer Wasserstoff, wie z.B. Tolurol oder Benzol, dem Extrakt direkt in einer Menge wie oben beschrieben,

oder bis zum Dreifachen (Volumen/Gewicht) des letzteren zugesetzt werden, und man arbeitet wie oben beschrieben auf, um den unlöslichen Anteil zu sammeln.

Der unlösliche Anteil wird der gleichen Behandlung mehrmals unterworfen. Diese Behandlung wird vorzugsweise 2- oder 3mal ausgeführt, wobei man jeweils das Lösungsmittel in einer Menge des 0,4-0,6fachen (Volumen/Volumen), bezogen auf die Lösungsmittelmenge, die zuerst angewandt wurde, anwendet. Der so erhaltene unlösliche Anteil wird gut getrocknet, und zwar bei einer Temperatur von 50 °C oder weniger, indem man verminderten Druck anwendet, und sodann wird der Rückstand aufgebrochen, wodurch man einen braunen pulverartigen Extrakt erhält (dieser Extrakt wird im weiteren als Extrakt A bezeichnet).

Das Sammeln des unlöslichen Anteiles kann durch Dekantieren, Unterdruckfiltration oder Zentrifugation erfolgen.

Um die Gesamtkosten des erfindungsgemässen Verfahrens zu vermindern und um die Durchführung einfacher zu gestalten, kann fein verteilte Marsdenia cundurango Reichen-baeh fil. zuerst mit einem aliphatischen Keton, wie z.B. Aceton oder Methyl-Ethyl-Keton, einem niederen aliphatischen Ester, wie z.B. Essigsäure-Methyl-Ester, Essigsäure-Ethyl-Ester oder Essigsäure-Butyl-Ester, einem Ether, wie z.B. Di-ethyl-Ether, Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder mit heissem Wasser extrahiert werden, oder man kann mit heissem Wasser (110-130 °C während 30 Minuten) behandeln und direkt anschliessend mit Wasser oder einem wässrigen Alkohol extrahieren, und sodann kann der Extrakt den oben erwähnten drei Operationen unterworfen werden. In diesem Falle kann die Extraktion in der gleichen Weise ausgeführt werden, wie das oben für den ersten Erfahrensschritt erwähnt wurde.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

647 533

Der so erhaltene Extrakt A ist eine Mischung, welche 6 charakteristische Peaks im Diagramm zeigt, welches in Fig. 1 (diese folgt später und die Nummer bezeichnet diejenige Figur in der beiliegenden Zeichnung) dargestellt ist, wenn man ihn der normalphasenanalytischen Chromatographie (HPLC) unterwirft, und dieser Extrakt weist eine Antitumor-aktivität auf.

Vierter Verfahrensschritt:

Der Extrakt A aus dem dritten Verfahrensschritt wird in Chloroform gelöst, und zwar in der minimal nötigen Menge zu dessen vollständiger Lösung, und zu der so erhaltenen Lösung wird n-Hexan in einer derartigen Menge zugegeben, dass die Lösung nicht trübe wird. Die so erhaltene Probelösung wird der normalphasigen HPLC [Elutionsmittel: n-Hexan/Chloroform/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis = 6:3:1)] unterworfen. In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen bedeutet HPLC eine präparativ ausgeführte HPLC, wenn dies nicht anders angegeben ist. Während man die Elutions-Peaks mit einem Detektor beobachtet, werden zwei Fraktionen auf Basis der Peaks ausgewählt, die den Fr-2- und Fr-3-Fraktionen entsprechen, wie sie im Diagramm dargestellt sind (Fig. 2), welche vorher durch Vorversuche ermittelt wurden, und sie werden jeweils gesammelt (in den folgenden HPLC-Auftrennungen erfolgt die Sammlung der gewünschten Fraktionen in der gleichen Weise). Sodann wird jede Fraktion zur Trockene eingeengt, wodurch man Extrakte erhält.

Alternativerweise kann der Extrakt A, welcher gemäss dem dritten Verfahrensschritt erhalten wird, einem druckfreien Säulenverfahren unterworfen werden, indem man nacheinander mit Chloroform und einer Chloroform/Methanol-Mischung (volumentrisches Verhältnis = 97:3-95:5) elu-iert, um den weniger polaren Anteil zu entfernen, und sodann mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis = 93:7) eluiert, wodurch man zwei Fraktionen erhält, die den Fr-2- und Fr-3-Fraktionen, wie oben erwähnt wurden, entsprechen, und anschliessend zur Trockene einengt. Üblicherweise entspricht hier die erste Hälfte des Elua-tes der Fr-2-Fraktion und die letztere Hälfte der Fr-3-Frak-tion, aber das volumetrische Verhältnis dieser beiden Fraktionen wird im Verhältnis 60:40 angestrebt.

Als nächstes wird der trockene Extrakt, der der Fr-2-Frak-tion entspricht, wie sie oben erwähnt ist, der normalphasigen HPLC [Elutionsmittel: n-Hexan/Chloroform/Methanol Mischung (volumentrisches Verhältnis = 6:1:1)] unterworfen. Fraktionen, die aufgrund der Peaks ausgewählt wurden, bieten Fr-2-1- und Fr-2-2-Fraktionen (Fig. 3) entsprechen, werden jeweils gesammelt, und jede dieser Fraktionen wird zur Trockene eingeengt, wodurch man weisse pulverartige Extrakte (in der Folge als Extrakt B-l und Extrakt B-2 bezeichnet) erhält.

Der Extrakt, der der Fr-3-Fraktion entspricht, wird der inversphasigen HPLC [Elutionsmittel 65:75% (Volumen/ Volumen) wässerige Methanollösung] unterworfen. Es werden Fraktionen ausgewählt, aufgrund des Peaks der der Fr~ 3-1-Fraktion (Fig. 6) entspricht ausgewählt, und man sammelt sie und engt zur Trockene ein, wodurch man einen weissen pulverartigen Extrakt (im weiteren wird dieser als Extrakt B-3 bezeichnet) erhält.

Jeder der Extrakte B-l, B-2 und B-3 weist tumorbekämpfende Aktivität auf.

Fünfter Verfahrensschritt:

Dieser Verfahrensschritt dient dazu, die neuen erfindungsgemässen Verbindungen zur Verfügung zu stellen,

indem man die jeweiligen Extrakte aus dem vierten Verfahrensschritt (Extrakte B-l, B-2 und B-3) der Fraktionierung und Reinigung unterwirft.

Bei der Ausführung der folgenden Verfahrensschritte zur

Herstellung der Präparate 1-4 wird Silicagel als Säulenfüll-material und n-Hexan/Chloroform/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis ist = 7:2:1) als Elutionsmittel vorzugsweise für die normalphasige HPLC jeweils angewandt. Wenn eine inversphasige HPLC ausgeführt wird, ist der Füllstoff, der die stationäre Phase bildet, bevorzugt Silicagel mit daran gebundenen Cs- oder Cis-Einheiten während das Elutionsmittel vorzugsweise ein wässeriges Mischlösungsmittel ist, beispielsweise eine 40-50%ige (Volumen/Volumen) wässerige Acetonitrillösung, ein 75-80%ige (Volumen/Volumen) wässerige Methanollösung oder ähnliches. Wenn dies notwendig ist, kann die Trennung und dementsprechend die Durchführungsweise einfacher gestaltet werden, indem man 0,01-0,05% (Volumen/Volumen) eines Amines, wie z.B. Di-ethylamin oder Pyridin, zusetzt.

(1) Bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Bo und 20-0-Methyl-cundurango-glycosid Do.

Der Extrakt B-l wird der inversphasigen HPLC unterworfen. Gemäss des in Fig. 8 dargestellten Chromatogramms werden 2 Fraktionen ausgewählt, die der Fr-4-Fraktion (Fraktion des Cundurango-glycosides Bo) und Fr-5-Fraktion (Fraktion des 20-0-Methyl-cundurango-glycosides Do), und getrennt gesammelt. Die so erhaltenen beiden Fraktionen werden der inversphasigen HPLC unter den gleichen Bedingungen, wie oben erwähnt, unterworfen, und die beiden Fraktionen, die der Fr-4-1-Fraktion (Fig. 9) und der Fr-5-1-Fraktion (Fig. 11) entsprechen, werden getrennt gesammelt.

Schliesslich werden die jeweiligen Fraktionen mittels nor-malphasiger HPLC gereinigt, und die Fraktionen, die einem Peak entsprechen, wie er in den Chromatogrammen der Fig. 10 oder 12 auftritt, werden gesammelt und zur Trockene eingeengt, wodurch man die gewünschten Verbindungen in Form von weissen pulverartigen Materialien erhält.

(2) Bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Cun-durango-glycosid Ao.

Der Extrakt B-2 wird der normalphasigen HPLC unterworfen. Die Fr-2-2-1-Fraktion, die einem Peak entspricht, der im Chromatogramm der Fig. 13 gezeigt wird, wird gesammelt, und sodann der inversphasigen HPLC unterworfen. Eine Fraktion, die einem Peak entspricht, der im Chromatogramm der Fig. 14 gezeigt wird, wird gesammelt und zur Trockene eingeengt, wodurch man die erwünschte Verbindung in Form eines weissen pulverartigen Materiales erhält.

(3) Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Co.

Der Extrakt B-3 wird der inversphasigen HPLC unterworfen. Eine Fraktion entsprechend einem Peak, der im Chromatogramm der Fig. 14 gezeigt wird, wird gesammelt, und zur Trockene eingeengt, wodurch man die erwünschte Verbindung in Form eines weissen pulverartigen Materiales erhält.

(4) Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von 20-Iso-0-methyl-cundurango-glycosid Do und Cundurango-glycosid Do.

Es sei festgehalten, dass die erwünschten Verbindungen aus dem Extrakt A abgetrennt werden können, und man isoliert sie, indem man letzteren der HPLC unterwirft. Jedoch ergibt diese Verfahrensweise Probleme bezüglich der kommerziellen Durchführbarkeit, wegen der Anwesenheit von anderen polaren, ähnlichen Materialien, die komplexe Verfahrensweisen und ähnliche Probleme bedingen. Im vorliegenden Falle werden zwei Verbindungen leicht erhalten, indem man das oben erwähnte Cundurango-glycosid Bo chemischen Reaktionen unterwirft.

(i) Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von 20-Iso-0-methyl-cundurango-glycosid Do.

Das Cundurango-glycosid Bo wird der Alkoholyse unterworfen, und die so erhaltene Reaktionslösung wird zur Trok-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 533

12

kene eingeengt. Der Rückstand wird zuerst der normalphasigen HPLC und sodann der inversphasigen HPLC unterworfen, um die erwünschte Verbindung zu isolieren und zu reinigen.

Als Lösungsmittel für die Alkoholyse wird eine 10-6-10-4 molare Konzentration, vorzugsweise eine 10-4molare Konzentration, einer Lösung von Essigsäure in Methanol, eine 0,001-0,01 normale, vorzugsweise eine 0,005normale, Lösung von Oxalsäure in Methanol oder ähnliches angewandt. Die Menge an Lösungsmittel, die angewandt wird, ist das 50-500fache (Volumen/Gewicht) des Ausgangsmateriales. Die Reaktionszeit bei Zimmertemperatur kann 5-20 Stunden betragen, wenn eine Lösung aus Essigsäure in Methanol angewandt wird, oder 30-60 Minuten im Falle der Anwendung einer Lösung aus Oxalsäure in Methanol.

Unter Anwendung der normalphasigen HPLC-Verfah-rensweise wird eine Fraktion entsprechend der Fr-6-Fraktion, wie sie im Chromatogramm der Fig. 16 dargestellt ist, gesammelt. Diese Fraktion wird sodann der inversphasigen HPLC-Verfahrensweise unterworfen, wodurch man eine Fraktion erhält, die der Fr-6-1-Fraktion entspricht, die im Chromatogramm der Fig. 17 dargestellt ist, welche sodann zur Trockene eingeengt wird, wodurch man die erwünschte Verbindung in Form eines weissen pulverartigen Materiales erhält.

(ii) Bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Do.

Das Cundurango-glycosid Bo wird der Hydrolyse unterworfen und die so erhaltene Reaktionslösung wird zur Trok-kene eingeengt. Der Rückstand wird zuerst der normalphasigen HPLC und sodann der inversphasigen HPLC unterworfen, um die erwünschte Verbindung zu isolieren und zu reinigen.

Die Menge an Wasser, die angewandt wird, ist das 150-250fache (Volumen/Gewicht) bezüglich des Ausgangsmateriales.

Die Hydrolyse kann in einem Temperaturbereich zwischen Zimmertemperatur um 500 C ausgeführt werden, und zufriedenstellende Resultate werden erhalten bei Zimmertemperatur, ohne dass man die Temperatur erhöht. In letzterem Fall ist die Reaktion abgeschlossen, nachdem man die Lösung während 24-48 Stunden stehengelassen hat.

In der folgenden normalphasigen HPLC-Behandlung wird eine Fraktion entsprechend der Fr-7-Fraktion, wie sie im Chromatogramm der Fig. 18 dargestellt ist, gesammelt. Die so erhaltene Fraktion wird sodann nach der genannten inversphasigen HPLC-Verfahrensweise behandelt, wodurch man eine Fraktion entsprechend der Fr-7-1-Fraktion, wie sie im Chromatogramm der Fig. 19 gezeigt ist, sammelt und welche anschliessend zur Trockene eingeengt wird, wodurch man die erwünschte Verbindung in Form eines weissen pulverartigen Materiales erhält.

Im oben erwähnten Verfahrensschritt kann 20-Iso-0-Methyl-cundurango-glycosid Do durch das Cundurango-glycosid Bo, das als Ausgangsmaterial verwendet wird, ersetzt werden, wodurch mar die erwünschten Verbindungen erhält.

Die Antitumoraktivität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde durch den immunologischen Test, der in der Folge erläutert wird, bestätigt.

Für die Bestimmung der Antitumoraktivität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde das Ehrlich-Carcinom angewandt und der zu testende Tumor war von subkutanem Solidustyp.

Die Tiergruppe, an welche die erfindungsgemässen Verbindungen verabreicht wurde, bestand aus 7 Mäusen, während die Vergleichsgruppe aus 10 Mäusen bestand.

Testverfahren:

6 Wochen alte, männliche «ddy-Mäuse» (Körpergewicht

28-30 g) wurden verwendet, jedoch mit Ausnahme der Fälle, in denen Cundurango-glycosid Ao oder Co verabreicht wurden, und im letzteren Fall wurden 20-26 g wiegende und 5 Wochen alte Mäuse angewandt. Die Tumore wurden intraperitoneal in die Mäuse transplantiert. Am 7. Tag nach der Transplantation wurden die gutgewachsenen Zellen der Tumore entnommen, und 1,5 x 106 Zellen (3,0 x 106 Zellen im Falle der Verabreichung von Cundurango-glycosid Ao oder Co), davon wurden subkutan in die Leistengegend der Mäuse transplantiert, um Solidus-Tumore zu bilden. Bei und 24 Stunden nach der Transplantation wurden die erfindungsgemässen Verbindungen, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, den Mäusen intraperitoneal verabreicht.

Das Volumen der jeweiligen Lösungen, das verabreicht wurde, betrug 0,2 ml pro Maus pro Verabreichung, und die Verabreichung wurde während 10 Tagen fortgesetzt mit einer Abgabemenge von 1 x pro Tag. Den Mäusen der Vergleichsgruppe wurde nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht.

Am 30. Tag nach der Transplantation wurden die Tumore entnommen und gemessen, um das durchschnittliche Gewicht der Tumore der Mäuse aus der Gruppe, die mit den erfindungsgemässen Verbindungen behandelt wurden, zu bestimmen (T) und dasjenige Durchschnittsgewicht der Vergleichsgruppe (C), um das Verhältnis T/C (%) zu berechnen.

Resultate:

T/C (%)

mg/kg x Verabreichungen verabreichte Verbindung 8x10 16x10 32 x 10

Cundurango-glycosid Bo

23,3

11,8

10,0

20-0-Methyl-cundurango-

glycosid Do

16,5

11,6

-

Cundurango-glycosid Ao

32,1

27,3

-

Cundurango-glycosid Co

-

30,8

20,1

20-Iso-0-methyl-cundurango-

glycosid Do

38,1

26,3

18,0

Cundurango-glycosid Do

29,0

53,8

9,5

Als nächstes wurde die akute Toxizität der erfindungsgemässen Verbindungen wie folgt bestimmt: Um die Daten zu erhalten, wurden die erfindungsgemässen Verbindungen 5 Wochen alten männlichen «ddy-Mäusen» (Körpergewicht 21-25 g) intraperitoneal verabreicht, und der allgemeine Zustand, die Todesfälle und die Veränderungen im Körpergewicht wurden während 5 Tagen nach der Verabreichung beobachtet.

verabreichte Verbindung LDso (mg/kg)

Cundurango-glycosid Bo 615

20-0-MethyI-cundurango-glycosid Do 603

Cundurango-glycosid Ao 75

Cundurango-glycosid Co 375

20-Iso-0-methyl-cundurango-glycosid Do 642

Cundurango-glycosid Do 630

Wenn die erfindungsgemässen Verbindungen in Form von festen Präparationen für die orale Verabreichung angewandt werden, können die Formulierungen Tabletten, Granulate, Pulver, Kapseln oder ähnliches sein. Die Formulierungen können Zusatzstoffe enthalten, wie beispielsweise einen Exzi-pienten, wie beispielsweise ein Sacharid oder ein Zelluloseformulierungsmittel, ein Bindemittel, wie z.B. Stärkepaste

5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

647 533

oder Methyl-Zellulose, ein Füllstoff, ein die Auflösung unterstützendes Mittel und ähnliches enthalten, wobei alle diese Zusatzstoffe in der Pharmacie üblich angewandte sind. Im Falle, dass die erfindungsgemässen Verbindungen als flüssige oral verabreichbare Formulierungen angewandt werden, können sie in Form irgendeiner wässrigen Formulierungsform für innere Anwendung ausgewählt werden, wie z.B. Suspensionen, Emulsionen, Sirupe und ähnlichem, und darüber hinaus können sie als getrocknete Produkte angewandt werden, welche vor der Verwendung gelöst werden.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch in Form von wässrigen Lösungen, Suspensionen oder öligen oder wässrigen Emulsionen injiziert werden, aber üblicherweise werden die Injektionsflüssigkeiten hergestellt, indem. man die erfindungsgemässen Verbindungen in wässrigen, flüssigen Medien löst oder suspendiert, z.B. in sterilem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung. Wenn nötig, können übliche lösungsunterstütztende Mittel, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Zusätze für die Herstellung von isotonen Lösungen usw. der Injektionsflüssigkeit zugesetzt werden.

Die so erhaltenen Injektionsformulierungen werden in der Regel intravenös, intramuskulär, subkutan oder in irgendeiner anderen geeigneten Weise verabreicht. Die Dosierung kann erhöht oder vermindert werden, und zwar in geeigneter Weise abhängig vom Krankheitszustand, dem Alter des Patienten, der Formulierungsart, der Verabreichungsart usw., je nachdem ob die Formulierung oral oder durch Injektion verabreicht wird, aber die übliche tägliche bevorzugte Dosis der erfindungsgemässen Verbindungen für Erwachsene ist wie folgt:

Verabreichungsweg verabreichte Verbindung oral parenteral

(mg/kg)

Cundurango-glycosid Bo

0,2-100,0

0,2-16,0

20-0-Methyl-cundurango-

glycosid Do

0,3-50,0

0,1-16,0

Cundurango-glycosid Ao

0,6-6,0

0,2-2,0

Cundurango-glycosid Co

1,0-30,0

0,3-10,0

20-Iso-0-methyl-cundurango-

glycosid Do

0,6-51,0

0,2-17,0

Cundurango-glycosid Do

0,6-51,0

0,2-17,0

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, wenn Extrakt A der normalphasigen analytischen HPLC unterworfen wird;

Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn Extrakt A der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-2-Fraktion der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 4 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn Extrakt B-l der normalphasigen analytischen HPLC unterworfen wird;

Fig. 5 zeigt ein Chromatgoramm, wie es erhalten wird, wenn Extrakt B-2 der normalphasigen analytischen HPLC unterworfen wird;

Fig. 6 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-3-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 7 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt B-3 der normalphasigen analytischen HPLC unterworfen wird;

Fig. 8 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird,

wenn der Extrakt B-l der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 9 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-4-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 10 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-4-1-Fraktion der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 11 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-5-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 12 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-5-1 -Fraktion der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 13 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt B-2 der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 14 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-2-2-1-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 15 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der B-3 der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 16 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn Cundurango-glycosid Bo nach Alkoholyse der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 17 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-6-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 18 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn Cundurango-glycosid Bo nach Hydrolyse der normalphasigen HPLC unterworfen wird;

Fig. 19 zeigt ein Chromatogramm, wie es erhalten wird, wenn der Extrakt der Fr-7-Fraktion der inversphasigen HPLC unterworfen wird.

(Insbesondere bevorzugte Ausführungsform vorliegender Erfindung)

In der Folge wird die vorliegende Erfindung im Detail anhand des in der Folge gegebenen Beispieles erläutert.

Ein Liter Methanol wurde zu 500 g fein verteilter Rinde von Marsdenia cundurango Reichenbach fil. zugefügt, und die Mischung wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Sodann wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde 3 x in der gleichen Weise behandelt, indem man jeweils 0,751 Methanol anwandte.

Alle Filtrate wurden vereinigt und sodann zur Trockene bei 75 °C unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch man 69 g eines Extraktes erhielt. Zu diesem Extrakt, der in einen Scheidetrichter übergeführt worden war, wurden 150 ml Chloroform zugefügt, und anschliessend wurde heftig geschüttelt, und sodann wurde eine Chloroformschicht erhalten. Zum Rückstand wurden 50 ml Chloroform zugefügt, und man wiederholte die oben erwähnte Folgerungsweise 3 x.

Alle die Chloroformextrakte wurden vereinigt und sodann . der Unterdruckfiltration unterworfen, wobei man Fibra Cel CH-40 (Johns Manville Co. Ltd.) als Filtrationshilfsmittel anwandte. Das so erhaltene Filtrat wurde bei 40 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 42 g eines Extraktes erhielt. Dieser Extrakt wurde in 50 ml Chloroform gelöst, das zugegeben wurde, und anschliessend wurden 100 ml n-Hexan zugegeben. Die so erhaltene Mischung wurde gut gerührt und während 12 Stunden stehengelassen. Sodann wurde dekantiert, um den unlöslichen Anteil zu erhalten. Dieser Anteil wurde in 25 ml Chloroform gelöst, und es wurden 50 n-Hexan zur so erhaltenen Lösung zugefügt, welche sodann gut gerührt wurde und während 2 Stunden stehengelassen wurde. Die Lösung wurde der Dekantation unterworfen, um den unlöslichen Anteil zu erhalten und sodann

5

m

15

20

25

30

35

40

45

5.0

55

60

65

647 533

14

behandelte man in der gleichen Weise wie oben erwähnt 3 x. Der schliesslich erhaltene unlösliche Anteil wurde bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und man zerkleinerte, wodurch man 18 g eines braunen pulverartigen Materiales (Extrakt A) erhielt. 20 mg des Extraktes A wurden in 10 ml Chloroform gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der normalphasigen analytischen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Silicagel (Wako-gel LC-5H, hergestellt von Wako Junyaku Industry Co. Ltd., Japan); total poröser, ver-mahlenerTyp 5 Mikrometer; Kolonne: Innendurchmesser x Länge = 4 x 200 mm ; Elutionsmitte : h-Hexan/Chloro-form/Methanol-Mischung (Volumenverhältnis = 2:1:1); Elu-tionsgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute; Druck: 30 kg/cm2; Nachweis UV-Detektor: 280 nm (0,64 AUFS). Die so erhaltenen Daten sind im chromatographischen Diagramm der Fig. 1 dargestellt.

Die so erhaltenen 18 g des Extaktes A wurden in 50 ml Chloroform in 6 g Portionen gelöst. Dann wurde n-Hexan zu der so erhaltenen Mischung zugefügt, und zwar in einer maximalen Menge ohne Trübung zu bewirken, und die so erhaltene Lösung wurde der normalphasigen HPLC unterworfen (System 500 von Waters Co. Ltd.); stationäre Phase: Preppak 500-Silica (von Waters Co., Ltd.), total poröses Silicagel, sphärisch, spez. Oberfläche = 320 m2/g); Kolonne: Innendurchmesser x Länge = 57x300 mm; Elutionsmittel: n-Hexan/Chloroform/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis = 6:3:1); Fliessgeschwindigkeit: 150 ml/Minute; Nachweis: RI ('Aox 10~4 FIUFS). Ein Eluat, welches aufgrund des Peaks entsprechend der Fr-2-Fraktion in Fig. 2 und ein anderes Eluat, welches auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-3-Fraktion (in der gleichen Figur gezeichnet) wurden während 12 bzw. 13 Minuten gesammelt. Die jeweiligen Eluate wurden bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trok-kene eingeengt, wodurch man 5,54 g eines Extraktes aus der Fr-2-Fraktion und 2,88 g eines Extraktes aus der Fr-3-Frak-tion jeweils erhielt.

Der Extrakt aus der Fr-2-Fraktion wurde in 50 ml Chloroform gelöst und anschliessend wurde n-Hexan in der maximal möglichen Menge zugegeben, so dass keine Trübung auftrat. Die so erhaltene Lösung wurde der normalphasigen HPLC unter den gleichen Bedingungen unterworfen, wie das oben erwähnt wurde, jedoch unter Anwendung einer n-Hexan/Chloroform/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis 6:1:1) als Elutionsmittel. Ein Eluat, welches auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-2-l-Fraktion (gezeigt in Fig. 3) und ein anderes Eluat, welches auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-2-2-Fraktion (gezeigt in der gleichen Figur) während 6,5 bzw. 8 Minuten gesammelt wurde, wurde ausgewählt.

Die jeweiligen Eluate wurden bei 45 °C zur Trockene eingeengt, wodurch man 1,98 g eines weissen pulverförmigen Extraktes (Extrakt B-l entsprechend der Fr-2-l-Fraktion) und 0,91 g eines'anderen weissen pulverartigen Extraktes (Extrakt B-2 entsprechend der Fr-2-2-Fraktion) jeweils erhielt.

Die Daten, die erhalten wurden, indem man die so erhaltenen Extrakte B-l und B-2 der normalphasigen analytischen HPLC unter den gleichen Bedingungen wie für Extrakt A jeweils erhielt, sind in den Fig. 4 und 5 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Daneben wurde der Extrakt aus der Fr-3-Fraktion in 50 ml einer 70%igen (Volumen/Volumen) wässrigen Methanollösung gelöst, und man unterwarf der inversphasigen HPLC (System 500 von Waters Co. Ltd.); Stationäre Phase: Preppak 500-C18 (von Waters Co. Ltd., chemisch gebundenes Silicagel C18-Typ); Kolonne: Innendurchmesser x Länge = 57 x 300 mm; Elutionsmittel: 70% (Volumen/Volumen) wässrige Methanol-Lösung; Fliessgeschwindigkeit 100 ml/Minute und Nachweis: bei RI ('/so x 10"4 RIUFS).

Ein Eluat, welches auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-3-1-Fraktion (gezeigt in Fig. 6) ausgewählt wurde, wurde während 12 Minuten gesammelt, und man engte bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene ein, wodurch man 0,88 g eines weissen pulverähnlichen Extraktes (Extrakt B-3) erhielt.

Daten, die man erhielt, indem man den so erhaltenen " Extrakt B-3 der normalphasigen analytischen HPLC unter dergleichen Bedingungen wie obiger Extrakt A unterwarf, sind im chromatographischen Diagramm erhalten, welches in Fig. 7 dargestellt ist.

Die erfindungsgemässen neuen Verbindungen wurden bevorzugt erhalten, indem man die Extrakte B-l, B-2 und B-3 aus den vorangegangenen Verfahrensschritten wie folgt verwendete:

Cundurango-glycosid Bo:

Der Extrakt B-l wurde in 1 ml Acetonitril/Wasser/Di-ethylamin Mischung (volumetrisches Verhältnis =48:51,975:0,025) in 60 mg Portionen gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der inversphasigen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Lichrosorb RP-8 (hergestellt von Merck & Co. Ltd., 5 Mikrometer); Kolonne: Innendurchmesser x Länge 8 x 250 mm; Elutionsmittel: Azetonitril/Wasser/ Diethylamin-Mischung (volumetrisches Verhältnis =48:51,975:0,025); Elutionsgeschwindigkeit: 1,8 ml/ Minute; Druck: 150 kg/cm2; Nachweis: bei RI (54x 10~6 RIUFS). Eluate, die aufgrund des Peaks entsprechender Fr-4-Fraktion (gezeigt in Fig. 8) ausgewählt wurden, wurden während 5 Minuten gesammelt, vereinigt und zur Trockene bei 45 °C unter vermindertem Druck eingeengt.

Der Rückstand wurde der gleichen Operation wie oben erwähnt unterworfen, und es wurden Eluate ausgewählt auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-4-1-Fraktion (gezeigt in Fig. 9) und diese wurden während 5 Minuten gesammelt und vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trok-kene eingeengt, wodurch man 160 mg eines weissen pulverartigen Extraktes erhielt.

Dieser Extrakt wurde in einem ml Chloroform in 10 mg Portionen gelöst und sodann der normalphasigen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Silicagel (Wako-gel LC-5H von Wako Junyaku Industry Co. Ltd. in Japan, total poröser vermahlener Typ, 5 Mikrometer); Kolonne: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm; Elutionsmittel: n-Hexan/Chloro-form/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis: 7:2:1); Flussgeschwindigkeit 5 ml/Minute; Druck: 40 kg/cm2; Nachweis: bei UV 280 nm (1,28 AUFS). Es wurden Eluate ausgewählt auf Basis eines Peaks, der in Fig. 10 gezeigt wird, und die wurden während 2 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 85 mg Cundurango-glycosid Bo in Form eines weissen pulverartigen Materiales erhielt.

Dieses Material zeigt die folgenden physicochemischen Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt: 170-180 °C (weisser nicht-kristalliner Feststoff)

2. Spezifische optische Drehung: (a)o = + 11,5° (C = 0,72 in CHCh)

3. Analyse (C59H86O22• 2h2o):

Berechnet (%): C 59,88, H 7,67 Gefunden (%): C 59,72, H 7,48

4. UVA*a°H nm (8): 217 (3,27 x 104), 222 (3,04x 10") und 280 (5,05 x 10")

5. IRv£axC'\ cm-': 3350,1735,1710, 1640,1600, 1580, 1500, 1060-1100, 1000, 900 und 845

6. 'H-NMR(CDCh) 5, ppm: 1.00 (3H, S, 19Me), 1.23 (3H, d, J = 6Hz), 1.27 (3 H, d,J = 6Hz), 1.36 (3 H, d, J = 6Hz), 1.40 (3H, S, 21 Me), 1.92 (3H, S, Ac), 4.30,3.46,3.62 (je 3H, S), 4.15 (1H, broad d, J = 8Hz), 4.45 (2H, m), 4.83 (2H, breit d,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

647 533

J = 8Hz), 5.12 (IH, t, J = 9Hz), 5.21 (1H, d, J = 6Hz), 6.39 und 7.70 (2H, ABq, J = 16Hz) und 7.44-7.56 (5H, m)

7.13C-NMR (Py-ds), ppm

Genin-Anteil: 79.3 (3-C), 112.8 (20-C), 90.1 (14-C), 117.9, 128.7 (2 überlappende Linien), 129.3 (2 überlappende Linien) 130.8,134.7,146.1 und 166.1 (je von Cynnamoyl-Kohlenstoff) und 170.4 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetyl-Gruppe)

Zucker-Anteil: 69.1,101.7,101.8 und 106.4 (1-C der jeweiligen Zucker).

20-0-Methyl-cundurango-glycosid Do :

Die Fraktion, welche unmittelbar nach der Fraktion des Cundurango-glycosid Bo in der ersten inversphasigen HPLC-Behandlung auftritt, welche für die oben erwähnte Fraktionierung des Cundurango-glycosides Bo ausgeführt wurde, nämlich Eluate, welche auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-5-Fraktion, gezeigt in Fig. 8, ausgewählt wurden, wurden während 4 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt.

Der Rückstand wurde der gleichen Behandlungsweise wie oben erwähnt, unterworfen, und Eluate, die auf Basis des Peaks entsprechend der Fr-5-1-Fraktion, gezeigt in Fig. 11, ausgewählt wurden, wurden während 3 Minuten gesammelt, vereinigt und bei vermindertem Druck und einer Temperatur von 45 °C zur Trockene eingeengt, wodurch man 110 mg eines weissen, pulverartigen Extraktes erhielt.

Dieser Extrakt wurde in 1 ml Chloroform in 10 mg Portionen gelöst, und sodann der normalphasigen HPLC den gleichen Bedingungen, wie oben für die Fraktionierung des Cundurango-glycosides Bo angegeben, unterworfen. Eluate, ausgewählt auf Basis des einen Peaks, der in Fig. 12 gezeigt wird, wurden während 2 Minuten gesammelt, vereinigt, und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 72 mg an 20-0-Methyl-Cundurango-glycoside Do in Form eines weissen, pulverartigen Materiales erhielt.

Dieses Material zeigt die folgenden physicochemischen Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt: 180-190 °C (weisser nichtkristalliner Feststoff)

2. Spezifische optische Drehung: [a]o = — 8.76° (C = 0.72 in CHCb)

3. Analyse (CeoHwChj^mO):

Berechnet (%): C 57,59, H 7,89 Gefunden (%): C 57,97, H 7,39

4. UVVmS", nm (e): 217 (2.10 x 10"), 222 (1.92 x 104) und 280 (3.11 x 104)

5. IRvSäP1, cm-': 3350, 1735, 1710,1635, 1600, 1580, 1500,1160,1100,960,905 und 880

6. 'H-NMR(CDCh) 8, ppm: 0.86 (3H, S, 19Me), 1.22 (3H, d,J = 6Hz), 1.24 (6H, d,J = 6Hz), 1.38 (3H, S,21Me), 1.88 (3H, S, Ac), 3.27, 3.37, 3.43, 3.50 (je 3H, S), 4.09 (2H, ABq,

J = 9Hz), C-18), 4.42 (2H, m), 4.81 (2H, m), 5.03 (2H, m), 5.38 (IH, S, OH), 6.44 und 7.73 (2H, ABq, J= 16Hz) und 7.40-7.52 (5H, m)

7.I3C-NMR(Py-ds), ppm

Genin-Anteil: 79.3 (3-C), 106.0 (20-C), 81.1 (14-C), 117.8, 128.7 (2 überlappende Linien), 129.9 (2 überlappende Linien), 130.9,134.4,146.4 und 166.9 (je Cynnamoyl-Kohlenstoff) und 170.0 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetylgruppe)

Zucker-Anteil: 96.1,101.7, 101.9 und 106.4 (1-C der jeweiligen Zucker).

Cundurango-glycosid Ao:

Der Extrakt B-2 wurde in 1 ml Chloroform in 10 mg Portionen gelöst und sodann der normalphasigen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Silicagel (Wako-gel LC-5H von Wako Junyaku Industry Co. Ltd. in Japan, vollständig poröser, vermahlener Typ, 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm; Elutionsmittel: n-Hexan/Chloro-form/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis =7:2:1) ; Durchflussgeschwindigkeit: 6 ml /Minute; Druck: 50 kg/cm2; Nachweis: bei UV250 nm (0,64 AUFS).

Eluate, die auf Basis des Peaks, der in Fig. 13 gezeigt wird (Fr-2-2-1-Fraktion) ausgewählt wurden, wurden während 2 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 700 mg • eines weissen, pulverartigen Extraktes erhielt.

Dieser Extrakt wurde in 20 ml einer 75%igen (Volumen/ Volumen) wässrigen Methanol-Lösung in 10 mg Portionen gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der inversphasigen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Lichrosorb RP-8 (hergestellt von Merck & Co. Ltd., 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : 75% (Volumen/Volumen) wässrige Methanol-Lösung; Durchflussgeschwindigkeit: 4 ml/Minute; Druck: 160 kg/cm2; Nachweis: bei UV.280 nm (1,28 AUFS). Eluate, die auf Basis des einen Peaks, der in Fig. 14 gezeigt wird, ausgewählt wurden, wurden während 2 Minuten gesammelt, vereinigt, und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 466 mg weisses, pulverartiges Cundurango-glycosid Ao erhielt.

Dieses Material trägt die folgenden physiochemischen Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt: 170-174 °C (weisser nichtkristalliner Feststoff).

2. Spezifische optische Drehung: [a]o = +43.9° (C = 0.615 in MeOH)

3. Analyse (Cs9Hs8022-3H20):

Berechnet (%): C 58,89, H 7,87 Gefunden (%): C 59,23, H 7,69

4. UV/^xOH. nm (e): 217 (2.33 x 104), 223 (2.10 x 10") und 280 (3.39 x 104)

5. IRVmäi01, cm-': 3350, 1740, 1700, 1630, 1255, 1235, 1140, 1070, 870 und 820

6. 'H-NMRtCDCh) 8, ppm: 0.96 (3H, S, 19Me), 1.11 (3H, S, 18Me), 1.23 (3H, d,J = 6Hz), 1.25 (3H, d,J = 6Hz), 1.29 (3H, d, J = 6Hz), 1.86 (3H, S, Ac), 2.15 (3H, S, 21 Me), 3.39, 3.44, 3.61 (je 3H, S), 4.80 (1H, d, J= 10Hz), 5.34 (1H, t,

J = 10Hz), 6.46 und 7.78 (2H, ABq, J = 16Hz) und 7.45-7.60 (5H, m)

7.13C-NMR (Py-ds), ppm

Genin-Anteil: 79.3 (3-C), 83.9 (14-C), 212.6 (20-C), 118.0, 128.7 (2 überlappende Linien), 129.3 (2 überlappende Linien), 130.9, 134.7,146.3 und 166.9 (je Cynnamoyl-Kohlenstoff) und 170.3 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetylgruppe).

Zucker-Anteil: 96.1,101.7,101.8 und 106.4 (1-C der jeweiligen Zucker).

Cundurango-glycosid Co

Der Extrakt B-3 wurde in 1 ml 50%iger (Volumen/Volumen) wässriger Acetonitril-Lösung in 20 mg Portionen gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der inversphasigen HPLC unterworfen. Stationäre Phase: Lichrosorb RP-8 (hergestellt von Merck & Co. Ltd., 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : 50% (Volumen/ Volumen) wässrige Acetonitril-Lösung; Durchflussgeschwindigkeit 4 ml/Minute; Druck: 150 mg/cm2; Nachweis: bei UV 250 nm (0,64 AUFS). Eluate, die auf Basis des einen in Fig. 15 gezeigten Peaks ausgewählt wurden, wurden während 2 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 40 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 700 mg weisses, pulverartiges Cundurango-glycosid Co erhielt.

Dieses Material zeigt die folgenden physicochemischen Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt: 160-170 °C (weisser nicht kristalliner Feststoff)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 533

16

2. Spezifische optische Drehung: [cc]d = +25.9° (C= 1.28 in MeOH)

3. Analyse (C59H90O22 • 2h2o):

Berechnet (%): C 59,68, H 7,98

Gefunden (%): C 59,31, H 7,71 5

4. UVÄ0H, nm (e) 216 (2.83 x 104), 222 (2.52 x 10") und 279 (3.67 xlO4)

5. IRVmai01, cm-1: 3350,1740,1710,1630, 1260,1160, 1060, 870 und 820

6. !H-NMR(CDCl3) 8, ppm: 0.96 (3H, S, 19Me), 1.33 (3H, 10 S, 18Me) ca 1.24(4x3H,m), 1.85 (3H, S, Ac),3.38,3.44, 3.60 (je 3H, S), 4.40 (1H, breites d, J = 8Hz), 4.50 (1H, breites d,

J = 9Hz), 4.86 (1H, d, J = 10Hz), 5.36 (1 H, t, J = 10Hz), 6.48, 7.78 (2H, ABq, J= 16Hz) und 7.45-7.60 (5H, m)

7.13C-NMR (Py-ds), ppm 15

Genin-Anteil: 71.9 (20-C), 79.2 (3-C), 83.4 (14-C), 118.6, 128.6 (2 überlappende Linien), 129.2 (2 überlappende Linien) 130.9,134.8,145.6 und 167.0 (je Cynnamoyl-Kohlenstoff) und

170.4 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetylgruppe)

Zucker-Anteil: 96.0,101.8 (2 überlappende Linien) und 20

106.5 (1-C der jeweiligen Zucker).

20-Iso-0-methyl-cundurango-glycosid Do

Cundurango-glycosid Bo (100 mg) wurd ein 50 ml einer 10~4molaren Lösung von Essigsäure-in-Methanol gelöst, und 25 die so erhaltene Lösung wurde während 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, und anschliessend bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der so erhaltene Rückstand (100 mg) wurde in 5 ml Chloroform gelöst, und sodann der normalphasigen HPLC unterworfen. 30

Stationäre Phase: Silicagel (Wako-gel LC-5H von Wako Junyaku Industriy Co. Ltd. in Japan, vollständig poröser ver-mahlenerTyp, 5 Mikrometer): Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : n-Hexan/Chloro-form/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhält- 35

nis = 7:2:1); Durchflussgeschwindigkeit 6 ml/M'nute; Druck: 35 kg/cm2; Nachweis: bei RI (64x 10-6) RIUFS. Eluate, die aufgrund des Peaks entsprechend der Fr-6-Fraktion (gezeigt in Fig. 16) ausgewählt wurden, wurden während 4 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 0 C unter vermindertem 40 Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 50 mg eines weissen Pulvers erhielt.

Das Pulver wurde in 2 ml einer 78%igen (Volumen/Volumen) wässrigen Acetonitril-Lösung gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der inversphasigen HPLC unterworfen. 45 Stationäre Phase: Lichrosorb RP-18 (hergestellt von Merck & Co. Ltd., 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : 78% (Volumen/ Volumen) wässrige Acetonitril-Lösung; Durchflussgeschwindigkeit: 24 ml/Minute; Druck: 170 kg/cm2; Nachweis: bei RI so (64 x 10-6 RIUFS). Eluate, die aufgrund des Peaks entsprechend der Fr-6-1-Fraktion (gezeigt in Fig. 17) ausgewählt wurden, wurden während 3 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 30 mg weisses, pulverartiges 20-Iso-0- 55 methyl-cundurango-glycosid Do erhielt.

Dieses Material zeigt die folgenden physicochemischen Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt: 168-173 °C (weisser, nicht-kristalliner Feststoff) • 60

2. Spezifisch optische Drehung: [cc]d = -19.0° (C = 1.46 in MeOH)

3. Analyse (C6oH9o023*4H20):

Berechnet (%): C 57,59; H 7,89

Gefunden (%) : C 57,67 ; H 7,42 es

4. UVX®°H, nm (s): 218 (2.30 x 10"), 224 (2.10 x 104) und 280 (3.30 xlO4)

5. IRv£axCh, cm-1: 3400,1735, 1710, 1635, 1600,1580,

1500,1060-1100 und 950

6. 'H-NMR (CDCb) 8, ppm: 1.00 (3H, s, 19Me), 1.20-1.35 (9H, m) 1.40 (3H, s. 21 Me), 1.90 (3H, s, Ac), 3.29,3.35,3.41, 3.56 (je 3H, s) und 6.35 und 7.66 (2H, ABq, J = 16Hz), 7.40 (5H, m)

7. "C-NMR (Py-ds), ppm

Genin-Anteil: 79.3 (3-C), 83.3 (14-C), 109.4 (20-C), 118.7,

128.5 (2 überlappende Linien), 129.2 (2 überlappende Linien) 130.6,134.8,145.5 und 166.1 (je Cynnamoyl-Kohlenstoff und 169.3 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetylgruppe)

Zucker-Anteil: 96.2,101.7,101.8 und 106.4 (1-C der jeweiligen Zucker).

Cundurango-glycosid Do:

Cundurango-glycosid Bo (100 mg) wurde in 20 ml Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur während 24 Stunden stehengelassen, und sodann bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der so erhaltene Rückstand (100 mg) wurde in 2 ml Chloroform gelöst und der normalphasigen HPLC unterworfen.

Stationäre Phase: Silicagel (Wako-gel LC-5H von Wako Junyaku Industry Co. Ltd. in Japan, vollständig poröser gemahlener Typ, 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : n-Hexan/Chloro-form/Methanol-Mischung (volumetrisches Verhältnis =7:2:1); Durchflussgeschwindigkeit 6 ml/Minute; Druck 35 kg/cm2; Nachweis: bei RI (64x 10-6 RIUFS). Es wurden Eluate aufgrund des Peaks entsprechend der Fr-7-Fraktion (gezeigt in Fig. 18) während 3 Minuten gesammelt, vereinigt und bei 45 °C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 43 mg eines weissen Pulvers erhielt.

Das Pulver wurde in 2 ml 50%iger (Volumen/Volumen) wässriger Acetonitril-Lösung gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde der inversphasigen HPLC unterworfen.

Stationäre Phase: Lichrosorb RP-18 (hergestellt von Merck & Co. Ltd., 5 Mikrometer); Säule: Innendurchmesser x Länge = 8 x 250 mm ; Elutionsmittel : 50% (Volumen/ Volumen) wässrige Acetonitril-Lösung; Durchflussgeschwindigkeit: 2,4 ml/Minute; Druck: 150 kg/cm2; Nachweis: bei RI (32 x IO-6 RIUFS). Eluate, die aufgrund des Peaks entsprechend der Fr-7-1-Fraktion (gezeigt in Fig. 19) ausgewählt wurden, wurden während 1 Minute und 20 Sekunden gesammelt, vereinigt und bei 45 0 C unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wodurch man 30 mg des weissen, pulverartigen Cundurango-glycosides Do erhielt.

Dieses Material zeigte die folgenden physicochemischen Eigenschaften.

1. Schmelzpunkt: 183-188 °C (weisser, nicht kristalliner Feststoff)

2. Spezifische optische Drehung: [a]o = +13,5° (C = 0,99 in MeOH)

3. Analyse (C59H88O23 • 4H2O) :

Berechnet (%): C 57,27, H 7,82 Gefunden (%): C 57,11, H 7,36

4. UV*®oh nm (8): 218 (1.54 x 104), 221 (1.40 x 10") und 280 (2.29 x 104)

5. IRv£axCl!> cm-': 3400, 1735, 1710, 1635, 1600, 1500, 1160,900 und 860

]H-NMR(CDCh) 8, ppm: 1.00 (3H, S, 19Me), 1.20-1.35 (9H, m), 1.40 (3H, S. 21 Me), 1.90 (3H, S. Ac), 3.38,3.43,3.49 (je 3H, S), 6.36 und 7.68 (2H, ABq, J = 16Hz) und 7.36 (5H, m)

7.13C-NMR (Py-ds), ppm:

Genin-Anteil: 79.3 (3-C), 81.8 (14-C), 103.8 (20-C), 118.0,

128.6 (2 überlappende Linien), 129.1 (2 überlappende Linien) 130.0,134.7,146.2 und 166.8 (je von Cynnamoyl-Kohlen-stoff), 170.0 (Carbonyl-Kohlenstoff der Acetylgruppe)

Zucker-Anteil: 96.1,101.6,101.7 und 106.3 (C-I der jeweiligen Zucker).

7 Blatt Zeichnungen

Claims

647 533

PATENTANSPRÜCHE 1. Cundurango-glycosid-Verbindungen der Formel (1)

■CH = CU

c o* No in welcher

eine Gruppe der folgenden Formeln

ÇH3 CH3 C=0

CE

CH3 1 sGB

CH3 C^H

CH

JCH3

'och3

I

OE

, oce3 ch3

I

CH

oder

OS

ist.

647 533
2. Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Bo der Formel:

aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., dadurch gekennzeichnet, dass man den Extrakt von Marsdenia cundurango Reichenbach fil., der durch die folgenden in beliebiger Reihenfolge durchgeführten Arbeitsschritte erhalten wurde:

1. Schritt der Erhaltung eines in niederem Alkohol löslichen Anteils ;
2. Schritt der Erhaltung eines Anteils, der in einem anderen chlorierten Kohlenwasserstoff löslich ist als Tetrachlorkohlenstoff und
3. Schritt der Entfernung eines in aliphatischen Kohlenwasserstoffen löslichen Teils, den folgenden fünf aufeinander folgenden Arbeitsschritten unterwirft:

(1) Verfahrensschritt der Unterwerfung des Extraktes einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie, wobei der Füllstoff ein vollständig poröses, kugelförmiges Silicagel mit einer spezifischen Oberfläche von 320 m2/g ist, die Säule die Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 57 x 300 mm aufweist, und das Elutionsmittel eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis 6:3:1 ist, die Durchflussgeschwindigkeit: 150 ml/Minute beträgt, und der Nachweis bei RI 'Ao x 10~4 RIUFS erfolgt, und man eine aufgegangene Fraktion auf Basis des Peaks auswählt, welcher der in Fig. 2 gezeigten Fr-2-Fraktion entspricht;

(2) einen Verfahrensschritt durchführt, der darin besteht, dass man die nach (1) erhaltene Fraktion einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter den gleichen Bedingungen unterwirft, wie sie oben im Verfahrensschritt (1) angeführt sind, mit Ausnahme dessen, dass das veränderte Elutionsmittel eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol, mit einem volumetrischen Mischungsverhältnis von 6:1:1 ist, und wobei man eine Fraktion auswählt, die auf Basis des Peaks ausgewählt ist, welcher der in Fig. 3 dargestellten Fr-2-1-Fraktion entspricht;

(3) einen Verfahrensschritt durchführt, der darin besteht, 35 dass man die nach (2) erhaltene Fraktion einer inversphasigen

Hochdruckflüssigchromatographie unterwirft, wobei man als Füllstoff ein chemisch gebundenes Silicagel des Cs-Typs einsetzt, das eine Feinheit von 5 |i,m aufweist, wobei die verwendete Säule die Dimension Innendurchmesser x Länge von 40 8 x 250 mm aufweist, und das Elutionsmittel eine Mischung aus Acetonitril + Wasser + Diäthylamin im volumetrischen Verhältnis von 48:51, 975:0,025 ist, die Durchflusszeit 1,8 ml/ Minute beträgt, der Druck 150 kg/cm2 ist, und der Nachweis bei RI, 54 x 10~6 RIUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufgrund 45 des Peaks auszuwählen, der der Fr-4-Fraktion entspricht, die in Fig. 8 gezeigt wird, und man

(4) einen Verfahrensschritt durchführt, der darin besteht, dass man die nach (3) erhaltene Fraktion einer inversphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter den gleichen Bedin-

50 gungen unterwirft, wie sie im obigen Verfahrensschritt (3) angegeben sind, um eine Fraktion aufgrund des Peaks auszuwählen, welcher der in Fig. 9 dargestellten Fr-4-1-Fraktion entspricht und

(5) einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die nach 55 (4) erhaltene Fraktion einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen wird, in den man als Füllstoff Silicagel, das ein vollständig poröser zerstossener Typ mit 5 (im ist, verwendet, eine Säule mit der Dimension Innendurchmesser x Länge von 8 x 250 mm und als Elutionsmittel so eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol im volumetrischen Verhältnis von 7:2:1 einsetzt, wobei die Durchflussgeschwindigkeit 5 ml/Minute beträgt, der Druck 40 kg/ cm2 ist und der Nachweis bei UV 280 nm, 1,28 AUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzufangen, die aufgrund des einen Peaks t>5 ausgewählt wird, der in Fig. 10 gezeigt ist.
3. Verfahren zur Herstellung von 20-0-Methyl-Cun-durango-glycosid Do, welches die folgende Formel

647 533

4

besitzt aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., wobei man bei diesem Verfahren einen Extrakt aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., der durch die folgenden Verfahrensschritte:

1. Schritt der Erhaltung eines in niederem Alkohol löslichen Teiles,
2. Schritt der Erhaltung eines Teiles, der in einem anderen chlorierten Kohlenwasserstoff löslich ist als Kohlenstofftetrachlorid und
3. Schritt der Entfernung eines in aliphatischen Kohlenwasserstoffen löslichen Teiles erhalten wird, wobei die Reihenfolge der drei angegebenen Verfahrensschritte beliebig ist, nacheinander den folgenden fünf Verfahrensschritten unterwirft:

1. Schritt der Durchführung einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie mit dem fraglichen Extrakt unter Verwendung des Füllstoffs, der ein vollständig poröses kugelförmiges Silicagel mit einer spezifischen Oberfläche von 320 m2/g ist, wobei die verwendete Säule die Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 57 x 300 mm besitzt, das Elutionsmittel eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Metha-nol, im volumetrischen Mischungsverhältnis von 6:3:1 ist, die Durchflussgeschwindigkeit 150 ml/Minute beträgt und der Nachweis bei RI, V20 x 10~4 RIUFS, erfolgt, um eine Portion aufzufangen, die aufgrund des Peaks ausgewählt wird, welcher der in Fig. 2 dargestellten Fr-2-Fraktion entspricht;
2. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem der Extrakt einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter den gleichen Bedingungen unterworfen wird, wie sie in obigem Verfahrensschritt 1 erläutert sind, mit Ausnahme dessen, dass man als Elutionsmittel eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol im volumetrischen Mischungsverhältnis von 6:1:1 verwendet, um eine Fraktion zu gewinnen, die aufgrund des in Fig. 3 dargestellten Peaks entsprechend der Fr-2-1-Fraktion ausgewählt wird;
3. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Frak-35 tion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt einer inversphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung des Füllstoffs, der chemisch gebundenes Silicagel des C8-Typs mit einer Korngrösse von 5 (im ist, unterworfen wird, wobei die Säule die Dimension Innendurchmesser x Länge

40 von 8 x 250 mm besitzt, das Elutionsmittel eine Mischung aus Acetonitril + Wasser + Diäthylamin im volumetrischen Verhältnis von 48:51,975:0,025 ist, die Durchflussgeschwindigkeit 1,8 ml/Minute beträgt, der Druck 150 kg/cm2 ist und der Nachweis bei RI, 64 x 10-6 RIUFS, erfolgt, um eine Fraktion 45 aufzufangen, die auf Basis des Peaks, welcher der in Fig. 8 dargestellten Fr-5-Fraktion entspricht, ausgewählt wird;
4. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Fraktion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt einer inversphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter den glei-

50 chen Bedingungen unterworfen wird, die in dem obigen Verfahrensschritt 3 genannt sind, um eine Fraktion aufzufangen, die auf Basis des Peaks, welcher der in Fig. 11 dargestellten Fr-5-l-Fraktion entspricht, ausgewählt wird;
5. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Frak-55 tion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt der normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung eines Silicagels, das ein vollständig poröser zerkleinerter Typ mit 5 um ist, als Füllstoff, und einer Säule der Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 8 x 250 mm unterwirft,

60 wobei das Elutionsmittel eine Mischung aus n-Hexan-Chlo-roform-Methanol im volumetrischen Mischungsverhältnis von 7:2:1 ist, die Durchflussgeschwindigkeit 5 ml/Minute beträgt, der Druck 40 kg/cm2 ist und der Nachweis bei UV 280 nm, 1,28 AUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzufangen, 65 die auf Basis des einen Peaks ausgewählt wird, der in Fig. 12 dargestellt ist;
4. Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Ao, welches die folgende Formel

5 647 533

aufweist, aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., wobei Mischungsverhältnis von 6:1:1 einsetzt, um eine Fraktion auf-

man bei diesem Verfahren einen Extrakt aus Marsdenia zufangen, die auf Basis des Peaks ausgewählt wird, welcher cundurango Reichenbach fil., der durch die folgenden drei der in Fig. 3 dargestellten Fr-2-2-Fraktion entspricht;

Verfahrensschritte erhalten wurde: 40 3. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Frak-

1. Schritt der Erhaltung eines in niedrigem Alkohol lösli- tion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt einer nor-chen Anteils; malphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Ver-
2. Schritt der Erhaltung eines Anteils, der in einem ande- wendung eines Silicagel Füllstoffs, der ein vollständig porö-ren chlorierten Kohlenwasserstoff löslich ist als Tetrachlor- ser zerkleinerter Typ mit 5 (im ist, und einer Säule mit den kohlenstoff; und 45 Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 8 x 250 mm
3. Schritt der Entfernung des in aliphatischen Kohlenwas- unterwirft, wobei das Elutionsmittel eine Mischung aus n-serstoffen löslichen Teils, wobei die Schritte 1 bis 3 in beliebi- Hexan-Chloroform-Methanol im volumetrischen Mischungsger Reihenfolge durchführbar sind, nacheinander den folgen- Verhältnis von 7:2:1 ist, die Durchflussgeschwindigkeit 6 ml/ den vier Verfahrensschritten unterwirft: Minute, und der Druck 50 kg/cm2 beträgt, und der Nachweis

1. Verfahrenssehritt, bei dem der Extrakt einer normal- 50 bei UV 250 mm, 0,64 AUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzu-phasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwen- fangen, die aufgrund des Peaks ausgewählt wird, welcher der dung eines Füllstoffes, der ein vollständig porôsçs kugelför- in Fig. 13 dargestellten Fr-2-2-l-Fraktion entspricht, und man miges Silicagel mit der spezifischen Oberfläche von 320 m2/g 4. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Frak-ist, sowie einer Säule mit den Dimensionen Innendurchmes- tion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt der inverspha-ser x Länge von 57 x 300 mm unterwirft, wobei als Elutions- 55 sigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung mittel eine Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol, im eines chemisch gebundenen Silicagels des Cs-Typs als Füll-volumetrischen Mischungsverhältnis von 6:3:1 eingesetzt Stoff, der eine Feinheit von 5 um aufweist, und unter Verwen-wird, die Durchflussgeschwindigkeit 150 ml/Minute ist und dung einer Säule mit den Dimensionen Innendurchmes-

der Nachweis bei RI, V20 x 10-4 RIUFS, erfolgt, um eine Frak- serx Länge von 8 x 250 mm unterworfen wird, und wobei tion aufzufangen, die aufgrund des Peaks ausgewählt wird, 60 man als Elutionsmittel eine 75%ige (Volumen/Volumen)

welcher der in Fig. 2 dargestellten Fr-2-Fraktion entspricht; wässrige Methanollösung einsetzt, die Durchflussgeschwin-
2. einen Verfahrensschritt durchführt, bei dem die Frak- digkeit 4 ml/Minute beträgt und der Druck 160 kg/cm2 ist, tion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt der normal- und wobei der Nachweis bei UV 280 nm, 1,28 AUFS, erfolgt, phasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter den glei- um eine Fraktion aufzufangen, die auf Basis des einen in chen Bedingungen unterworfen wird, wie sie in dem oben 65 Fig. 14 dargestellten Peaks ausgewählt wird.

beschriebenen Verfahrensschritt 1 beschrieben sind, mit Aus- 5. Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid nähme dessen, dass man als Elutionsmittel eine Mischung aus Co, welches die Formel n-Hexan-Chloroform-Methanol mit einem volumetrischen

647 533

6

aufweist, aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., dadurch gekennzeichnet, dass man den Extrakt aus Marsdenia cundurango Reichenbach fil., der durch die folgenden drei Verfahrensschritte erhalten wurde:

1. Schritt der Erhaltung eines in niederem Alkohol löslichen Teilés;
2. Schritt der Erhaltung eines Teiles, der in einem anderen chlorierten Kohlenwassertoff, als Tetrachlorkohlenstoff löslich ist und
3. Schritt der Entfernung eines in aliphatischen Kohlenwasserstoffen löslichen Teiles, wobei die Verfahrensschritte 1 bis 3 in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden können, den 3 nacheinanderfolgenden Verfahrensschritten unterwirft;

1. ein Verfahrensschritt, bei dem der Extrakt einer normalphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung eines vollständig porösen pulverförmigen Silicagels mit einer spezifischen Oberfläche von 320 m2/g als Füllstoff ist, unterworfen wird, unter Verwendung einer Säule mit den Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 57 x 300 mm, und einer Mischung aus n-Hexan-Chloroform-Methanol im Volumenverhältnis von 6:3:1 als Elutionsmittel, und wobei die Durchflussgeschwindigkeit 150 ml/Minute beträgt und der Nachweis bei RI, Via x 10~4 RIUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzufangen, die aufgrund des Peaks, welcher der in Fig. 2 dargestellten Fr-3-Fraktion entspricht, auszuwählen ;
2. man die Fraktion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt der inversphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unterwirft, unter Verwendung eines Füllstoffes, welcher ein 45 chemisch gebundener Silicagel-Cis-Typ ist, und einer Säule mit den Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 57 x 300 mm, sowie einer 70%igen (Volumen/Volumen) wäss-rigen Methanollösung als Elutionsmittel, wobei die Durchflussgeschwindigkeit 100 ml/Minute beträgt und der Nach-5o weis bei RI, '/so x 10-4 RIUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzufangen, die aufgrund des Peaks ausgewählt wird, welcher der in Fig. 6 dargestellten Fr-3-1-Fraktion entspricht;
3. man einen Verfahrensschritt durchführt, bei welchem die Fraktion aus dem vorangehenden Verfahrensschritt einer 55 inversphasigen Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen wird, wobei der Füllstoff ein chemisch gebundenes Silica-gel-des Cs-Typs ist, der eine Feinheit von 5 Jim besitzt, verwendet wird, und die eingesetzte Säule die Dimensionen Innendurchmesser x Länge von 8 x 250 mm aufweist, das Elu-60 tionsmittel eine 50%ige (Volumen/Volumen) wässrige Aceto-nitril-Lösung ist, die Durchflussgeschwindigkeit 4 ml/Minute beträgt, der Druck 150 kg/cm2 ist, und der Nachweis bei UF 250 nm, 0,64 AUFS, erfolgt, um eine Fraktion aufzufangen, die aufgrund des einen Peaks ausgewählt wird, der in Fig. 15 dargestellt ist.
6. Verfahren zur Herstellung von 20-Iso-0-Methyl-Cun-durango-glycosid Do, welches die folgende Formel

65

c'

o

H OH

aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cund- 30

urango-glycosid Bo, welches die Formel besitzt einer Alkoholyse mit Methanol unterwirft.
7. Verfahren zur Herstellung von Cundurango-glycosid Do, welches der Formel

647 533

8

entspricht, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cund-urango-glycosid Bo, welches die Formel aufweist, einer Hydrolyse unterwirft. 65 es eine Verbindung gemäss Patentanspruch 1, gemischt mit
8. Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Verbindung gemäss Patentanspruch 1 enthält. Trägermaterial, enthält.
9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass

647 533

Technisches Gebiet