DE69906688T2

DE69906688T2 - Herstellung von neuen gelen für die reinigung von nicht-polaren extrakten

Info

Publication number: DE69906688T2
Application number: DE69906688T
Authority: DE
Inventors: William F. Collins; Bachir A. SARR; A. David FIELDER
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-11
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2019-01-12
Also published as: EP1047438B1; EP1047496B1; CA2317495C; AU1956299A; AU2144799A; CA2317495A1; CA2317496A1; JP2002500088A; EP1047438A1; CA2317496C; EP1047496A1; JP4050467B2; US6582594B1; US6989098B2; DE69919981T2; WO1999034916A1; JP2002500372A; DE69919981D1; US20030150805A1; WO1999034810A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von elektrostatisch verbundenen, aliphatisch oder alizyklisch substituierten anionischen oder kationischen Polysaccharidgelen aus leicht verfügbaren makroporösen ionischen Polysaccharidchromatographiemedien. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Isolierung, Wiedergewinnung und Reinigung von nichtpolaren Extrakten mittels der Polysaccharidgele in einem hydrophoben Interaktionschromatographieverfahren zur Absorbtion und Desorbtion der Extrakte in Gegenwart und als Ergebnis der Konzentration und Auswahl eines organischen Lösungsmittels.
Landwirtschaftliche Pflanzen und ihre Verarbeitungsabfälle können beispielsweise Komponenten enthalten, von denen mittlerweile festgestellt wurde, dass sie gewünschte therapeutische oder andere Nutzen haben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Saponine antineoplastischen chemotherapeutischen Nutzen besitzen (US Patent 5,558,866), während andere Saponine Verwendung in der Behandlung von Hypercholesterolemie besitzen (US Patent 5,502,038). Darüber hinaus sind antifungale (z. B. Crombie, W. M. L., und Crombie, L., Phytochemistry 25: 2069–2073, 1986) und immunogene (US Patent 5,597,807) Aktivitäten als auch Oberflächen-, emulsions- und schaumstabilisierende Eigenschaften bekannt, die von Price et al. (CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 26, 27–135, 1987) zusammengefasst sind. Dies sind jedoch nur einige wenige Beispiele aus der Literatur.
Darüber hinaus ist von einigen Flavonen und ihren Glycosiden bekannt, dass sie antimutagenetische (z. B. Peryt, B., et al., Mutation Res. 269: 201–215, 1992) und Antitumor-Aktivitäten (z. B. Wei, H., et al., Cancer Res. 50: 499–502, 1990) besitzen. Weitere Veröffentlichungen nützlicher biologischer Aktivitäten und zweckmäßiger Eigenschaften können in einer Vielzahl von Übersichtsartikeln (z. B. „Plant flavonoids in biology and medicine II. Biochemical, cellular, and medicinal properties" Ed. by V. Cody, E. Middleton Jr., J. B. Harborne, and A. Beretz, Liss Inc., New York, 1988) gefunden werden.
Die kanadischen Patentanmeldungen 2,006,957 und 2,013,190 beschreiben Ionenaustauschverfahren, die in wässrigem Ethanol durchgeführt wurden, um kleine Mengen von hoch nützlichen Nebenprodukten aus dem Verarbeitungsabfall von Getreidekörnern wiederzugewinnen. Gemäß CA 2,013,190 wird ein alkoholischer Extrakt aus Getreidekörnern entweder in einer anionischen und/oder kationischen Ionenaustauschsäule aufgetrennt, um geringe aber wirtschaftlich wertvolle Produkte zu erhalten. Die anionischen, kationischen und neutralen Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert und eine Anzahl von Komponenten identifiziert. Beispielsweise sind in einer anionischen Fraktion einer alkoholischen Extraktion von geschältem Vollkornhafer „hull-less whole oats" die folgenden Komponenten identifiziert: Phenolsäuren einschließlich Ferulasäure, P-Cumarsäure und Kaffeesäure; Alkaloide wie Avenanthramide; Fettsäuren, organische Säuren und Aminosäuren. Die neutrale Fraktion des gleichen alkoholischen Extrakts enthielt Verbindungen wie freie Zucker, Phenole wie Flavonoide, Saponine wie Avenacoside und Desglycosylavenacoside; Alkaloide wie die Avenacine; und verschiede polare Lipide. Die in den verschiedenen Fraktionen identifizierten Verbindungen wurden durch Ionenaustauschchromatographie nicht einzeln isoliert, da viele der Verbindungen unter den verwendeten Bedingungen die gleiche Nettoladung aufwiesen und daher das Verfahren allein für die Isolierung dieser für die Industrie oder kommerzielle Verwendung nützlichen Verbindungen von geringem Wert ist. Weiterhin sind die entsprechend der vorliegenden Erfindung zu isolierenden Verbindungen unter den verwendeten Bedingungen zum großen Teil neutral und können daher nicht allein mit der Ionenaustauschchromatographie isoliert werden, da diese Moleküle aufgrund ihrer Ladung sortiert.
PCT-Anmeldung WO 92/06710 offenbart sowohl die Zusammensetzung als auch die Isolations/Abtrenntechniken von Saponinen des Seifenbaums (Quillaja) zur letztendlichen Verwendung als immunogene Komplexe unter Verwendung sich wiederholender semipräparativer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Umkehrphasensäule mit einem Acetonitril : Wasser-Elutionsgradienten. Der Maßstab der Abtrennung scheint dabei nicht für die Produktion von bedeutenden Mengen für die gewerbliche Verwendung ausgelegt zu sein, sondern eher für den Nachweis der Wirksamkeit. Die isolierten Produkte wurden nur im Mikrogramm-Maßstab hergestellt. Die Durchführung des Abtrennverfahrens im größeren Maßstab für eine kommerzielle Anwendung war nicht offenbart.
Das US Patent 5,094,960 beschreibt Verfahren der Abtrennung von Prozess-Chemikalien von instabilen biologischen Gemischen durch hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) mittels eines Harzes umfassend Oktadecylketten, die an eine Silika-Matrix gekoppelt sind. Ein Verfahren zur Entfernung von fettlöslichen Prozess-Chemikalien wie synthetischen Detergenzien, chemischen Stimulatien und organischen Lösungsmitteln aus wässrigen biologischen Flüssigkeiten, insbesondere darauf abgestellt, um eine proteinhaltige Zusammensetzung wie Blutplasma, Cryoprezipitate und Blutplasmafraktionen herzustellen, wurde beschrieben. In dieser Beschreibung sind Materialien und Bedingungen enthalten, die die Adsorbtion und Abtrennung von Proteinen minimieren und das Entfernen der Prozess-Chemikalien maximieren. Im Wesentlichen wird kein biologisches Material auf der Säule zurückgehalten. Weiterhin wird kein Hinweis darauf gegeben, welches das bevorzugte Verwendungsgebiet der Verbindungen und Chemikalien ist, die in dem Verfahren adsorbiert werden noch werden spezifische Bedingungen genannt, um irgendwelche adsorbierten Bestandteile, die auf der Säule zurückgehalten wurden, wieder zu gewinnen.
Eine Reihe verschiedener Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Isoflavonen sind bekannt. D. E. Walter beschreibt ein Verfahren zur Herstellung des Isoflavons Genistin und seines Aglycons Genistein von entfetteten Sojabohnenflocken (J. Amer. Chem. Soc. 63, 3273–3276, 1941). Das Verfahren beinhaltet eine Methanolextraktion, Azetonprezipitation, Zentrifugation und verschiedene Umkristallisationen und ergibt nur ein Isoflavon, Genistin, von dem das Aglycon Genistein durch saure Hydrolyse hergestellt werden konnte. Ohta et al. beschreibt ein Verfahren zur Isoflavonextraktion von entfetteten Sojabohnen, indem die Flocken mit Ethanol extrahiert wurden und der ethanolische Extrakt mit Azeton und Ethylazetat behandelt wurde. Eine Reihe von Fraktionen, von denen einzelne Isoflavone durch wiederholte Umkristallisation wiedergewonnen werden konnten, wurden durch Säulenchromatographie der Ethylazetatfraktion auf einem Silikagel und Sephadex LH-20^TM in verschiedenen zusätzlichen Lösungsmitteln hergestellt (Agric. Biol. Chem. 43: 1415–1419, 1979). Im Wesentlichen die gleichen Abtrennprotokolle wurden durch Farmakalidis, E., und Murphy, P. A., verwendet, um Isoflavone abzutrennen, die mittels angesäuertem Azeton und nicht mit Ethanol extrahiert waren (J. Agric. Food Chem. 33: 385–389, 1985). Diese Veröffentlichungen sind nur einige einer ganzen Reihe von Beispielen der Literatur bezüglich der Extraktion und Reinigung von spezifischen Isoflavonen für den Labormaßstab. Aufgrund der Handhabung und Entsorgung von Lösungsmitteln als auch der Wirtschaftlichkeit sind diese Verfahren hinsichtlich ihres Maßstabs jedoch kaum auf ein für ein gewerbliches Verfahren ausreichenden anzupassen, als dass es auch kaum möglich ist einzelne Verbindungen in größeren als in den angegebenen Mengen herzustellen.
Das US Patent 5,679,806 befasst sich mit einigen dieser Probleme und offenbart ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Isoflavonen aus pflanzlichem Material. Das Verfahren besteht aus drei Schritten, wobei das Pflanzenmaterial extrahiert wird, der erhaltene Extrakt mit geringem Druck auf einer Polymethacrylat- oder C₁₈-Umkehrphasenchromatographiesäule durch Gradienteneluierung der adsorbierten Isoflavone von der Säule fraktioniert wird, und schließlich die resultierenden Fraktionen enthaltend die spezifischen Isoflavone von der Säule eluiert werden. Dieses Verfahren unterscheidet sich in einigen bedeutenden Schritten von dem in vorliegender Anmeldung beschriebenen Ausführungsbeispielen. Erstens ist das vorliegende Verfahren nicht auf die Isoflavonbestandteile beschränkt, sondern ergibt zusätzlich eine Saponinfraktion, die im Wesentlichen frei von Isoflavonen als auch von der gesamten Gruppe der Isoflavone ist, die falls gewünscht weiter auf einzelne Verbindungen fraktioniert werden kann. Zweitens baut das vorliegende Verfahren nicht auf Methacrylat oder C₁₈-substituierte anorganische Trägermatrizen für die Umkehrphase auf, die im Allgemeinen deutlich geringere Beladungskapazitäten aufweisen und schwerer vor Ort gereinigt werden können als auf Polysaccharid basierende Gele. Drittens erlaubt die Flexibilität des vorliegenden Verfahrens, dass Bedingungen variieren können, entweder um die Isoflavone durch Absorbtion einzufangen oder dadurch, dass sie durch die Säule eluiert werden können, wobei andere Nicht-Isoflavonbestandteile weiter absorbiert bleiben, was durch einfaches Variieren der Wassermenge in einer wässrigen alkoholischen Waschlösung durchgeführt werden kann.
Das US Patent 5,482,914 lehrt, dass auf Agarose basierende Gele für die Bindung von Lipoproteinen durch kovalentes Verknüpfen von Glycidylethern von Polyoxyethylendetergenzien des Typs HO-(CH₂CH₂O)_n-O-R synthetisiert/modifiziert werden können, um eine modifizierte Gel-Matrix herzustellen, die zur Entfernung von Lipoproteinen aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten geeignet ist. Diese Technologie bezieht sich einzig auf die chemischen Verfahren zur Herstellung des Gels und beanspruchen weder die elektrostatische Bindung von Liganden wie von uns beschrieben, noch für irgendwelche Beispiele der Abtrennung und Wiedergewinnung aus pflanzlichem Material.
Daher besteht weiterhin der Bedarf an Verfahren, chromatographischen Verfahren und verbesserten Absorbtionsmedien, die an viele Verbindungen in einer konventionell praktikablen Weise adaptierbar sind, und die hohe Konzentrationen dieser Verbindungen zur Verfügung stellen, die anschließend in hoher Ausbeute, Reinheit und in unveränderter Form wiedergewonnen werden können. Es besteht ebenfalls der Bedarf für ein Verfahren, in dem die Chromatographiemedien regeneriert und oftmals wiederverwendet werden können, um sowohl die Abfallentsorgungskosten als auch die Ersetzungskosten zu reduzieren. Weiterhin wäre es für eine Produktion im kommerziellen Maßstab von nicht polaren Extrakten ebenfalls vorteilhaft, den direkten Kontakt von Lösungsmitteln wie chlorierten Hydrokohlenwasserstoffen (z. B. Chloroform, Dichlormethan), Nitrilen (z. B. Acetonitril), Aromaten (z. B. Benzol, Tuluol), anderen potenziell unerwünschten Reagenzien (z. B. Salzen, Mineralsäuren, Basen) und Chromatographiemedien-Verunreinigungen (Methacrylat-, Divenylbenzol-, Styrol-Monomere, Silika usw.) vom direkten Kontakt mit den gewünschten Produkten zu verringern. Um den letzten Punkt zu erreichen und trotzdem die notwendigen Abtrennungen zu erzielen, ist es wünschenswert, die Chromatographiemedien selektiv zu ändern, um die erforderliche Abtrennung zu erreichen und nur ein einfaches akzeptables Lösungsmittel zu verwenden und nicht ein einziges Chromatographiemedium zu verwenden und auf einen großen Bereich von nicht akzeptablen Lösungsmitteln angewiesen zu sein. Auf diese Voraussetzungen zielt dieses Verfahren ab.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von elektrostatisch verbundenen, aliphatisch oder alizyklisch substituierten anionischen oder kationischen Polysaccharidgelen aus frei verfügbaren makroporösen ionischen Polysaccharidchromatographiemedien.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner elektrostatisch verbundene, aliphatisch oder alizyklisch substituierte anionische oder kationische Polysaccharidgele, die mit dem vorliegenden Verfahren hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Isolierung, Wiedergewinnung und Reinigung nicht-polarer Extrakte unter Verwendung der Polysaccharidgele in einem Verfahren der hydrophoben Interaktionschromatographie, der Absorbtion und Desorbtion der Extrakte in Gegenwart und als Ergebnis von der Konzentration und Selektion eines organischen Lösungsmittels.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung eines elektrostatisch verbundenen aliphatisch oder alizyklisch substituierten anonischen oder kationischen Polysaccharidgels aus einer makroporösen ionischen Polysaccharidchromatographiematrix zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: mittels Ionenaustausch einen hydrophoben Liganden, der eine stark ionisierbare funktionelle Gruppe enthält, die von entgegengesetzter Ladung ist im Vergleich zu der des Polysaccharids, anzulagern, so dass ein wesentlicher Anteil der verfügbaren ionischen Gruppen (Plätze) des Polysaccharids unter Bildung einer Komponente von modifizierter hydrophober Phase durch den Liganden besetzt ist.
In einem Aspekt des vorliegenden Verfahrens wird ein kationisches Polysaccharidgel, equilibriert in wässrigem Ethanol, unter Verwendung eines Überschusses an Hydroxidionenäquivalenten einer verdünnten Base in eine Hydroxidform umgewandelt und anschließend unter Verwendung eines Überschusses an ionischen Äquivalenten des anionischen Detergenz in einer entsprechend anionischen detergenzsubstituierten Form umgewandelt. Beispielsweise ist das kationische Polysaccharidgel QAE Sephadex A-25^TM, die verdünnte Base 0,5 N NaOH in wässrigem 50% Ethanol und das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat.
In einem weiteren Aspekt des vorliegenden Verfahrens wird ein anionisches Polysaccharidgel, equilibriert in wässrigem Ethanol, unter Verwendung eines Überschusses von Wasserstoffionenäquivalenten einer verdünnten Säure zu einer Wasserstoffform umgewandelt und anschließend unter Verwendung eines Überschusses von ionischen Äquivalenten des kationischen Detergenz in der entsprechenden detergenzsubstituierten Form umgewandelt. Beispielsweise ist das anionische Polysaccharidgel SP Sephadex C-25^TM, die verdünnte Säure 0,1 N HCl in wässrigem 50% Ethanol und das kationische Detergenz Hexadecytrimethylammoniumbromid.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein elektrostatisch verbundenes, aliphatisch oder alizyklisch substituiertes anionisches oder kationisches Polysaccharidgel zur Verfügung gestellt, umfassend einen hydrophoben Liganden, elektrostatisch gebunden an eine makroporöse ionische Polysaccharidgelmatrix, so dass eine wesentliche Menge der verfügbaren ionischen Stellen der ionischen Polysaccharidgelmatrix durch den Liganden besetzt sind, um eine modifizierte hydrophobe Phasenkomponente zu bilden, wobei der Ligand eine stark ionisierbare funktionelle Gruppe mit entgegengesetzter Ladung zur ionischen Polysaccharidgelmatrix aufweist.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung von nichtpolaren Extrakten, umfassend: das nicht-polare Extraktionsgut in einer wässrig-organischen Lösungsmittel-Lösung mit einer Gel-Matrix in Berührung zu bringen, die ausgewählt ist aus der aus einer elektrostatisch verbundenen aliphatisch- oder alizyklisch-substituierten anionischen oder kationischen Polysaccharid-Gel-Matrix bestehenden Gruppe; die Gel-Matrix mit der wässrig-organischen Lösungsmittel-Lösung zu waschen; die Gel-Matrix mit zusätzlicher wässrig- organischer Lösungsmittellösung zu wachsen, wobei der Anteil des organischen Lösungsmittels in der zusätzlichen Lösung vergrößert wird; und das Extraktionsgut aus einem Ausflussstrom zu gewinnen.
Diese und andere Eigenschaften der Erfindung werden aufgrund der nachfolgenden Beschreibung, die auf die nachfolgenden Zeichnungen Bezug nimmt, deutlicher.
1 zeigt die Extraktion und Gruppenabtrennung von Hafersaponinen.
2 zeigt die Abtrennung von Hafersaponinen des Avenacin- und Avenacosid-Typs.
3a zeigt das HPLC-ELSD-Profil von Avenacin-Hafersaponinen und
3b zeigt das HPLC-ELSD-Profil von Avenacosid-Hafersaponinen.
4a zeigt das HPLC-ELSD-Profil von Octylsepharose CL-4B^TM gereinigtem Avenacin A-1,
4b zeigt das Massenspektrum von gereinigtem Avenacin A-1 und
4c zeigt die Struktur von Avenacin A-1 aus Haferschrot.
5 zeigt die Isolierung und Gruppenabtrennung von Saponinen aus Quinoa.
6a zeigt das HPLC-ELSD-Profil der Quinoasaponinfraktion.
6b zeigt das HPLC-UV-Profil der Quinoasaponinfraktion.
6c zeigt die HPLC-ELSD-Zuordnungen für die Quinoasaponine.
7a zeigt das TLC-Profil der angereicherten Quinoasaponinfraktion,
7b zeigt das TLC-Profil der Quinoasaponin-Gruppe 1-Fraktion und
7c zeigt das TLC-Profil der Quinoasaponin-Gruppe 2-Fraktion.
8 zeigt die Reinigung und Abtrennung der Quinoa-Saponine der Gruppe 1 und 2.
9 zeigt das Verhältnis zwischen der Ethanolkonzentration und der Kettenlänge für verschiedene K'-Werte von Avenacin A-1 auf SP Sephadex C-25TM Alkyltrimethylammoniumsäulen mit unterschiedlichen Kettenlängen.
10 zeigt das Verhältnis zwischen Ethanolkonzentration in K'-Werten wie in 9 mit dem Unterschied, dass es auf die Kettenlänge bezogen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von elektrostatisch verbundenen, aliphatisch oder alizyklisch substituierten anionischen oder kationischen Polysaccharidgelen aus frei erhältlichen makroporösen ionischen Polysaccharidchromatographiemedien.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Isolierung, Wiedergewinnung und Reinigung nichtpolarer Extrakte unter Verwendung der Polysaccharidgele in einem Verfahren der hydrophoben Interaktionschromatographie zur Absorbtion und Desorbtion der Extrakte in Gegenwart und als Ergebnis der Konzentration und Selektion eines organischen Lösungsmittels.
Die fundamentalen Prinzipien sowohl der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) und der reversen Phasenchromatographie (RPC) sind ähnlich: chromatographische Abtrennung von Bestandteilen eines Gemisches, basierend auf ihren unterschiedlichen Affinitäten zwischen einem nichtpolaren oder hydrophoben Liganden, der an eine stationäre Phase angelagert ist, und einer mobilen Phase. In der RPC besteht die stationäre Phase im Allgemeinen aber nicht immer aus einem anorganischen pelliculären oder particulären hydrophilen Träger, typischerweise Silika, auf den ein spezifischer Ligand mit einer relativ hohen Hydrophobizität mit einer vollständigen oder extrem hohen Substitutionsrate angebracht wurde, um die hydrophile stationäre Phase wirksam zu ersetzen, maskieren oder neu zu beschichten. Oft aber nicht immer enthält die mobile Phase einen organischen Modifieer (d. h. ein organisches Lösungsmittel), das typischerweise Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran ist. In HIC besteht die stationäre Phase üblicherweise aus einem organischen hydrophilen makroporösen Träger, typischerweise ein chemisch modifiziertes Polysaccharid oder Polyacrylamid, auf das ein spezifischer Ligand mit einer relativ geringen Hydrophobizität in ähnlicher Weise aber gewöhnlich mit einer viel geringeren Substitutionsrate aufgebracht wurde, um die hydrophilen Eigenschaften des Träges zu modifizieren aber nicht notwendiger Weise zu eliminieren. Meistens aber nicht immer besteht die mobile Phase aus Wasser enthaltend einen Puffer oder eine Salzlösung variabler Konzentration.
RPC ist die am meisten verwendete Technik für die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Abtrennung von relativ stabilen organischen Verbindungen mit geringem Molekulargewicht. Jedoch hat die Abtrennung von vielen biologischen Makromolekülen (z. B. Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren) durch RPC nur eine geringe Anwendbarkeit erfahren, da die stärkere Interaktion mit einer hoch hydrophoben stationären Phase und die Verwendung von organischen Lösungsmitteln als Elutionsbestandteile sehr nachteilig für die natürliche Struktur der Makromoleküle sein kann. Als Ergebnis dieser Wechselwirkungen sind viele der Makromoleküle einer Entfaltung und Denaturierung mit dem gleichzeitigen Verlust eines Teils oder der gesamten biologischen Aktivität ausgesetzt.
HIC wurde als praktische Alternative zur RPC zur Abtrennung und Reinigung von biologischen Makromolekülen entwickelt, da sowohl die Absorbtions- als auch Desorbtionsprozesse in einem wässrigen Puffer durch einfaches Variieren der Salzkonzentrationen durchgeführt werden können. Diese Bedingungen sind günstiger für die Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität der Makromoleküle. Jedoch scheinen einige Anwendungen der HIC für die Abtrennung von relativ stabilen organischen Verbindungen mit einem geringen Molekulargewicht gemacht worden zu sein. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zeigt die HIC-stationäre-Phase einzigartige Vorteile für die Abtrennung und Reinigung von Amphiphilen (d. h. Verbindungen enthaltend sowohl hydrophile als auch hydrophobe Regionen), die in den meisten wenn nicht allen RPC-stationären-Phase-Chromatographiemedien nicht vorhanden sind, durch Aufrechterhaltung eines funktionellen hydrophilen Kerns zusätzlich zu dem hydrophoben Ligand in unmittelbarer räumlicher Nachbarschaft. Beispiele solcher amphiphilen Extrakte enthalten aber sind nicht begrenzt auf Saponine, Flavonoide und Prolamine, die hydrophile Substituenten enthalten (d. h. glykosidische Reste), die an ein relativ nichtpolares Grundgerüst angebracht sind. Falls diese Amphiphile zusätzlich Stabilität gegen verschiedene organische Lösungsmittel wie die niederen Alkohole und Ketone einschließlich Ethanol, Isopropanol und Aceton zeigen, können diese Lösungsmittel verwendet werden, um die Komponenten, die an das Gel gebunden sind (d. h. Laufenlassen des HIC-Systems in einem „RPC-Modus") entweder durch Gradienten, sequenzielle oder Batch-Wiedergewinnungstechniken wiederzugewinnen, die alle dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Chromatographie bekannt sind.
Weiterhin haben wir entsprechend der vorliegenden Erfindung beobachtet, dass solche HIC-Gele die Kapazität aufweisen, um wässrige Dispersionen und Mizellen zu klären, von denen bekannt ist, dass sie gebildet werden, wenn solche Amphiphile (d. h. wässrige Lösungen und Dispersionen von Saponinen, Flavonoiden und Prolaminen oberhalb ihrer kritischen mizellaren Konzentration) artifiziell hergestellt werden oder in der Extraktion, Konzentration und Reinigung oder anderen Manipulationen wässriger alkoholischer Preparationen aus landwirtschaftlichen Nutzpflanzen und gemeinsamen Verarbeitungsabläufen zusammenkommen.
Das hydrophobe Interaktionschromatographiepolysaccharidgel der vorliegenden Erfindung kann aus einer kationisch substituierten Polysaccharidgelmatrix bestehen, die hergestellt wird aus einem neutralen Polysaccharid der Klasse der Polyanhydrogalactane oder Polydextrane wie vernetzte Agarose, enthaltend kovalent verknüpfte kationisch geladene funktionale Gruppen wie tertiäre Amine (DEAE, PEI) oder quartäre Amine (QAE, Trimethylamin) wie DEAE Sephadex A-25^TM, QAE Sephadex A-25^TM und Q Sepharose^TM (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ, USA). Entsprechend dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind diese Gele mit einem hydrophoben Liganden modifiziert. Der Ligand ist ausgewählt aus einer anionisch verbundenen Alkylsubstitution aus der Klasse der anionischen Detergenzien einschließlich Alk(en)ylsulfonaten und -sulfaten, Alk(en)ylphosphonaten und -phosphaten, Mono- und Di-alky(en)ylphosphatidsäuren. Der Ligand kann ebenfalls eine anionisch verbundene alizyklische Substitution aus der Klasse der anionischen Detergenzien enthalten einschließlich Taurocholate und Taurodesoxycholate oder gemischte Liganden der Klasse der anionischen Detergenzien einschließlich Alk(en)ylarylsulfonate wie Dodecylbenzolsulfonsäuren und Alk(en)ylbenzolsulfonaten. Gemäß eines Aspekts der Erfindung kann die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoffe enthalten.
Das hydrophobe Interaktionschromatographiepolysaccharidgel kann auch aus einer anionisch substituierten Polysaccharidgelmatrix bestehen, die aus einem neutralen Polysaccharid aus der Klasse der Polyanhydrogalactane oder Polydextrane hergestellt ist wie eine vernetzte Agarose enthaltend kovalent verknüpfte anionisch geladene funktionale Gruppen wie Alk(en)ylsulfonate und Alk(en)ylphosphonate. Bestimmte Beispiele enthalten Sulfopropyl (SP) wie SP Sephadex C-25^TM (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). SP Sepharose^TM ist ein weiteres Beispiel für eine Polysaccharidgelmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind diese Gele durch einen hydrophoben Liganden modifiziert. In dieser Ausführungsform ist der hydrophobe Ligand eine kationisch verbundene Alkylsubstitution aus der Klasse der kationischen Detergenzien einschließlich Alk(en)yltrimethylammoniumhalogeniden wie CETRIMIDE^TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und quartäre Alk(en)ylammoniumhalogenide wie Tetrabutylammoniumbromid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), quartäre Alk(en)ylpyridiniumhalogenide wie Hexadecylpyridiniumbromid oder Alk(en)ylmagnesiumhalogenide und ähnliche Grignard Reagenzien. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoffen enthalten.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet daher die Herstellung von spezifischen HIC-Gelen aus leicht verfügbaren Startmaterialien durch einfache Ionenaustauschverfahren wie hierin beschrieben. Grundsätzlich kann jede der beiden verschiedenen Arten der Ionenaustauscher, anionisch oder kationisch, die vorzugsweise aus einem ionisch substituierten Polysaccharidgel bestehen, als hydrophiler Kern verwendet werden. Zu diesem Kern ist ein hydrophober Ligand, der aus den vorstehend aufgeführten Klassen der anionischen oder kationischen Detergenzien ausgewählt ist und der eine stark ionisierbare funktionelle Gruppe entgegengesetzter Ladung zu der des Polysaccharids enthält, durch Ionenaustausch angebracht, so dass alle oder im Wesentlichen alle der verfügbaren ionischen Stellen in dem ursprünglichen Polysaccharid durch den Liganden besetzt sind, um eine modifizierte hydrophobe Phasenkomponente zu bilden. Mit dem Begriff „alle oder im Wesentlichen alle" ist gemeint, dass mindestens 70% und bis etwa mindestens 90% der verfügbaren ionischen Stellen in dem ursprünglichen Polysaccharid durch den Liganden besetzt sind.
Als ein Beispiel für das Verfahren der Herstellung dieser neuen Gele wurde QAE Sephadex A-25^TM Anionaustauschchromatographiegel in der Chloridform, wie vom Hersteller erhalten und in wässrigem Ethanol zum Beispiel 50% wässriges Ethanol equilibriert, unter Ausnutzung der Schwerkraft in eine Säule gepackt. Das Lösungsmittel muss nicht notwendigerweise wässriges Ethanol sein, sondern kann irgendein Lösungsmittel sein wie Wasser oder wässriges Methanol; Isopropanol oder Azeton, enthaltend ausreichend Wasser, um das Aufquellen der Polysaccharidkernmatrix für den Zweck der vorliegenden Erfindung zu bewirken. Zuerst wird die Säule in die Hydroxid (d. h. OH^–) Form umgewandelt. In einem Beispiel wird dieser Schritt durchgeführt, indem man einen Überschuss an Hydroxidionenäquivalenten (bezogen auf die Menge des herzustellenden Gels) einer verdünnten Base durch die Säule passieren lässt und diese dann durch Waschen auf einen neutralen pH-Wert einstellt. Beispielsweise ist die verdünnte Base eine 0,5 N NaOH-Lösung in wässrigem 50% Ethanol und die Waschlösung ist ebenfalls wässriges 50% Ethanol. Die Base muss nicht notwendigerweise NaOH, sondern kann jede andere Base wie KOH, NH₄OH usw. sein und wie vorstehend ausgeführt muss das Lösungsmittel nicht notwendigerweise wässriges 50% Ethanol sein. Die Säule wird dann zu der gewünschten neuen anionischen Detergenz-substituierten Form umgewandelt durch einfaches Passieren eines Überschusses ionischer Äquivalente dieses Detergenz durch die Säule und erneutes Waschen der Säule, um sämtliches überflüssiges Detergenz zu entfernen. Beispielsweise ist das anionische Detergenz 0,5 N Natriumdodecylsulfat (SDS) in wässrigem 50% Ethanol und die Waschlösung ist ebenfalls wässriges 50% Ethanol. Dieses Verfahren ist im Wesentlichen das gleiche für jedes der zuvorstehend aufgeführten anionischen Detergentien und ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Ionenaustaschchromatographie wohl bekannt.
Als weiteres Beispiel des Verfahrens zur Herstellung dieser neuen Gele wurde SP Sephadex^TM C-25 kationische Austauschchromatographiegel in der Natriumform, wie vom Hersteller erhalten und in wässrigem Ethanol zum Beispiel wässriges 50% Ethanol equilibriert, unter Nutzung der Schwerkraft in eine Säule gepackt. Das Lösungsmittel muss nicht notwendigerweise wässriges Ethanol, sondern kann jedes Lösungsmittel wie Wasser oder wässriges Methanol, Isopropanol oder Azeton sein, enthaltend ausreichend Wasser, um das Aufquellen der Polysaccharidkernmatrix zu bewirken. Zuerst wird die Säule in die Wasserstoffform (d. h. H⁺) umgewandelt. Beispielsweise wird dieser Schritt dadurch ausgeführt, indem man einen Überschuss von Wasserstoffionenäquivalenten (bezogen auf die Menge des herzustellenden Gels) einer verdünnten Säure durch die Säule passiert lässt und diese dann durch Waschen auf einen neutralen pH-Wert einstellt. Beispielsweise ist die verdünnte Säure eine 0,1 N HCl-Lösung in wässrigem 50% Ethanol und die Waschlösung ist ebenfalls wässriges 50% Ethanol. Die Säure muss nicht notwendigerweise HCl, sondern kann jede Säure wie zum Beispiel H₂SO₄, Trifluoressigsäure, H₃PO₄ usw. sein und wie vorstehend ausgeführt muss das Lösungsmittel nicht notwendigerweise wässriges 50% Ethanol sein. Die Säule wird dann zu der gewünschten neuen kationischen Detergenz-substituierten Form umgewandelt durch einfaches Passieren eines Überschusses ionischer Äquivalente dieses Detergenz durch die Säule und erneutes Waschen der Säule, um sämtliches überschüssiges Detergenz zu entfernen. Beispielsweise ist das kationische Detergenz 0,5 N Hexadecyltrimethylammonium (HDTMA⁺) Bromid in wässrigem 50% Ethanol und die Waschlösung ebenfalls wässriges 50% Ethanol. Das Verfahren ist im Wesentlichen das gleiche für jedes der vorstehend aufgeführten kationischen Detergentien und ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Ionenaustauschchromatographie wohl bekannt.
Die Verwendung dieser kationisch substituierten und anionisch substituierten Polysaccharidgele eröffnet ein neues Gebiet der selektiven hydrophoben Interaktionstrennverfahren, die dem Anwender erlauben, ein geeignetes ionisches Gegenion zur Anlagerung an das Gel für spezifische Anwendungen auszuwählen. Beispielsweise würde man für die Isolierung von Steroiden Taurocholinsäure verwenden oder Cholesterinsulfonat zur Bindung von Östrogenen, Sexualhormonen usw. Zur Abtrennung von Isomergemischen für Reformkostbestandteile würde man cis vs trans ungesättigte Alkylreste verwenden. Dies sind nur einige wenige Beispiele. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Chromatographie wird sofort andere ähnliche Gele erkennen, die für bestimmte Verwendungen hergestellt werden können.
Wie vorstehend erwähnt betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung dieser Gele zur Isolierung, Wiedergewinnung und Reinigung nicht-polarer Extrakte. Dieser Aspekt der Erfindung beruht auf der Hydrophobizität der zu isolierenden nicht-polaren Extrakte und der Änderung der Hydrophobizität, die sich durch die Änderung der Konzentration der Lösungsmittel zur Wiedergewinnung ergibt. Die unterschiedlichen Konzentrationen können durch Zugabe von mehr oder weniger Wasser zu dem Wiedergewinnungslösungsmittel erreicht werden. Insbesondere basiert diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf den beobachteten selektiven Unterschieden der hydrophoben Anziehung zwischen relativ nichtpolaren Extrakten enthaltend aliphatische und/oder alizyklische funktionelle Gruppen im Vergleich zu solchen enthaltend aromatische und/oder olefinische funktionelle Gruppen, oder keine von beiden; und einem aliphatisch oder alizyklisch substituierten Polysaccharid basierten Gel. Die Unterschiede basieren ferner auf den Änderungen dieser Anziehung, die durch Änderung der Zusammensetzung geeigneter Lösungsmittel nämlich einfach durch die Zugabe von mehr oder weniger Wasser erreicht werden kann.
Mit „nicht-polare Extrakte" ist gemeint, dass die Extrakte in wässrigen alkoholischen Lösungsmitteln, die in einer Zusammensetzung von 5–95% vorliegen, nur partiell löslich sind. Der Begriff schließt Extrakte ein, die relativ nicht-polar sind. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Gruppen der Verbindungen, die abgetrennt werden können, nicht-polare Verbindungen und sind aus der folgenden Gruppe ausgewählt, die jedoch nicht abschließend ist: Steroide und Triterpenoidderivate wie Saponine, Herzglykoside und Sterylkonjugate; Flavonoide wie Flavone, Flavonole, Isoflavone und all ihrer Glycoside; phenolische Konjugate wie aliphatische Alkoholester und Amide; polare Lipide wie Mono- und Diglyceride und deren Derivate und Alk(en)ylresorcinole; und Prolamine wie Zein, Avenin, Hordein oder Gliadin. Die nicht-polaren Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Verbindungen.
Mit synthetischen Verbindungen ist jede Verbindung gemeint, die mit synthetischen chemischen Mitteln hergestellt ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere nützlich zur Reinigung synthetischer Verbindungen, die pharmazeutischen oder therapeutischen Nutzen haben.
Natürlicherweise vorkommende Verbindungen beinhalten die Verbindungen wie vorstehend beschrieben und ebenfalls Verbindungen von Algen, Pilzen und einzelligen Organismen. Diese natürlicherweise vorkommenden Verbindungen enthalten natürlicherweise in dem Mikroorganismus vorkommende Verbindungen und ebenfalls solche, die durch genetisch modifizierte Zellen hergestellt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die neuen Gele verwendet, um Saponine aus verschiedenen Quellen zu isolieren und zu reinigen. Saponine sind Sapogenole (Tripernoidaglycone) enthalten bis zu fünf Zuckerresten. Saponine im Allgemeinen und Sojasaponine insbesondere erhalten viel Aufmerksamkeit aufgrund des wachsenden Marktanteils von Sojabohnen und auch aus pharmakologischer Sicht. Von Sojasaponinen wurde berichtet, dass sie haemolytische, kropferzeugende, antioxidative und hypolipidemische Eigenschaften aufweisen. Von ihnen ist ebenfalls gezeigt worden, dass sie auf Soja basierenden Lebensmitteln einen bitteren und astringenten Geschmack verleihen. Ihre Isolierung und Charakterisierung ist zur Züchtung neuer Varietäten und für deren Herstellung als pharmakologisch aktive Wertschöpfungsprodukte wichtig. Aufgrund ihrer komplexen Chemie ergeben die bekannten chemischen Isolierungsverfahren (d. h. Verseifung oder Lösungsmittelextraktion) jedoch geringe Mengen oder hydrolysierte Produkte.
Die vorliegende Erfindung wurde beispielsweise zur Isolierung von Hafersaponinen verwendet. Zwei verschiedene Saponinarten wurden von Haferkernen isoliert: Die avenacosidartigen pentazyklischen Tripernoidsaponine und die avenacinartigen steroidalen Saponine. Beide Arten zeigen selektive antimikrobielle Aktivität (z. B. Wubben, J. P., u. a., Phytopath. 86, 986–992, 1996; Maizel, J. V., u. a., Biochemistry 3, 424–426, 1964) und erweisen sich als aktive Bestandteile in topischen Cremes und Lotionen für Gesundheitsprodukte oder als antimikrobielle Substanzen für landwirtschaftliche Saatbehandlungsformulierungen als wertvoll.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die neuen Gele zur Isolierung von Saponinen aus Quinoa verwendet. Chenopodium guinoa Willd. (Quinoamelde, quinoa) ist ein natürliches Getreide in Südamerika. In den letzten Jahren wurde einiges wissenschaftliches Interesse aufgrund des Ernährungswert des Getreides (der Proteingehalt beträgt im Mittelwert 14% des Frischgewichtes) und seiner winterfesten Wachstumseigenschaften gezeigt. Unglücklicherweise hat das Getreide eine begrenzte Nutzbarkeit als menschliche Nahrungsquelle aufgrund der Bitterkeit seiner Saathülle, von der angenommen wird, dass sie teilweise durch die Gegenwart der Saponine hervorgerufen wird. Diese Saponine werden vorzugsweise in den äußeren Schichten der Getreide einschließlich Perianth und Fruchtwand gefunden. Traditionellerweise wurde das Getreide mit Wasser gewaschen, um den größten Teil dieser bitteren Bestandteile zu entfernen, bevor es konsumiert wurde.
In den letzten zehn Jahren wurden fast zwei Dutzend Saponine, sowohl neutrale als auch saure, aus Quinoa isoliert (z. B. Mizui, Fl, u. a., Chem. Pharm. Bull. 36, 1415–1418, 1988; Mizui, F. u. a., Chem. Pharm. Bull. 38, 375–377, 1990). Diese Saponine enthalten eines von drei pentazyklischen Tripertin Aglyconen, nämlich Oleanolsäure, Hederagenin oder Phytolaccageninsäuren. Die glykosidischen Reste der neutralen Saponine können aus irgendeiner Kombination von Glukose, Galactose oder Arabinose bestehen, wobei sie Mono-, Di-, Tri- oder Tetraglykoside ergeben. Die sauren Saponine können saure Funktionaliäten am Kohlenstoffatom 28 oder einen Glukuronsäurerest enthalten, der an das dritte Kohlenstoffatom des triterpenoiden Rückgrats gebunden ist. Im Allgemeinen sind diese Saponine ziemlich polar und enthalten bis zu vier Glykosylreste. Sowohl zweiwertige Säuren als auch Bisdesmoside wurden isoliert.
Kürzlich wurden Quinoasaponine in pharmazeutischen Präparationen als immunologische Adjuvantien verwendet (z. B. US Patente 5,597,807 und 5,688,772). Von ihnen ist gezeigt worden, dass sie nicht spezifische Immunität stimulieren, eine immunologische Antwort auf ein ausgewähltes Antigen verstärken und die mucosale Absorption eines verabreichten Arzneimittels verstärken.
Verfahren zur Isolierung von Saponinen aus Quinoa beinhalten die Extraktion aus ganzen Samen oder Kleiefraktionen entweder mittels Wasser oder Methanol (z. B. Ridout, C., u. a., J. Sci. Food Agric. 54, 165–176, 1991, und Meyer, B. N., u. a., J. Agric. Food Chem. 38, 205–208, 1990). In beiden Verfahren wurden die Extrakte mit einem nicht-polaren Lösungsmittel wie Petrolether oder Diethylether entfettet. Die Lösungsmittelabtrennung (üblicherweise n-Butanol/Wasser) gefolgt von einer klassischen Säulenchromatographie mittels Silikagel mit Methanol/Chloroform ergab die Isolierung dieser Verbindungen. Aufgrund der Verwendung von ätzenden Lösungsmitteln, unvollständiger Abtrennung der Komponenten und der Schwankungen in den Ausbeuten wären diese Verfahren schwierig wirtschaftlich zu entwickeln. Eine Vielzahl von chemischen-, spektralen-, enzymatischen- und Bioassay-gerichteten Verfahren zum Nachweis von Quinoasaponinen ist in der Literatur beschrieben worden einschließlich GC (z. B. Burnouf-Radosevich, M., u. a., Phytochemistry 24, 2063–2069, 1984), HPLC (z. B. Ruales, Jl, und Nair, B, Food Chemistry 48, 137–143, 1993) und TLC (z. B. Ng, K. G., u. a., Food Chemistry 49, 311–315, 1994). Einzelne Saponine wurden durch NMR und GC-MS charakterisiert (z. B. Ma, W-W., u. a., J. Nat. Prod. 52, 1132–1135, 1989).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen aus Pflanzenmaterialien isoliert werden. Der Begriff Pflanzenmaterial beinhaltet landwirtschaftliche, Weinbau-, Gartenbau- oder Aquakulturprodukte. Landwirtschaftliche Pflanzen beinhalten Getreidekörner, z. B. Weizen, Hafer, Roggen, Mais, Quinoa, Quinoamelde (Quinoa), Amaranth, Buchweizen, Triticale oder Gerste; oder Ölsamen wie Sojabohne, Canola (Raps), Leinsamen, Sonnenblume, Safran oder Senf; oder Hülsenfrüchte, z. B. Erbsen, Linsen oder Bohnen; oder Futterpflanzen wie Schwingel, Wiesenlieschgras (Timothy), Klee, Alfalfa, oder Weizengras; oder Kräuter wie Petersilie, Rosmarin, Salbei oder Minze. Die Verbindungen können ebenfalls aus ihren gemeinsamen Verarbeitungsabläufen wiedergewonnen werden. Die Erfindung ist jedoch nicht eingeschränkt auf Verbindungen, die aus Pflanzen oder gemeinsam verarbeiteten Agrarprodukten isoliert werden. Die Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um Verbindungen aus Algen, Pilzen und einzelligen Organismen zu extrahieren.
Die Waschlösungsmittel-extrahierenden Lösungsmittel oder Wiedergewinnungslösungsmittel sind im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung untereinander austauschbar und können niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Isopropanol; Ketone wie Azeton, Wasser und eine Kombination von niederen Alkoholen oder Ketonen mit Wasser beinhalten, sind jedoch nicht auf diese limitiert.
Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Extraktion von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenbestandteilen wird erkennen, dass eine Vielzahl von verschiedenen Extraktionsmethoden in der Literatur beschrieben wird einschließlich Filtration (Percolation), Muldenextraktion, Gegenstromextraktion usw. Das verwendete bestimmte Extraktionsverfahren ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht wichtig.
Die vorliegende Erfindung verwendet hydrophobe Interaktionschromatographie alleine oder in Kombination mit anderen Abtrenntechniken, um die gewünschte Verbindung zu isolieren. In diesem Zusammenhang kann die in der vorliegenden Anmeldung offenbarte Erfindung mit Abtrenntechniken wie in der anhängigen Erfindung des Anmelders mit dem Titel „A Process for the Purification of Non-Polar Extractives" offenbart kombiniert werden, wobei die anhängige Erfindung aliphatisch substituierte Polysaccharidgelmatrizes in einem Verfahren von hydrophober Interaktionschromatographie verwendet.
Das Verfahren zur Reinigung der nicht-polaren Extrakte entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält drei Grundschritte: Absorption, Waschen und Wiedergewinnen. Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Verfahren einen vierten optionalen Schritt der Regenerierung der Säule, ohne die Verwendung von ätzenden chemischen Behandlungen oder der Erzeugung von übermäßigem Salz oder nicht wiedergewinnbaren Verarbeitungsabfällen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Auftrennung und Reinigung einer großen Anzahl von Extrakten mit ähnlichen Lösungseigenschaften in wässrigen alkoholische Lösungsmitteln aufgrund ihrer unterschiedlichen Bindung an spezifisch modifizierte Polysaccharidgele bewirkt werden. Solche Extrakte können enthalten: Steroide und Triterpenoide wie Saponine, Herzglykoside und Sterylkonjugate, Flavonoide wie Flavone, Flavonole, Isoflavone und ihrer jeweiligen Glykoside, Phenolkonjugate wie aliphatische Alkoholester und Amide, polare Lipide wie Mono- und Diglyzeride und ihre Derivate und Alk(en)ylresorcinole, und Prolamine wie Zein, Avenin, Hordein oder Gliadin.
Zur Feststellung, ob eine Verbindung als an das Gel bindend betrachtet werden kann, und ob es hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Gel aufweist, müssen die folgenden Kriterien erfüllt sein:

a) sie muss löslich sein in oder eine Micelle oder eine stabile Emulsion bilden mit dem Lösungsmittel, mit dem sie auf die Säule geladen ist und mit dem die Säule gewaschen wird, und
b) sie muss im Gel verbleiben nach dem Waschen mit mindestes 1,25 × V_b der Waschlösung, wobei V_b das gepackte Bettvolumen der Säule darstellt, wobei die Waschlösung ein niederer Alkohol in Kombination mit Wasser in einem Verhältnis ist, ausreichend um die Verbindung zurückzuhalten.

Das letztere Kriterium muss erfüllt sein, da poröse Gele der hier beschriebenen Art Ausschlussfähigkeiten in Bezug auf die Molekulargröße zeigen. Diese Effekte werden hierbei jedoch nicht beobachtet oberhalb eines Wertes von etwa 1,25 × V_b und spielen daher in dem Verfahren oder den Praktiken wie hier beschrieben keine Rolle.
Im Wiedergewinnungsschritt ist der Anteil des organischen Lösungsmittels in dem wässrigen organischen Elutionslösungsmittel erhöht, um die hydrophobe Bindung des Extrakts mit dem Gel zu erniedrigen und so den Extrakt zu eluieren. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Extrakt mit dem anfänglichen Waschfluss eluiert werden.
In der vorliegenden Erfindung wird Bezug genommen auf das Ausmaß der relativen hydrophoben Wechselwirkung der spezifischen Verbindungen oder Gruppen und/oder Klassen von Verbindungen mittels Verwendung einer dimensionslosen Konstante, K', die definiert ist als das Verhältnis der Anzahl von mL eines bestimmten Lösungsmittels, um die Verbindungen durch ein Volumen von 1 mL eines Gels, das unter Schwerkraft gepackt wurde, zu bewegen. Da diese dimensionslose Konstante unabhängig von den Säulendimensionen ist (d. h. Länge, Durchmesser usw.), können die hier beschriebenen Konditionen verwendet werden, um die Durchführungen über mehrere Größenordnungen heraufzusetzen.
Wie vorstehend erwähnt ist ein optionaler vierter Schritt der vorliegenden Erfindung die Regenerierung der Säule ohne die Verwendung irgendwelcher ätzender Chemikalien oder die Generierung von übermäßigem Salz oder nicht wiedergewinnbaren Verarbeitungsabfällen. Da Bedingungen für jede Anwendung entwickelt wurden, wobei die Verbindungen von Interesse vollständig aus dem Gel entfernt wurden, kann die Säule in dem Startlösungsmittel regeneriert und reequilibriert werden. Überraschender Weise wurde gefunden, dass ein einfaches Waschen des Gels mit einem geeigneten Lösungsmittel wie 95% Ethanol oder Isopropanol in den meisten Fällen ausreichend ist, um jedes Material zu entfernen, das am Ende einer Verfahrensanwendung an den Gelen haftet. Die Gele werden denn mit dem Startlösungsmittel zur unmittelbaren Wiederverwendung reequilibriert. In diesem Sinne wurde die Regeneration und das Recycling von bis zu mindestens 4.000 × über zehn Jahre ohne erkennbaren Verlust der Wirkung in den hier beschriebenen Verfahren beobachtet. Falls gewünscht können Clean-in- Place/Hygieneverfahren mittels Verwendung verdünnter NaOH nach den Angaben des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech Handbücher, Gebrauchsanweisungen usw.) durchgeführt werden.
Die Reinigung der Verbindung entsprechend der vorliegenden Erfindung kann bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Die Säulenabtrennungen können bei Temperaturen im Bereich von etwa 2°C bis 60°C ausgeführt werden. Temperaturbereiche von etwa 4°C bis 30°C sind gebräuchlicher.
Während diese Erfindung im Detail mit bestimmtem Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben ist, sind die Ausführungsformen nur illustrativen Charakters und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Isolierung von Hafersaponinen aus Hafermehl unter Verwendung hydrophober Wechselwirkungschromatographie auf Octyl Sepharose CL-4B^TM und neuen substituierten hydrophoben Gelen
Zwei verschiedene Saponinarten wurden von Haferkernen isoliert: die avenacosidartigen pentazyklischen Triterpenoidsaponine und die avenacinartigen steroidalen Saponine. Die Strukturen zweier Avenacoside (Avenacosid A und Avenacosid B) wurden aufgeklärt (Tschesche, R., u. a., Chem. Ber., 102, 2072–2082, 1969; Tschesche, R., und Lauven, P., Chem Ber., 104, 3549–3555, 1971), jedoch mindestens zwei andere Avenacoside bleiben uncharakterisiert (Kesselmeier, J., und Strack, D., Z. Naturforsch. 36C, 1072–1074, 1981). Mehrere der avenacinartigen Saponine wurden ebenfalls strukturell identifiziert (Crombie, L., u. a., J. Chem. Soc., Perk. Trans. 1, 1917–1922, 1986).
Im Fall der Avenacoside A und B ist der steroidale Rest mit insgesamt fünf bzw. vier Zuckerresten glykosyliert während die vier Avenacine die gleichen Trisaccharidderivate von vier ähnlichen aber nicht identischen Sapogenolen sind. Das gleichzeitige Vorkommen solcher komplexen Gemische neutraler Saponine erschwert ihre Abtrennung sowohl als Gruppen oder als individuelle Komponenten aus Extrakten, die Zucker und Oligosaccharide ähnlicher Zusammensetzung enthalten. Im nachfolgenden Beispiel wurde ausführlicher Gebrauch von hydrophober Wechselwirkungschromatographie gemacht, um zuerst eine Gruppenabtrennung der Saponine durchzuführen und zweitens die Reinigung spezifischer Komponenten jeder Art der Saponine zu erleichtern.
Zuerst wurde HIC auf Octylsepharose CL-4B^TM in wässrigem 50% Ethanol durchgeführt, um eine Gruppenabtrennung aller Hafersaponine beider Arten unter anderem von polaren und nichtpolaren Nichtsaponinkomponenten durchzuführen. Danach wurden alle Hafersaponine als Gruppe weiter gereinigt durch das Entfernen geladener Komponenten von diesen Saponin enthaltenden Fraktionen mittels Kationenaustauschchromatographie auf SP Sephadex C-25^TM in der hydrogenen Form und doppelte Anionenaustauschchromatographie auf QAE Sephadex A-25^TM in der Azetat- und Hydroxylform wie nachstehend beschrieben. Da die Hafersaponine ungeladen sind, werden sie in keinem der Schritte absorbiert und passieren alle drei Säulenarten zusammen mit den anderen Komponenten. Schließlich wurde HIC sowohl auf Octylsepharose CL-4B^TM als auch SP Sephadex C-25^TM in der Hexadecyltrimethylammonium (HDTMA⁺)-Form verwendet, um die Avenacinsaponine von den Avenacosidsaponinen zu trennen und die einzelnen Mitglieder dieser beiden Gruppen zu reinigen. Erwähnenswert ist, dass während der vorstehend beschriebenen Saponinreinigungsverfahren eine Anzahl Nicht-Saponin-Fraktionen ebenfalls erhalten wurden, die mit anderen Komponenten hoch angereichert waren. Da die hier beschriebenen Verfahren Ethanol und Wasser als die einzigen Lösungsmittel beinhalten und flüchtige Säuren und Basen als die einzigen Reagenzien, präsentieren diese Fraktionen ausgezeichnete Quellen für zusätzliche Nutzung.
Eine Probe von Avena Sativa L. cult. Tibor wurde in der Art gemahlen, dass sie einen 1 mm-Screen passierten konnte und 25 g des erhaltenen Hafermehls wurde unter kräftigem Rühren zu 125 ml (Feststoff/Flüssigkeit = 1 : 5) zurückfließender angesäuerter wässriger 80% Ethanollösung zugefügt (Ethanol : Wasser : Eisessig, 80 : 19 : 1, v : v : v). Das Gemisch wurde für weitere 20 Minuten unter ständigem Rühren unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung auf etwa 4°C wurde das resuspendierte Gemisch zu einer mit Volumenmaßeinheiten versehenen Glassäule überführt, die mit einer Scheibenfritte mit grober Porosität versehenen war, und dem Gemisch wurde erlaubt, sich auf Raumtemperatur (25°C) zu erwärmen und sich aufgrund der Schwerkraft abzusetzen, um ein gepacktes Bett mit bekanntem Volumen (V_b) zu ergeben. Die Säule wurde dann entwässert und mit 2 × V_b frischem angesäuerten wässrigen 80% Ethanol gewaschen und dieses durchflussartige Extraktionsverfahren zweimal wiederholt. Nach dem Entwässern der Säule wurde der extrahierte Rückstand aus der Durchflussextraktionssäule entfernt und bis zu konstantem Gewicht luftgetrocknet und das Gewicht gemessen, um den prozentualen Anteil des extrahierten Hafermehls zu bestimmen. Die Extrakte und Waschlösungen wurden kombiniert und in Vakuum zu einem öligen Sirup mittels Rotationsverdampfung bei 40°C konzentriert. Dies ergab 15% des Gewichts des ursprünglichen Haferschrots. Der ölige Sirup wurde dann in wässrige m 80% Ethanol dispergiert, 5 ml Octylsepharose CL-4B^TM Beads in wässrigem 80% Ethanol zugesetzt und die Mischung zu einem dicken Brei in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C eingedampft. Der Brei wurde dann in wässrigen 50% Ethanol resuspendiert und auf eine graduierte Säule mit 45 ml Octylsepharose CL-4B^TM transfenert, preequil briert und mittels Schwerkraft in wässrigem 50% Ethanollösungsmittel gepackt. Die Säule (Endvolumen V_b 50 ml) wurde darin dreimal mit dem Volumen Vb des gleichen Lösungsmittels gewaschen, um eine Waschfraktion mit K' ≤ 3 zu ergeben, die neben anderem alle Hafersaponine, Zucker, Aminosäuren und Salze enthielt, und eine K' ≤ 3 Fraktion, die weiterhin hydrophob an das Gel gebunden war. Diese K' ≤ 3 Fraktion, enthaltend Karotenoidpigmente, Acylglyceride, polare Lipide, einige der Haferprolamine und freie Sterole sowie andere Verbindungen, wurde wiedergewonnen und das Gel recycelt, indem zuerst 2 × V_b wässriges 95% Ethanol durch die Säule laufen gelassen wurde, um das gebundene Material wiederzugewinnen, und die Säule anschließend mit 2 × V_b des Reequilibrierungslösungsmittels gewaschen wurde.
Die K' ≤ 3 Fraktion wie vorstehend beschrieben hergestellt, wurde zuerst behandelt, um Komponenten wie kationische Prolamine, Peptide, Aminosäuren und anorganische Kationen, mittels Chromatographie auf SP Sephadex c-25^TM in der hydrogenen Form zu entfernen. Entsprechend wurde eine mit Volumenmaßeinheiten versehene Säule, enthaltend 50 ml (= V_b; d. h. 2 m Gel/g extrahierte Hafergrütze) SP Sephadex C-25^TM in der Natriumform (wie vom Hersteller erhalten), in wässrigem 50% Ethanol aufgeschwemmt und in die Hydrogenform umgewandelt, indem die Säule mit einem dreifachen Milliequivalent im Überschuss von 0,1 N HCl in wässrigem 50% Ethanol behandelt und gewaschen wurde, bis der Durchfluss einen pH-Wert vor etwa 6 erreicht hatte. Die K' ≤ 3 Fraktion, wie vorstehend beschrieben und in 5 ml wässrigern 50% Ethanol gelöst, wurde dann auf die Säule geladen und die Säule mit 3 × V_b frischem wässrigem 50% Ethanol gewaschen. Der Waschdurchfluss (d. h. K' ≤ 3 Fraktion) enthaltend unter anderem die Hafersaponine, wurde in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C bis zur Trockenheit verdampft. Diese K' ≤ 3 Fraktion wurde anschließend behandelt, um Komponenten wie anionische Prolamine, Peptide und Aminosäuren, organische Säuren und anorganische Anionen zu entfernen, die alle eine negative Nettoladung bei oder unterhalb von pH 6 aufweisen. Entsprechend wurde eine 50 ml (= V_b; d. h. 2 ml Gel/gm extrahierter Hafergrütze) QAE Sephadex A-25^TM Anionenaustauschsäule in der Chloridform (wie vom Hersteller erhalten) in wässrigem 50% Ethanol aufgeschwemmt und zuerst in die Hydroxylform umgewandelt, indem die Säule mit einem dreifachen Milliequivalent im Überschuss von 0,1 N NaOH in wässrigem 50% Ethanol behandelt und gewaschen wurde, bis der Durchfluss einen pH-Wert von etwa 8 erreicht hatte. Die Säule wurde dann in die Azetatform umgewandelt, indem die Säule mit einem dreifachen milliequivalenten Überschuss von 1% (v : v) Eisessig in wässrigem 50% Ethanol umgewandelt und anschließend wurde die Säule mit wässrigen 50% Ethanol behandelt und gewaschen wurde, bis der Durchfluss einen pH-Wert von etwa 6 erreicht hatten. Die Saponin enthaltende Fraktion in 5 ml wässrigem 50% Ethanol wurde dann auf die Säule geladen und die Säule mit 3 × V_b frischem wässrigem 50% Ethanol gewaschen. Die Waschdurchflüsse (d. h. K' ≤ 3 Fraktion) enthaltend unter anderem die Hafersaponine, wurden in Vakuum mittels Rotationsverdampfung bei 40°C zur Trockenheit verdampft. Um die Flavonoide, Phenole und andere Nicht-Saponine mit einer negativen Nettoladung bei pH ~8 zu entfernen, wurde die Saponinfraktion schließlich durch eine 50 ml (= V_b; d. h. 2 ml Gel/g extrahierter Hafergrütze) QAE Sephadex A-25^TM Anionenaustauschsäule in der Hydroxylform wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die Saponin enthaltende Fraktion in 5 ml wässrigem 50% Ethanol wurde dann auf die Säule geladen und die Säule mit 3 × V_b frischem wässrigem 50% Ethanol gewaschen. Die Waschdurchflüsse (d. h. K' ≤ 3 Fraktion) enthaltend in erster Linie die Hafersaponine, Galactoglyceride, neutrale Aminosäuren und Zucker, wurden in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C eingeengt. Das vorausgehende Fraktionierungsdiagramm ist in 1 zusammengefasst.
Die vorausgehende TLC-Untersuchung dieser K' ≤ 3 Fraktion wie nachstehend beschrieben zeigt das Vorhandensein einer Anzahl verschiedener gefärbter Spots mit dem p-Anisaldehyd nachweisenden Reagenz einschließlich brauner (freier Zucker), grüner (avenacosidartiger Sapogenine), grau-blauer (avenacinartiger Saponine), violetter (Galactosylglyceride) und gelber (Lysophosphatide) Spots.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie auf Octylsepharose CL-4B^TM und SP Sephadex C-25^TM in der Hexadecyltrimethylammonium (HDTMA⁺)-Form wurde ebenfalls verwendet, um Nicht-Saponinbestandteile abzutrennen, um die Avenacinsaponine von den Avenacosidsaponinen abzutrennen, und um einzelne Mitglieder dieser beiden Gruppen voneinander zu isolieren, wobei die folgenden Protokolle verwendet wurden. Zuerst wurden die Nicht-Saponine und kleine Sapogeninmono- und -diglycoside von den Avenacinen und Avenacosiden auf Octylsepharose CL-4B^TM abgetrennt. Die einzelnen Avenacine wurden anschließend durch weitergehende Chromatographie auf Octylsepharose CL-4B^TM abgetrennt und einzelne Mitglieder der polareren Avenacoside auf SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form abgetrennt. Um jedoch einzelne Bestandteile des Hafersaponingemisches zu isolieren und zu identifizieren, wurde eine zusätzliche Haferprobe (100 g) durch Anpassen des vorstehend beschriebenen Verfahrens unter Verwendung der gleichen Säulentypen, Lösungsmittel und Proportionen dem Verfahren unterworfen. Auf diese Art wurden weitere ungefähr 300 mg gefriergetrocknete Saponine in einem einzigen Verfahrensdurchlauf hergestellt.
So wurde ein Aliquot (266,5 mg) gefriergetrocknete Saponine in 10 ml angesäuertem wässrigem 40% Ethanol (d. h. Ethanol : Wasser : Eisessig 40 : 59,9 : 0,1, v : v : v) gelöst. Die Lösung wurde auf eine 100-ml-Säule (= V_b; 2,66 mg Saponin/ml Gel) Octylsepharose CL-4B^TM, aufgetragen, equilibriert und im selben Lösungsmittel unter Ausnutzung der Schwerkraft gepackt. Die Säule wurde mit 2 × V_b frischem angesäuertem wässrigem 40% Ethanol gewaschen, um eine K' ≤ 2 Sub-Fraktion zu ergeben, die bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft wurde. Die Säule wurde dann mit 2 × V_b wässrigem 80% Ethanol eluiert, um absorbierte Komponenten wiederzugewinnen und diese Sub-Fraktion (d. h. K' ≥ 2 Sub-Fraktion) wurde in ähnlicher Weise bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft. TLC-Untersuchungen der K' ≤ 2 Sub-Fraktion ergaben verschiedene blaue fluoreszierende Spots bei langwelligem UV (365 nm), die typisch sind für die Avenacine enthaltend den N-Methylanthraniloylrest, wenigstens 4 grüne Spots, die typisch sind für die Avenacoside, wenn sie mit dem p-Anisaldehydreagenz besprüht werden, und eine große Zone mit hohem R_f-Wert, die unter anderem den Zuckern und neutralen Aminosäuren entspricht. Die K'≥ 2 Sub-Fraktion, untersucht mittels TLC, enthält einen blauen fluoreszierenden Spot an seinem Ursprung bei langwelligem UV-Licht (365 nm), das typisch ist für das Aglycon des N-Methylanthraniloyl enthaltenden Avenacins Sapogenol und sowohl violette als auch gelbliche Spots, die charakteristisch sind für verschiedene Klassen von Lipiden, wenn sie mit p-Anisaldehydreagenz wie vorstehend beschrieben besprüht werden. Daher bewirkt der erste Schritt die Abtrennung sowohl der Avenacin-artigen Saponine als auch der Avenacosid-artigen Saponine, wiedergewonnen in der K' ≤ 2 Sub-Fraktion, von Nicht-Saponinen (d. h. der K' ≥ 2 Sub-Fraktion).
Der nächste Schritt beinhaltet die Abtrennung der Avenacin-artigen Saponine von den Avenacosid-artigen Saponinen und anderen übrig gebliebenen Nicht-Saponinkomponenten unter Ausnutzung des geringeren Anteils der Glykosylierung der Avenacine im Vergleich zu den Avenacosiden und ihres daher größeren hydrophoben Bindungspotentials. Entsprechend wurde die K' ≤ 2 Sub-Fraktion in 10 ml angesäuertem wässrigen 20% Ethanol (d. h. Ethanol : Wasser : Eisessig 20 : 79,9 : 0,1, v : v : v) gelöst und auf eine 100 ml Säule (= V_b) Octylsepharose CL-4B^TM absorbiert, equilibriert und unter Ausnutzung der Schwerkraft in demselbem Lösungsmittel gepackt. Die Säule wurde mit 2 × V_b frischem angesäuertem wässrigem 20% Ethanol gewaschen, um eine K' ≤ 2 Sub-Fraktion zu ergeben, die bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft wurde. Die weiter auf der Säule absorbierten Komponenten wurden dann wiedergewonnen unter Verwendung von 2 × V_b wässrigem 80% Ethanol und diese Sub-Fraktion (d. h. die K' ≥ 2 Sub-Fraktion) wurde in ähnlicher Weise bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft. Die TLC-Untersuchung der zwei Sub-Fraktionen ergab, dass die K' ≤ 2 Sub-Fraktion die Avecanoside und unter anderem freie Zucker und neutrale Aminosäuren enthielt, aber keine nachweisbaren Avenacine, während die K' ≥ 2 Sub-Fraktion die Avenacine (d. h. die „Avenacin-Sub-Fraktion") mit Spuren Avenacosiden mit kleinem R_f-Wert enthielt.
Um schließlich die neutralen Aminosäuren und Zucker von den Avenacosiden zu entfernen, wurde die K' ≤ 2 Sub-Fraktion auf einer unter Ausnutzung der Schwerkraft gepackten 25 ml Säule (= V_b; d. h. 1 ml Gel/g extrahierter Hafergrütze) SP Sephadex C-25^TM in der Hexadecyltrimethylammonium (HDTMA⁺)-Form, wie vorstehend beschrieben hergestellt, einer Chromatographie unterzogen. So wurde die K' ≤ 3 Fraktion in 5 ml wässrigem 25% Ethanol auf der Säule absorbiert und mit 3 × V_b frischem wässrigem 25% Ethanol gewaschen, um eine K' ≤ 3 Sub-Fraktion, die frei von Saponinen war, zu ergeben (TLC). Die auf der Säule absorbierten Saponine wurden dann mit 3 × V_b wässrigem 80% Ethanol wiedergewonnen, bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft und zu einem matt-weißen Pulver gefriergetrocknet (d. h. die „Avenacosid-Sub-Fraktion"; Ausbeute: 77,5 mg; 0,31% auf Trockenbasis). Das Flussdiagramm für die Abtrennung und Wiedergewinnung der zwei Haupthafersaponinarten ist in 2 zusammengefasst.
Dünnschichtchromatographie (TLC)
TLC von Saponinen wurde auf MKC₁₈F Umkehrphasenplatten (1 × 3 Inch, 200 μm Dicke, Whatman International Ltd, Maidstone, UK) unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Methanol : wässrige 5% Essigsäure (75 : 25, v : v) (d. h. Methanol : Wasser : Eisessig 75 : 23,5 : 1,5, v : v : v) durchgeführt. Die Verbindungen wurden durch Ansprühen mit einer 0,5% Lösung (v : v) von p-Anisaldehyd in angesäuertem wässrigem Ethanol (d. h. Ethanol : konzentrierte Schwefelsäure : Wasser : p-Anisaldehyd 90 : 5 : 4,5 : 0,5, v : v : v : v) und Erhitzen bei 100°C für drei Minuten sichtbar gemacht. Dieses Reagenz ergab eine Anzahl bestimmter Farben mit verschiedenen Bestandteilen einschließlich Braun (freie Zucker), flüchtiges Gelb, das sich schnell in Pink, Grün oder Graublau ändert (Saponine), langsam erscheinendes Rot (Aminosäuren, Prolamine), Violett (Galactosylglyceride) und Gelb (Lysophosphatide).
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
HPLC-Analysen von Saponinen wurden durchgeführt unter Verwendung eines „Therm Separation Product" Lösungsmittelzuführungssystems und einer Datensammelsoftware (PC 1000) auf einer C₁₈ CSC Hypersilsäule (250 × 4,6 mm, 120 Å, 5 μm). Ein „Massendetektor" (Evaporative Light Scatter Detektor, ELSD, Alltech Varex MKII), mit einer drift tube Temperatur von 120°C und dem Gasfluss bei 3,06 SLPM wurde verwendet, um alle in der Injektionsprobe vorhandenen Verbindungen nachzuweisen. Das Lösungsmittelsystem bestand aus Acetonitril, Wasser und wässriger 5% Essigsäure wie nachfolgend aufgeführt:
Die Flussrate betrug 1,0 ml/min.
Massenspektrometrie (MS)
Tandemflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrieanalysen (HPLC-MS) von reinen Verbindungen wurde durchgeführt unter Verwendung einer Flüssiginjektion (FIA) ohne Säule. Die mobile Phase bestand aus Methanol : Wasser (70 : 30, v : v). und die Flussrate betrug 100 μl/min. Lösungsmittel wurden mittels einer Hewlett Packard 1100 binären Pumpe zugeführt.
Massenspektrometrieanalysen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Micromass Quattro Spectrometers mit einer verbesserten hexapoligen Quelle, die in einem elektrospraypositiven Modus operierte. Scanning erfolgte in dem Bereich von 200–1500 m/z Einheiten mit einer Kegelspannung von 100 bis 200 Volt.
Die vorstehend hergestellte Avenacin-Sub-Fraktion wurde einer HPLC-ELSD-Analyse unterworfen. Ein typisches HPLC-Profil ist in 3a gezeigt. Diese Sub-Fraktion entsprach den vier Avenacinen von Crombie et al. (Crombie, L., et al., J. Chem. Soc., Perk. Trans. 1, 1917– 1922, 1986). Das „Avenacosid-Sub-Fraktions"-HPLC-ELSD-Profil (3b) enthielt auf der anderen Seite fünf Spitzen mit zwei Hauptspitzen (Spitze 3 und 4). Von diesen hatten Spitze 3 und 4 eine ähnliche Retentionszeit zu den Avenacosiden B bzw. A, wie von Kesselmeier und Strack (Kesselmeier, J., und Strack, D., Z. Naturforsch. 36C, 1072–1074, 1981) mitgeteilt.
Es hat sich gezeigt, dass individuelle Bestandteile sowohl von den Avenacin-artigen Saponinen (d. h. Avenacine A-1, A-2 usw.) als auch den Avenacosid-artigen Saponinen (d. h. Avenacoside A, B, C usw.) ebenfalls durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie durch die wohlüberlegte Auswahl sowohl der Gelart als auch der Waschlösungszusammensetzung abgetrennt werden können. So wurden die Avenacin-artigen Saponine, die relativ nicht-polarer als die Avenacoside sind, fraktioniert und gereinigt auf Octylsepharose CL-4B^TM mittels isokratischem Waschen mit wässrigem 25% und 30% Ethanol. Die Avenacoside enthaltend eine höhere Anzahl von Zuckerresten als die Avenacine wurden auf SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form fraktioniert und gereinigt, da diese Avenacoside nicht vollständig auf Octylsepharose CL-4B^TM zurückgehalten wurden, was sogar zutrifft, wenn das Lösungsmittel Wasser ist.
Zum Beispiel wurde die oben hergestellte „Avenacin-Sub-Fraktion" in 10 ml wässrigem 30% Ethanol aufgenommen und auf eine unter Ausnutzung der Schwerkraft gepackte 30 ml (= V_b) graduierte Säule Octylsepharose CL-4B^TM absorbiert und in dem gleichen Lösungsmittel equilibriert. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen und Fraktionen, die den nachfolgend aufgeführten K'-Werten entsprechen, gesammelt und auf das Vorhandensein von Avenacin mittels TLC und HPLC analysiert. Die Fraktion mit K' von 2,5 bis 5,5 enthielt alle der Hauptavenacine, die in dem HPLC-Profil (Spitze 3, 3a) beobachtet wurden, zusammen mit geringen Mengen der kleinen Avenacine und Spuren von Avenacosidartigen Verbindungen. Weitergehende Chromatographie dieser Fraktion auf der gleichen Säule jedoch unter Verwendung von wässrigen 25% Ethanol ergab die Hauptavenacinspitze in der Fraktion mit K' von 6–8 mit einer Reinheit von > 80% wie durch UV-Spektrometrieanalysen (Diode-Array-Nachweis bei 365 nm) und HPLC-ELSD-Analysen bestimmt. Massenspektralanalyse dieser isolierten Spitze bestätigte die Identität als Avenacin A-1. 4a zeigt ein HPLC-ELSD-Profil der von der HIC-Säule erhaltenen Fraktion, während 4b das Massenspektrum, welches von dieser Spitze erhalten wurde, zeigt, und die Struktur, die dem Avenacin zugeordnet wurde, ist in 4c dargestellt. Auf ähnliche Weise können die verbleibenden Spitzen individuell gereinigt werden einfach durch Abänderung der Ethanol- und Wassermenge in dem isokratischen Lösungsmittel, um entweder die relative hydrophobe Bindung der Komponenten in dem Gemisch zu erniedrigen oder zu erhöhen.
In einem weiteren Beispiel wurde die oben hergestellte „Avenacosid-Sub-Fraktion" in 10 ml wässrigem 32,5% Ethanol aufgenommen und auf einer unter Ausnutzung der Schwerkraft gepackte 30 ml (= Vb) graduierte Säule SP Sephadex C-25^TM in der HTDMA⁺-Form absorbiert und in dem gleichen Lösungsmittel equilibriert. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen und Fraktionen mit K' < 2,5, K' 2,5 bis 5 und K' > 5 gesammelt und auf das Vorhandensein von Avenacosiden mittels TLC und HPLC anaylsiert. Die Fraktion mit K' < 2,5 enthielt hauptsächlich Avenacosidspitzen 2 und 3, K'2,5 bis 5 enthielt Avenacosidspitze 1 und 3 mit geringen Mengen von Spitze 4 und die K' > 5 Fraktion enthielt hauptsächlich Avenacosidspitzen 4 und 5 mit einer kleinen Menge von Spitze 3.
Beispiel 2: Isolierung von Saponinen von aus Quinoamehl unter Verwendung hydrophober Wechselwirkungschromatographie auf Octylsepharose CL-4B^TM und neu substituierten hydrophoben Gelen
Im folgenden Beispiel wurden die Quinoa-Saponine isoliert und als Gesamtgruppe unter Verwendung von HIC hoch gereinigt. Es wurde ebenfalls ausgenutzt, dass keines der Saponine eine kationische Ladung innerhalb des Arbeitsbereichs der Erfindung trägt und daher der Durchfluss des extrahierten Gemisches durch eine Kationenaustauschsäule keines der Saponine aus dem Gemisch entfernt. Eine endgültige Saponin-angereicherte Fraktion, die im Wesentlichen frei von störenden Verbindungen mit ähnlicher Löslichkeit ist, wurde nur mit Ethanol, Wasser und flüchtigen Säuren und Basen hergestellt.
Düngschichtchromatographie (TLC)
TLC wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
HPLC-Analyse wurde durchgeführ unter Verwendung des gleichen Equipments wie in Beispiel 1 beschrieben mit Ausnahme der Verwendung einer C₈ Keystone-Säule 120 Å, 5 μm (250 × 4,6 mm) und eines UV-Dioden-Array-Detektors (Thermo Separation Products, SpectraSYSTEM UV 3000), der bei 270 nm (generelle Absorption der funktionellen Phenolgruppe) überwacht und in Tandem mit dem ELSD-Detektor war verbunden, der wie in Beispiel 1 arbeitete. Das erlaubte den gleichzeitigen Nachweis von Nicht-Saponin-phenolischen Bestandteilen. Das Lösungsmittelsystem bestand aus Acetonitril, H₂O und wässrigem 5% Eisessig (v%):
Die Flussrate betrug 1,0 ml/min.
In dieser Weise wurden Quinoa-Saaten (Cultivar Colorado 407 (0007)) gemahlen, so dass sie ein 20 Meshsieb passieren konnten, um ein Mehl herzustellen. Zu einer erhitzten Lösung (60°C) von 100 ml angesäuertem wässrigem 80% Ethanol (Ethanol : Wasser : Eisessig, 80 : 19 : 1, v : v : v) wurden 25 g des Mehls vorsichtig unter Rühren zugefügt (Feststoffe : Flüssigkeiten = 1/4 v : v). Das gemisch wurde für 30 Minuten gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (2830 × g, 7 Minuten) und der Überstand abgezogen. Das Pellet wurde mit frischem Lösungsmittel (200 ml) gewaschen und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet ein drittes Mal mit frischem Lösungsmittel resuspendiert. Alle Überstände wurden vereint und durch einen grob gesinterten Glasfilter gefiltert. Das dunkelgelbe Filtrat, das einen Extrakt bildet, hatte einen pH-Wert von 7,03 und enthielt 7,3% lösliche Stoffe, wie anhand einer gravimetrischen Analyse einer gefriergetrockneten Sub-Probe bestimmt wurde.
Der Extrakt wurde bis zur Trockenheit in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C verdampft und in 2,5 ml angesäuertem wässrigen 50% Ethanol aufgenommen (Ethanol : Wasser : Eisessig, 50 : 49 : 1, v : v : v). Die wolkige Suspension wurde auf eine skalierte Glassäule Octylsepharose CL-4B^TM (Endvolumen V_b = 25 ml, d. h. 1 ml Gel/g extrahiertem Quinoamehls) geladen, die preequilibriert und unter Ausnutzung der Schwerkraft in angesäuertem wässrigen 40% Ethanol gepackt war (Ethanol : Wasser : Eisessig 40 : 59 : 1, v : v : v). Die Säule wurde anschließend mit 2 × Vb des angesäuerten wässrigen 50% Ethanols gewaschen, um eine K' ≤ 2 Fraktion zu erhalten, die in Vakuum bei 40°C durch Rotationsverdampfung zu einem gelben Sirup eingeengt wurde. TLC-Analyse dieser Fraktion (K' ≤ 2) zeigte, dass sie unter anderem Quinoasaponine, Zucker, Aminosäuren, organische Säuren und Pigmente enthielt. Das auf der Säule verbleibende Material wurde entfernt (und die Säule zur Wiederverwendung regeneriert), indem ein 2 × V_b Volumen des angesäuerten wässrigen 80% Ethanols durchlaufen gelassen wurde, um eine K' ≥ 2 Fraktion zu ergeben. TLC dieser Fraktion zeigte, dass sie den Hauptteil der polaren Lipide und einige der Pigmente, aber keine Spuren von Saponin enthielt. Gravimetrische Analysen zeigten, dass diese K' ≥ 2 Fraktion aus etwa 1,2% des Original Quinoamehls bestand, während die Saponin-angereicherte K' ≤ 2 Fraktion mehr als 6,4% des Mehls repräsentierte.
Die K' ≤ 2 Fraktion wie oben hergestellt wurde in 50 ml wässrigem 50% Ethanol aufgenommen und auf eine graduierte Glassäule XP Sephadex C-25^TM in der Ammonium-Form (endgepacktes Volumen V_b = 25 ml; d. h. 1 ml Gel/g extrahiertem Quinoa) gegeben, preequilibriert und unter Ausnutzung der Schwerkraft in wässrigem 50% Ethanol gepackt. Die Säule wurde anschließend mit 2 × V_b des wässrigen 50% Ethanols gewaschen, um eine K' ≤ 2 Fraktion zu ergeben, die die neutralen und anionischen Komponenten enthielt, und die anschließend in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C zu einem blassgelben Sirup eingeengt wurde. Das kationische Material auf der Säule wurde dann wiedergewonnen durch Passieren von 2 × V_b von 5% ammoniakalischem wässrigen 50% Ethanol (d. h. Ethanol : Wasser : konzentriertem Ammoniumhydroxid 50 : 45 : 5, v : v : v) und durch Konzentrieren dieser K' ≥ 2 Fraktion in Vakuum durch Rotationsverdampfung bei 40°C, um das Lösungsmittel und überschüssiges Ammoniak zu entfernen. Durch gravimetrische Analysen wurde gefunden, dass diese kationische Fraktion etwa 1% des Quinoamehls repräsentierte, während die K' ≤ 2 Fraktion aus mehr als 5,3% bestand.
TLC-Analysen dieser Fraktion zeigten, dass in der K' ≤ 2 Fraktion alle Saponine zusammen mit unter anderem den Zuckern, organischen Säuren und einigen der Aminosäuren, Proteinen und Pigmenten vorhanden waren, während die K' ≥ 2 Fraktion keine Spuren der Saponine zeigte.
Weitere Reinigung der Saponine wurde mittels HIC auf einer 25 ml graduierten Glassäule SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form durchgeführt, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde (endgepacktes Volumen Vb = 25 ml; d. h. 1 ml Gel/gm extrahiertem Quinoa), preequilibriert und unter Ausnutzung der Schwerkraft in wässrigem 20% Ethanol gepackt. Die anionische und neutrale K' ≤ 2 Fraktion wie oben hergestellt wurde in 2,5 ml wässrigem 20% Ethanol aufgenommen, auf die Säule geladen und mit 2 × V_b des wässrigen 20% Ethanols gewaschen, um eine K' ≤ 2 Fraktion zu ergeben. Das noch auf der Säule absorbierte Material wurde dann wiedergewonnen, indem ein 2 × Vb Volumen von wässrigem 80% Ethanol durch die Säule passiert wurde, um eine angereicherte Saponin-Fraktion zu ergeben. Beide Fraktionen wurden dann bis zur Trockenheit in Vakuum bei 40°C mittels Rotationsverdampfung verdampft und durch gravimetrische Analyse, TLC und HPLC analysiert. Die K' ≤ 2 Fraktion repräsentierte etwa 4,75% des Original Quinoamehls und war frei von Saponinen, während die K' ≥ 2 Fraktion etwa 0,59% enthielt und zeigte einen hoch angereicherten Saponin-Gehalt sowohl in HPLC als auch TLC. Das Schema für die Isolierung und Gruppenabtrennung der Quinoa-Saponine ist in 5 zusammengefasst.
HPLC-ELSD mit gleichzeitiger HPLC-UV-Analyse dieser angereicherten Quinoa-Saponin-Fraktion zeigte, dass die Fraktion im Wesentlichen frei von den hauptsächlich beeinflussenden Nicht-Saponin-Bestandteilen war. Repräsentative HPLC-Profile sind in den 6a und 6b gezeigt. Das HPLC-ELSD-Profil (6a) zeigt drei Hauptspitzen bei Retentionszeiten zwischen 21 und 29 Minuten. Bei Vergleich der Y-Achsen mit gleichem Maßstab, zeigte das HPLC-UV-Profil (6b) einige geringe Nicht-Saponin-Spitzen, enthaltend phenolische Funktionen, die bei 270 nm absorbierten, und die zwischen 4 und 8 Minuten eluierten und die ebenfalls in dem ELSD-Profil vorhanden waren. TLC-Analyse zeigte, dass diese Nicht-Saponin-Bestandteile unter anderem phenolische Pigmente, einige Aminosäuren und einige proteinähnliche Materialien enthielten. Die fraktionelle Integration aller ELSD-Spitzen ermöglichte die Bestimmung der ungefähren Reinheit dieser angereicherten Saponin-Fraktion mit größer als 90%.
Unter Berücksichtigung des Elutionsgradienten, der in der HPLC-Analyse verwendet wurde, können die Quinoa-Saponine basierend auf der relativen Hydrophobizität grob in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden, wie in 6c gezeigt. Die relativ gering hydrophoben Quinoa-Saponine der Gruppe 1 eluierten zwischen 14 und 27 Minuten, wobei in diesem Bereich ein Gradient von 15 bis 25% Acetonitril in dem Lösungsmittel angelegt wurde. Diese Gruppe bestand aus mindestens zwölf chromatographisch verschiedenen Saponinen, wobei die Spitzen 5 und 6 die Hauptklomponenten enthielten. Quinoa-Saponine der Gruppe 2 eluierten andererseits nur nach einem schnellen Anstieg des Elutionsgradienten auf 100% Acetonitril und enthielten eine Hauptverbindung in Spitze 13 und mindestens zwei zusätzliche Saponine, was eine Gesamtanzahl von mindestens 15 Saponinen aus diesem bestimmten Cultivar bedeutet.
Als weiteres Beispiel der chromatographischen Reinigungsanwendungen der vorliegenden Erfindung wurden die Quinoa-Saponine einer zusätzlichen Fraktionierung in Gruppe-1-Saponine und Gruppe-2-Saponine unterzogen und die verbleibenden Nicht-Saponin-Komponenten gleichzeitig entfernt. In dieser Anwendung wurde Gebrauch gemacht von den Unterschieden zwischen den zwei Saponin-Gruppen und ihrer relativen hydrophoben Bindung an ein neues substitutiertes hydrophobes Gel. Einige der Nicht-Saponin-Komponenten wurden zuerst durch anionische Austauschchromatographie entfernt.
So wurde die angereicherte Saponin-Fraktion wie oben hergestellt (d. h. K' ≥ 2 in 20% Ethanol auf SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form) unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit verdampft und in wässrigem 50% Ethanol (5 ml) aufgenommen. Die gelbliche Lösung wurde auf eine 25 ml Anionenaustauschsäule QAE Sephadex A-25^TM aufgetragen, die im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, mit Ausnahme dass sie in die Formiatform anstelle der Acetatform umgewandelt und in wässrigem 50% Ethanol preequilibriert wurde (gepacktes Endvolumen V_b = 25 ml; d. h. 1 ml Gel/g extrahiertem Quinoamehl). Die Säule wurde dann mit 2 × V_b wässrigem 50% Ethanol gewaschen, so dass eine K' ≤ 2 Fraktion erhalten wurde, welche in Vakuum bei 40°C durch Rotationsverdampfung zu Trockenheit verdampft wurde. Das Material, welches weiterhin auf der Säule absorbiert war, wurde dann durch Passieren von 3 × V_b angesäuertem wässrigem 50% Ethanol (Ethanol : Wasser : Ameisensäure, 50 : 45 : 5, v : v : v) durch die Säule entfernt, so dass hier eine K' ≥ 2 erhalten wurde, welche ebenfalls in Vakuum bis zur Trockenheit bei 40°C durch Rotationsverdampfung verdampft wurde. Beide Fraktionen wurden anschließend durch TLC und HPLC analysiert. Wie in der Reproduktion der TLC-Platte der K' ≤ 2 Fraktion ersichtlich (7a), enthielt diese Fraktion alle diese Saponine zusammen mit den gelben Pigmenten. In der K' ≥ 2 Fraktion wurden keine Saponine nachgewiesen.
Der nächste Schritt bestand in der Abtrennung der Quinoa-Saponine Gruppe 1 von den Saponien der Gruppe 2 durch HIC auf SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form. Dazu wurde die K' ≤ 2 Fraktion aus dem vorherigen Anionenaustauschschritt in 2,5 ml wässrigem 50% Ethanol aufgenommen und auf eine skalierte Glassäule SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form absorbiert. Die Säule wurde hergestellt und unter Ausnutzung der Schwerkraft wie vorstehend beschrieben gepackt und in wässrigem 50% Ethanol preequilibriert (gepacktes Endvolumen V_b = 25 ml; d. h. 1 ml Gel/g extrahiertem Quinoamehl). Die Säule wurde dann mit 2 × V_b wässrigen 50% Ethanol gewaschen, um eine K' ≤ 2 Fraktion zu erhalten. Das weiterhin auf der Säule absorbierte Material wurde dann durch Passieren von 2 × V_b von wässrigem 80% Ethanol durch die Säule entfernt, so dass eine K' ≥ 2 Fraktion hergestellt wurde. Beide Fraktionen wurden anschließend in Vakuum bei 40°C durch Rotationsverdampfung bis zur Trockenheit verdampft und durch TLC und HPLC analysiert. Wie in der Reproduktion der TLC-Platte der K' ≤ 2 Fraktion (7b) ersichtlich, enthielt diese Fraktion im Wesentlichen nur Quinoa-Saponine der Gruppe 1, wie durch HPLC-ELSD Analyse nachgewiesen, und war frei von Pigmenten. Durch Vergleich der fraktionellen Integration der HPLC-ELSD- und der TLC-Spot-Intensitäten korrespondierte die Hauptzone auf der TLC-Platte mit R_f-Werten zwischen 0,19 und 0,26 ( 7b) mit Spitze 13. Fraktionelle Integration all der ELSD-Spitzen ermöglichte die Bestimmung der ungefähren Reinheit dieser Saponin-Fraktionen mit einem Wert von größer als 99%. Die K' ≥ 2 Fraktion enthielt den Rest der Saponine und die phenolischen Pigmente, die durch eine abschließende Behandlung mit dem gleichen HIC-Gel abgetrennt werden konnten, wobei jedoch ein Lösungsmittel mit einem höheren Wassergehalt verwendet wurde. So wurde die K' ≥ 2 Fraktion, die die Gruppe-2-Saponine und die Pigmente enthielt, in 2,5 ml wässrigem 35% Ethanol aufgenommen und auf der gleichen Säule SP Sephadex C-25^TM in der HDTMA⁺-Form absorbiert. Die Säule wurde in wässrigem 35% Ethanol preequilibriert (gepacktes Endvolumen V_b 25 ml; d. h. 1 ml Gel/g extrahiertem Quinoamehl). Die Säule wurde mit 4 × V_b wässrigem 35% Ethanol gewaschen, um eine K' ≤ 4 Fraktion zu ergeben, die in Vakuum bei 40°C durch Rotationsverdampfung bis zur Trockenheit verdampft wurde, um einen gelblichen Lack zu ergeben. Das weiterhin auf der Säule absorbierte Material wurde anschließend durch Passieren von 2 × V_b wässrigem 60% Ethanol durch die Säule entfernt, um eine K' ≥ 4 Fraktion zu ergeben. Die Rotationsverdampfung dieser Fraktion bis zur Trockenheit in Vakuum bei 40°C ergab ein weißes Pulver. Die TLC- und HPLC-ELSD-Analysen der K' ≤ 4 Fraktion ergab, dass in dieser Fraktion keine Saponine, aber die meisten wenn nicht alle Pigmente enthalten waren.
Andererseits wie in der Reproduktion der TLC-Platte der K' ≥ 4 Fraktion (7c) ersichtlich, enthielt diese Fraktion im Wesentlichen nur die Quinoa-Saponine der Gruppe 2, wie durch HPLC-ELSD-Analyse nachgewiesen, und war frei von Pigmenten. Die Hauptspitzen 5 und 6 erschienen als benachbarte Laufzonen auf der TLC-Platte mit R_f-Werten zwischen 0,40 und 0,48. Die fraktionelle Integration aller ELSD-Spitzen machte es möglich, die ungefähre Reinheit dieser Saponin-Fraktion mit größer als 99% zu bestimmen. Das Schema für die Reinigung und Abtrennung der Quinoa-Gruppe-1- und -2-Saponine ist in 8 zusammengefasst.
Beispiel 3: Vergleichende Nutzung von Ionisch-substituierten gegenüber covalent-substituierten Gele für die Trennung und Reinigung von Saponinen unter Verwendung der hydrophoben Interaktionschromatographie
Makroporöse Chromatographiemedien, die auf einem Polysaccharidgerüst aufbauen und die irgendeinen der verschiedenen covalent verknüpften Alkylliganden mit Kettenlängen von bis zu zwölf Kohlenstoffen enthalten, sind kommerziell erhältlich. Beispiele solcher Produkte enthalten Beispielsweise Butyl Sepharose^TM (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), Aminohexylagarose(C₆) und Dodecylagarose(C₁₂) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Diese Gele haben größtenteils jedoch den Nachteil, dass sie geringe Ligandensubstitutionsraten, typischerweise ≤ 40 μM Ligand/ml Gel, aufweisen, was zu einer relativ geringen hydrophoben Wechselwirkungskapazität für Komponenten mit geringem Molekulargewicht und hohen Kosten führt. Entsprechend der vorliegenden Erfindung können hydrophobe Wechselwirkungschromatographie-Abtrennverfahren wirksam und effizient auf makroporösen, hoch substituierten anionisch oder kationisch geladenen Polysaccharidgelen durchgeführt werden, wobei irgendeines der vielzähligen hydrophoben Gegenionen verwendet wird. Solche Gele können leicht und reversibel zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden und sind unter den meisten physiologischen und biochemischen Arbeitsbedingungen stabil.
Die Praxis der Umkehrphase und hydrophoben Wechselwirkungschromatographie lehrt im Allgemeinen, dass unter identischen Elutionsbedingungen die relative Bindungsaffinität eines spezifischen Substrats an einen hydrophoben Liganden, der auf die stationäre Phase substituiert ist, mit ansteigender Kettenlänge des Liganden ansteigt. Um die Verwendung dieser fertig modifizierten Gele zu zeigen und ihre relativen Bindungseigenschaften zu vergleichen, wurde eine Anzahl von Experimenten unter Verwendung identischer Säulen und Substratbedingungen durchgeführt, wobei die An der Kettenlänge des Liganden des stationären Phasegels und die Zusammensetzung des Wiedergewinnungslösungsmittels (d. h. des wässrigen Ethanols) variiert wurde. Die Gelmatrizen waren wie folgt beschrieben: Butyl Sepharose^TM und Okytl Sepharose CL-4B^TM wie vom Hersteller erhalten, QAE Sephadex A-25^TM in der Dodecylsulfatform, wie nachstehend beschrieben hergestellt, und SP Sephadex C-25^TM in der Hexadecyltrimethylammoniumform, wie nachstehend beschrieben hergestellt. Es muss herausgestellt werden, dass keine dieser Gelmatrizen eine nennenswerte Absorption oder Fluoreszenz bei langwelligem UV-Licht (365 nm) zeigt. Das Substrat war das Saponin Avenacin A-1, hergestellt und gereinigt aus Hafergrütze wie in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Saponin enthielt einen N-Methylanthraniloylrest der stark selbst fluoreszierend in Lösung bei 365 nm ist, was eine Beobachtung seines Laufverhaltens durch die Gelmatrix auf der Säule durch einfaches Beobachten der skalierten Glassäule unter langwelligem UV-Licht erlaubt. Die Säulenbetten betrugen 30 ml, die unter Ausnutzung der Schwerkraft in eine mit Volumenmaßeinheiten versehene Glassäule gepackt wurden, die mit einer Polypropylenscheibenfritte mit mittlerer Porosität versehen war.
Grundsätzlich kann jede der zwei verschiedenen Arten der Ionenaustauscher, anionische oder kationische, die vorzugsweise aus einem ionisch substituierten Polysaccharidgel bestehen, als hydrophiler Kern verwendet werden. An diesen Kern ist ein hydrophober Ligand, der eine starke ionisierbare funktionelle Gruppe mit umgekehrter Ladung zu der des Polysaccharids enthält, mittels Ionenaustausch verbunden, so dass alle oder im Wesentlichen alle der verfügbaren ionischen Stellen in dem Originalpolysaccharid durch den Liganden besetzt sind, um eine modifizierte hydrophobe Phasenkomponente zu bilden. Entsprechend wurde in diesem Beispiel ein QAE Sephadex A-25^TM Anionenaustauschchromatographiegel in der Chloridform (wie vom Hersteller erhalten), enthaltend 0,5 Milliequivalente/ml Austauschkapazität (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) aufgeschwemmt und in wässrigem 50% Ethanol equilibriert und unter Ausnutzung der Schwerkraft in eine volumetrisch kalibrierte Chromatographiesäule gefüllt, um ein Bett mit bekanntem Volumen zu ergeben. Diese Säule wurde zuerst in die Hydroxidform durch Passieren eines Überschusses 0,5 N NaOH in 50% Ethanol durch die Säule und Waschen des Bettes bis zum neutralen pH-Wert mit wässrigem 50% Ethanol umgewandelt. Das Bett wurde anschließend in die Laurylsulfatform durch Passieren eines zweifachen milliequivalenten Überschusses von Natriumdodecylsulfat in wässrigem 50% Ethanol (SDS, Fisher Scientific, Ottawa, ON, CA) und nochmaligem Waschens der Säule mit wässrigem 50% Ethanol, um sämtlichen Überschuss an SDS zu entfernen, umgewandelt. Unter Verwendung eines stark ionisierten (zum Beispiel Sulfat) anionischen Detergenz enthaltend eine lineare aliphatische Komponente von zwölf Kohlenstoffatomen wurden die Chromatographiemedien im Wesentlichen modifiziert, um eine HIC-Säule zu ergeben, die im pH-Bereich von 2,5 bis 11 relativ stabil ist und aufgrund ihrer längeren Alkylkettenlänge eine erhöhte Kapazität für die hydrophobe Wechselwirkung besitzt als handelsübliche Gele (C-12 gegen C-8 für Octyl-Sepharose CL-4B^TM) und einen etwa zehnfach höheren Substitutionsgrad aufweist (zum Beispiel normalerweise 0,5 mmol/ml gegen 50 μmol/ml für Octyl-Sepharose CL-4B^TM), wobei sie nach wie vor die Eigenschaften behält, die für HIC-Anwendungen geeignet sind.
Auf ähnliche Weise wurden modifizierte Chromatographiemedien hergestellt, die geeignet für die HIC sind, wobei ein analoges Verfahren und ein kationischer Ionenaustauscher verwendet wurden. So wurde zum Beispiel SP Sephadex C-25^TM Kationenaustauschchromatographiegel in der Natriumform (wie vom Hersteller erhalten), enthaltend 0,3 Milliequivalente/ml Austauschkapazität (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) aufgeschwemmt und in wässrigem 50% Ethanol equilibriert und unter Ausnützung der Schwerkraft in eine volumetrisch kalibrierte Chromatographiesäule gefüllt, um ein bekanntes Volumen zu ergeben. Die Säule wurde zuerst in die Hydrogenform durch Passieren eines Überschusses von 0,1 N HCl in wässrigem 50% Ethanol durch die Säule und Waschen des Betts bis zum neutralen pH-Wert mit wässrigem 50% Ethanol umgewandelt. Das Bett wurde anschließend in die Hexadecyltrimethylammoniumform durch Passieren eines zweifachen milliequivalenten Überschusses von Hexadecyltrimethylammoniumbromid in wässrigem 50% Ethanol (HDTMA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und Waschen der Säule mit wässrigem 50% Ethanol, um sämtlichen Überschuss an HDTMA zu entfernen, umgewandelt. Das Chromatographiemedium wurde wiederum unter Verwendung eines stark ionisierten (zum Beispiel quartären Amins) kationischen Detergenz enthaltend eine lineare alphatische Verbindung von 16 Kohlenstoffatomen im Wesentlichen modifiziert, um eine HIC-Säule zu ergeben, die im pH-Bereich von 2,0 bis 13 relativ stabil ist und aufgrund der längeren Alkylkettenlänge eine größere Kapazität für die hydrophobe Wechselwirkung besitzt als die handelsübliche Gele (C-16 gegen C-8 für Octyl Sepharose CL-4B^TM) und einen fast zehnfach höheren Substitutionsgrad aufweist (zum Beispiel nominell 0,3 millimol/ml gegen 50 μmol/ml für Octyl Sepharose CL-4B^TM), wobei sie nach wie vor die Eigenschaften behält, die für HIC-Anwendungen geeignet sind.
Der Grad der relativen hydrophoben Wechselwirkung des Substrats wurde von K'-Werten erhalten, wie zuvor durch direkte Messung des Fluoreszenzbandes auf der Säule definiert. K'-Werte wurden sowohl für die Führungs- als auch Schwanzecken der fluoreszierenden Zone aufgezeichnet und diese K'-Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst, wobei SP Sephadex C-25^TM-Säulen in der Alkyltrimethylammoniumform substituiert mit verschiedenen Kettenlängen verwendet wurden.
TABELLE 1 Wirkung der Kettenlängen der hydrophoben Liganden auf die Bindung von Avenacin A-1
Die Ergebnisse sind in 9 und 10 dargestellt. In 9 ist die Wirkung der Ethanolkonzentration auf die K'-Werte von Avenacin A-1 unter Verwendung verschiedener Kettenlängensubstitutionen gezeigt. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Abtrennung am wirksamsten steilen Anstieg des Graphs. In diesem Bereich des Graphs bewirkt eine geringe Änderung der Ethanolkonzentration eine große Änderung des K'-Werts, was eine effektive Trennung zwischen zwei Verbindungen erlaubt, so dass sie voneinander isoliert werden können. Andererseits eluieren zwei Verbindungen am Ende des Graphs, wo der Anstieg der Kurven konvergiert, zusammen von der Säule, da die Veränderung der Ethanolkonzentrationen nicht in einer großen Veränderung der K'-Werte resultiert. 10 ist ein Plot derselben Ergebnisse, der die Herkunft der Ethanolkonzentration und Substrathydrophobizität auf die K'-Werte für Avenacin A-1 als eine Funktion der Kettenlänge zeigt. So können diese Graphen verwendet werden, um die Auswahl der optimalen Ethanolkonzentration und Säulenkettenlänge zur Abtrennung von Verbindungen von, wie in diesem Beispiel beschrieben, Avenacin A-1 zu unterstützen. Dem Durchschnittsfachmann ist ersichtlich, dass ähnliche Serien von Experimenten auf andere zu isolierende Verbindungen von Interesse angewendet werden können, um geeignete Reinigungsstrategien abzuleiten.
Tabelle 2 zeigt einen Vergleich zwischen der Verwendung von einer QAE-Sephadex A-25^TM Dodecylsulfatsäule und einer SP Sephadex C-25^TM Dodecyltrimethylammoniumsäule. Obwohl es Unterschiede in den K'-Werten zwischen den beiden Säulen gibt, ist das Verhältnis zwischen dem K'-Wert und der Ethanolkonzentration das gleiche.
TABELLE 2 Wirkung der Säulentypen auf die Bindung von Avenacin A-1
Alle wissenschaftlichen Veröffentlichungen und Patentdokumente sind als Referenz enthalten.
Die vorliegende Erfindung wurde mit Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Dem Fachmann ist jedoch ersichtlich, dass eine Vielzahl von Variationen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung wie in den nachfolgenden Ansprüchen beschrieben abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines elektrostatisch-verbundenen aliphatisch- oder alizyklisch-substitutierten anionischen oder kationischen Polysaccherid-Gels aus einer makroporösen ionischen polysaccherid-chromatografischen Matrix, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: mittels Ionenaustausch einen hydrophoben Liganden, der eine stark ionisierbare funktionelle Gruppe enthält, die von entgegengesetzter Ladung ist im Vergleich zu der des Polysaccherids, anzulagern, so dass ein wesentlicher Anteil der verfügbaren ionischen Gruppen (Plätze) des Polysaccherids unter Bildung einer Komponente von modifizierter hydrophober Phase durch den Liganden besetzt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kationische Polysaccherid-Gel ein neutrales Polysaccherid aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, dass kovalentverbundene kationisch geladene funktionelle Gruppen aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die kationisch geladenen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der aus tertiären und quartären Aminen bestehenden Gruppe.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Polysaccherid-Gel ein neutrales Polysaccherid aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, dass kovalentverbundene anionisch geladene funktionelle Gruppen aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die anionisch geladenen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der aus Alk(en)ylsulfonaten und Alk(en)ylphosphonaten.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der hydrophobe Ligand ein anionisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)ylsulfonaten und -sulfaten, Alk(en)ylbenzolsulfonaten, Taurocholaten und Taurodesoxycholaten, Alk(en)ylphosphonaten und -phosphaten und Mono- und Dialk(en)ylphosphatedylsäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der hydrophobe Ligand ein kationisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)yltrimmethylammoniumhalogenide und quartäre Alk(en)ylammoniumhalogenide, quartäre Alk(en)ylpyridiniumhalogenide und Alk(en)ylmagnesiumhalogenide bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das kationisch Detergenz Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kationische Polysaccherid-Gel, equilibriert in wässrigem Ethanol, in die Hydroxid-Form umgewandelt wird, indem ein Überschuss an Hydroxid-Ionen-Äquivalenten einer verdünnten Base verwendet wird und anschließend in eine mit einem anionischen Detergenz substituierte Form umgewandelt wird, indem ein Überschuss von Äquivalenten des anionischen Detergenz verwendet wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Polysaccherid-Gel, equilibriert in wässrigem Ethanol, in die Wasserstoff-Form umgewandelt wird, indem ein Überschuss an Wasserstoff-Ionen-Äquivalenten einer verdünnten Säure verwendet wird und anschließend in eine mit einem kationischen Detergenz substituierte Form umgewandelt wird, indem ein Überschuss von Äquivalenten des kationischen Detergenz verwendet wird.
Elektrostatisch-verbundenes aliphatisch oder alizyklisch substituiertes anionisches oder kationisches Polysaccherid-Gel, umfassend einen ionischen hydrophoben Liganden, der elektrostatisch an eine makroporöse ionische Polysaccherid-Gel-Matrix gebunden ist, so dass ein wesentlicher Anteil der verfügbaren ionischen Gruppen (Stellen) der ionischen Polysaccherid-Gel-Matrix durch den Liganden besetzt sind, so dass eine Komponente einer modifizierten hydrophoben Phase gebildet wird, wobei der Ligand eine stark ionisierbare funktionelle Gruppe enthält, die eine Ladung aufweist, die der der ionischen Polysaccherid-Gel-Matrix entgegengesetzt ist.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 14, wobei das kationische Polysaccherid-Gel ein neutrales Polysaccherid der aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, das kovalent verbundene kationisch geladene funktionelle Gruppen enthält.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 15, wobei die kationisch geladenen funktionellen Gruppen aus der aus tertiären Aminen und quartären Aminen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 14, wobei das anionische Polysaccherid-Gel ein neutrales Polysaccherid der aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, das kovalent verbundene anionisch geladene funktionelle Gruppen enthält.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 17, wobei die anionisch geladenen funktionellen Gruppen aus der aus Alk(en)ylsulfonaten und Alk(en)ylphosphonaten bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 16, wobei der hydrophobe Ligand ein anionisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)ylsulfonaten und -sulfaten, Alk(en)ylbenzolsulfonaten, Taurocholaten und Taurodesoxycholoaten, Alk(en)ylphosphonaten und -phosphaten und Mono- und Dialk(en)ylphosphatidylsäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 19, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 19, wobei das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 18, wobei der hydrophobe Ligand ein kationisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)yltrimmethylammoniumhalogenide und quartäre Alk(en)ylammoniumhalogenide, quartäre Alk(en)ylpyridiniumhalogenide und Alk(en)ylmagnesiumhalogenide bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 22, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Polysaccherid-Gel nach Anspruch 23, wobei das kationisch Detergenz Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.
Verfahren zur Isolierung eines nicht-polaren Extraktionsguts, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: das nicht-polare Extraktionsgut in einer wässrig-organischen Lösungsmittel-Lösung mit einer Gel-Matrix in Berührung zu bringen, die ausgewählt ist aus der aus einer elektrostatisch verbundenen aliphatisch- oder alizyklisch-substituierten anionischen oder kationischen Polysaccherid-Gel-Matrix bestehenden Gruppe; die Gel-Matrix mit der wässrig-organischen Lösungsmittel-Lösung zu waschen; die Gel-Matrix mit zusätzlicher wässrig-organischer Lösungsmittellösung zu wachsen, wobei der Anteil des organischen Lösungsmittels in der zusätzlichen Lösung vergrößert wird; und das Extraktionsgut aus einem Ausflussstrom zu gewinnen.
Das Verfahren nach Anspruch 25, weiterhin umfassend, die Gel-Matrix für eine Wiederverwendung zu regenerieren.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die nicht-polaren Extraktionsgüter aus der Pflanze ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Steroiden und Triperenoiden, Flavonoiden, Phenolkonjugaten, polaren Lipiden und Prolaminen besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Steroide und Triperenoide ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Saponinen, Herzglykosiden und Steryl-Konjugaten ausgewählt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Flavonoide ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Flavonen, Flavonolen, Isoflavonen und allen ihren Glykosiden besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die phenolischen Konjukate ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus aliphatischen Alkoholestern und Amiden besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die polaren Lipide ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Mono- und Diglyzeriden und ihren Derivaten und Alk(en)ylresorcinolen besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Prolamine ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Zein, Avenin, Hordein und Gliadin besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die nicht-polaren Extraktionsgüter entweder aus einer synthetischen oder einer natürlichen Quelle stammen.
Das Verfahren nach Anspruch 33, wobei die natürliche Quelle der nicht-polaren Extraktionsgüter ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Pflanzenmaterial, Algen, Pilzen und Einzellern besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Pflanzenmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus landwirtschaftlichen, weinbaulichen, artenbaulichen, aquakulturellen Pflanzen und Pflanzen, die natürlicher Weise auf dem Land und in den Meeren vorkommen, besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 35, wobei das landwirtschaftliche Pflanzenmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Weizen, Hafer, Roggen, Mais, Reis, Quinoa, Amarant, Buchweizen, ??? oder Gerste oder Ölsorten wie Sojabohne, Kanola, Flachssamen, Sonnenblume, Saflor oder Senf; oder Hülsenfrüchten, z. B. Erbsen, Linsen oder Bohnen; oder Viehfutter wie Schwingelgras, Timotheusgras, Klee, Alfalfa oder Weizengras???; oder Kräuter wie Petersilie, Rosmarin, Salbei oder Minze besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die organische Lösungsmittel-Lösung eine Lösung ist, die einen niederen Alkohol, ein Keton oder eine Kombination von diesen enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 37, wobei der niedere Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Keton Aceton ist.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei das kationische Polysaccherid-Gel ein neutrales Polysaccherid aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, das kovalent verbundene kationisch geladene funktionelle Gruppen enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 40, wobei die kationisch geladenen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus tertiären Aminen und quartären Aminen besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei das kationische Polysaccherid-Gel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus DEAE-Sephadex A-25^TM, QAE Sephadex A-25^TM und Q Sepharose^TM besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei das anionische Polysaccharid-Gel ein neutrales Polysaccherid aus der Klasse der Anhydrogalaktane oder Dextrane ist, das kovalent verbundene anionisch geladene funktionelle Gruppen enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei die anionisch geladenen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Alk(en)ylsulfonaten und Alk(en)ylphosphaten besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei das anionische Polysaccherid-Gel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus SP Sephadex C-25^TM und S Sepharose^TM besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei der hydrophobe Ligand ein anionisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)ylsulfonaten und -sulfaten, Alk(en)ylbenzolsulfonaten, Taurocholaten und Taurodesoxycholoaten, Alk(en)ylphosphonaten und -phosphaten und Mono- und Dialk(en)ylphosphatidylsäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 46, wobei das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei der hydrophobe Ligand ein kationisches Detergenz ist, das aus der aus Alk(en)yltrimmethylammoniumhalogenide und quartäre Alk(en)ylammoniumhalogenide, quartäre Alk(en)ylpyridiniumhalogenide und Alk(en)ylmagnesiumhalogenide bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 49, wobei die Alk(en)ylsubstitution von etwa 4 bis etwa 18 Kohlenstoff-Atome enthält.
Das Verfahren nach Anspruch 49, wobei das kationisch Detergenz Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.