DE60320534T2

DE60320534T2 - Verfahren zur qualitätskontrolle einer kräutermedizin

Info

Publication number: DE60320534T2
Application number: DE60320534T
Authority: DE
Inventors: Robert James Ystrad-Meurig Nash; Hadyn St Pierre Farnham PARRY; Alison Ann Ystrad-Meurig Watson
Original assignee: Summit Corp PLC
Current assignee: Phytoquest Ltd
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2023-03-05
Also published as: US20060003029A1; WO2003074147A1; DE60320534D1; EP1671689A1; JP2005519273A; EP1478448B1; AU2003208469A1; GB0205186D0; CA2478168A1; ATE392935T1; EP1478448A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Überwachen der Qualität eines Kräuterheilmittels und Verfahren zur Herstellung eines Kräuterheilmittels.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht derzeit ein großes Interesse an der Verwendung von Kräuterheilmittel und es gibt eine wachsende Akzeptanz von Unternehmen im Bereich der Gesundheitsfürsorge und den Medizinern, dass die holistische Methode von Kräuterheilmittelprodukten einen Wert aufweist und eine etablierte Therapie ergänzen kann.
Die Wiederbelebung des Interesses wurde insbesondere durch die erfolgreiche Verwendung standardisierter Kräuterheilmittelprodukte zur Behandlung chronischer Zustände stimuliert, für die erkannt wurde, dass die herkömmliche Medizin wenig therapeutischen Nutzen bringt. Zum Beispiel werden in Europa standardisierte Valeriana officinalis Extrakte weithin als Beruhigungsmittel verwendet, die als natürliche Alternativen zu Benzodiazepinarzneimittel wirken, während standardisierte Ginkgo bilboba Blätterextrakte häufig in Deutschland verschrieben werden und zum Lindern von zerebraler Ischämie genommen werden. Andere Beispiele von Kräuterheilmittels umfassen Panax ginseng, Allium sativum (Knoblauch), Ginkgo biloba, Hypericum perforatum (St Johns Warze), Echinacea angustifolia und Aloe vera.
Eine Folge dieser Tendenz, die Vorteile der „Kräuter"-Produkte durch die medizinische Etablierung zu umfassen, ist, dass sie zum Nutzen des Verbrauchers wie herkömmliche Arzneimittel demselben Grad der Regulierung unterworfen werden. Somit wird ein dokumentierter Beweis der Wirksamkeit und Sicherheit und der Qualitätskontrolle für die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge in Gehalten der wirksamen Bestandteile unentbehrlich.
Jedoch ist eine Qualitätskontrolle von Kräuterheilmitteln schwierig aufgrund der komplexen Natur von pflanzlichen Materialien und der diesen innewohnenden Uneinheitlichkeit. Die in Kräuterheilmitteln und auf Pflanzen basierenden Heilmitteln verwendeten Materialien sind normalerweise ganze Pflanzen oder Teile oder Extrak te davon. Da Pflanzen- und Pilzmaterialien viele verschiedene chemische Bestandteile enthalten sind diese Materialien komplexe Mischungen. Dies macht eine Standardisierung und eine Kontrolle der Qualität der Materialien sehr schwierig. Außerdem sind viele Kräuterheilmittel Mischungen aus zwei oder mehreren auf Pflanzen basierende Bestandteilen und daher Mischungen von Mischungen, wodurch eine weiteres Niveau in der Komplexität eingeführt wird.
Die wirksamen Bestandteile der meisten Kräuterprodukte bleiben in der Diskussion und es werden häufen unwirksame „Marker" zur Standardisierung verwendet. Derartige Marker können in unwirksamen Produkten vorhanden sein oder in wirksamen Produkten fehlen.
Weiterhin sind die Rezepte und Herstellungsverfahren häufig nicht einheitlich und können nicht offenbart bleiben. Diese Faktoren machen es sehr schwer sicherzustellen, dass zwei Proben eines gegebenen Produkts, die aus verschiedenen Quellen erhalten wurden und scheinbar identisch sind, tatsächlich dieselbe Mischung an Bestandteilen enthalten. Dieses Problem, das zu Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Qualität derartiger Materialien führt, schränkte die Verwendung bestimmter Kräuterheilmittel sogar unter Ärzten für Kräutermedizin ein.
Andere Probleme gehen aus der Tatsache hervor, dass die bei der Ausübung der Kräutermedizin verwendeten Pflanzen häufig örtlich nicht verfügbar sind und daher aus Quellen erhalten werden müssen, die weit entfernt vom Endverbraucher sind. Jedoch kann die Versorgung mit derartigen Pflanzen von entlegenen Orten unberechenbar und ungenau sein, insbesondere weil es keine ausführlichen Monographien, einschließlich Identitäts- und Qualitätsstandards für viele solcher Pflanzen gibt. Die komplexe Mischung an Bestandteilen, die in medizinischen Pflanzen gefunden wird, variiert stark in Art und Konzentration in Abhängigkeit von vielen Faktoren, einschließlich der botanischen Quelle, des Ortes, an dem die Pflanze gezüchtet wird, der Jahreszeit, zu welcher die Pflanze geerntet wird, der Bedingungen, unter denen das Material gelagert und verarbeitet wird, und des verwendeten Extraktionsverfahrens.
Es besteht daher ein Bedarf an empfindlichen Verfahren, die Kräuterprodukte profilieren können und somit eine Standardspezifikation für ein medizinisches Pflanzenmaterial aufstellen können, die mit der therapeutischen Wirksamkeit zusammenhängt, wodurch eine Qualitätskontrolle in der Produktion von Kräuterheilmittel und idealerweise eine quantitative Bestimmung der bekannten und wahrscheinlich wirksamen Bestandteile erlaubt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Überwachen der Qualität eines Kräuterheilmittels bereitgestellt, umfassend die Schritte des:

(a) Bereitstellens einer ersten Probe des Kräuterheilmittels
(b) Extrahierens der Probe mit einem polaren Lösungsmittel zum Herstellen; (i) eines Extrakts polarer Phytochemikalien, ausgewählt unter Pyrrolidin-, Piperidin-, Pyrrolizidin-, Indolizidin-, Tropan- und Nortropanalkaloiden; und (ii) eines nichtpolaren Rückstands;
(c) Charakterisierens des Extrakts der polaren Phytochemikalien.

Das polare Extrakt wird vor der Charakterisierung vorzugsweise fraktioniert. Es kann jedes geeignete Fraktionierungsverfahren verwendet werden, aber in einer bevorzugten Ausführungsform wird das polare Extrakt fraktioniert durch: (a) Ionenaustauschchromatographie unter Bildung eines Extrakts, der an ionischen Verbindungen reich ist, und eines nichtionischen Extrakts; und daraufhin (b) chromatographisches Fraktionieren des angereicherten Extrakts aus Schritt (a), um eine oder mehrere polare Fraktionen, umfassend eine oder mehrere ionische Phytochemikalien, zu ergeben. In derartigen Ausführungsformen umfasst das chromatographische Fraktionieren vorzugsweise Gas-Flüssig-Chromatographie (GC), zum Beispiel GC-MS. Bei Verwendung von GC kann das angereicherte Extrakt vor der Chromatographie derivatisiert werden.
In einer optischen Variante des Verfahrens der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin die Schritte des: (i) auffangenden Durchsuchens des nichtionischen Rückstands nach nichtionischen Spezies durch Unterwerfen des nichtionischen Rück stands einer hydrophoben Wechselwirkung oder Umkehrphasenchromatographie, um einen aufgefangenen nichtionischen Extrakt, der an Zuckern verarmt ist, zu erzeugen; und (ii) Charakterisierens des nichtpolaren Extrakts.
Der aufgefangene Extrakt kann vor der Charakterisierung zum Beispiel durch chromatographische Fraktionierung fraktioniert werden, um eine oder mehrere aufgefangene Fraktionen zu ergeben, die eine oder mehrere nichtionische Phytochemikalien umfasst. Besonders bevorzugt ist die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), zum Beispiel HPLC-MS oder HPLC-UV_vis.
Das Verfahren kann weiterhin optional umfassen: (i) das Extrahieren einer zweiten Probe des Kräuterheilmittels oder das sequentielle Extrahieren des nichtpolaren Rückstands der ersten Probe mit einem nichtpolaren Lösungsmittel unter Bildung eines nichtpolaren Extrakts; und (ii) das Charakterisieren des nichtpolaren Extrakts.
Das nichtpolare Extrakt kann vor der Charakterisierung fraktioniert werden, zum Beispiel durch: (i) Unterwerfen des nichtpolaren Extrakts einer hydrophoben Wechselwirkung oder Umkehrphasenchromatographie, um einen Extrakt zu erzeugen, der an Fetten und Chlorophyll verarmt ist; und (ii) chromatographisches Fraktionieren des verarmten Extrakts, um eine oder mehrere nichtpolare Fraktionen, die eine oder mehrere Phytochemikalien umfassen, zu ergeben. Das chromatographische Fraktionieren kann die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und/oder Gas-Flüssig-Chromatographie (GC), zum Beispiel HPLC-MS/UV_vis und/oder GC-MS umfassen.
Es kann jede geeignete Form der Charakterisierung der polaren und/oder nichtpolaren Extrakte verwendet werden, einschließlich keiner Beschränkung der funktionellen und/oder physikalischen und/oder chemischen Charakterisierung.
Werden die Extrakte funktional charakterisiert kann die Charakterisierung einen biologischen Assay, ausgewählt zum Beispiel unter in vivo- oder in vitro-Assays, Enzymhemmungsassays (zum Beispiel Glykosidase- und/oder Lipasehemmung), Rezeptorbindungsassays, Zellassays (zum Beispiel Zellreplikations-, Zellkrankheitserreger-, Zell-Zell-Wechselwirkungs- und Zellabsonderungsassays), Immunassays, Assays bezüglich antimikrobieller Aktivität, (zum Beispiel Bakterien- und Viruszellbindungs- und/oder replikationsassays), Toxizitätsassays (zum Beispiel LD₅₀-Assays) oder jede Kombination davon umfassen.
Werden die Extrakte physikalisch charakterisiert, kann die Charakterisierung ausgewählt werden unter: (a) der Quantifizierung der phytochemischen Komponente(n); und/oder (b) dem Messen der Reinheit der Bestandteile; und/oder (c) dem Bestimmen des Molekulargewichts (oder der Molekulargewichtsverteilung oder verschiedener statistischer Funktionen derselben im Falle von Fraktionen, die eine Vielzahl verschiedener phytochemischer Bestandteile umfassen; und/oder (d) dem Bestimmen der molekularen Formel(n) (zum Beispiel durch Kernmagnetresonanz); und/oder (e) Spektralanalyse.
Eine Spektralanalyse ist besonders bevorzugt und kann jedes oder alle der folgenden Spektren erzeugen:

(a) Massenspektren (zum Beispiel der Wert von Masse zu Ladung (m/z) gegen Häufigkeit) und/oder
(b) chromatographische Daten (zum Beispiel Spektren, Säulenretentionszeiten, Elutionsprofile usw.), und/oder
(c) Photodiodenarray-(PDA) Spektren (zum Beispiel in sowohl UV- als auch sichtbaren Bereichen), und/oder
(d) Kernmagnetresonanz-(NMR) Spektren (zum Beispiel spektrale Datensätze, die über ¹H und/oder ¹³C NMR erhalten wurden).

Bei erfindungsgemäßer Verwendung kann die Spektralanalyse mit der Fraktionierung des Extrakts, zum Beispiel durch Verwendung von GC-MS und/oder HPLC-PDA-MS gekoppelt werden.
Werden die Extrakte chemisch charakterisiert, kann die Charakterisierung unter Messungen der chemischen Reaktivität des phytochemischen Bestandteils bzw. der phytochemischen Bestandteile, der Beständigkeit und des Schmelzpunkts des phytochemischen Bestandteils bzw. der phytochemischen Bestandteile oder jeder Kombination davon ausgewählt werden.
Bei erfindungsgemäßer Verwendung kann die Fraktionierung des Extrakts unter Bedingungen ausgeführt werden, die eine definierte Fraktion oder eine isolierte (zum Beispiel im Wesentlichen reine) Phytochemikalie ergeben.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ergibt die Charakterisierung ein phytochemisches Profil, das analysiert werden kann, (a) um zu bestimmen, ob ein oder mehrere bioaktive Wirkstoff(e) in der bzw. den Proben vorliegen; und/oder (b) um zu bestimmen, ob ein oder mehrere bioaktive Marker in der bzw. den Proben vorliegen; und/oder (c) um zu bestimmen, ob es einer Standardspezifikation entspricht.
Die Erfindung kann in einem Verfahren zur Identifizierung eines bioaktiven Wirkstoffs in einem Kräutermedikament angewandt werden. Die Probe ist in diesem Fall vorzugsweise eine Blutprobe, die durch Verabreichen einer Probe des Kräuterheilmittels an eine Person und anschließendem Extrahieren einer Blutprobe von der Person erhalten wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Kräuterheilmittels bereit, umfassend den Schritt des Überwachens der Qualität des Kräuterheilmittels gemäß den Verfahren der Erfindung, wie vorstehend beschrieben ist.
Die Qualitätskontrolle der Alkaloide umfassenden Kräuterheilmittel ist zum Beispiel aus der russischen Patentbeschreibung SU 1108354 bekannt, jedoch betrifft dieses Dokument nur die Bestimmung von Glaucin durch Zugabe eines Markers, das Papaverin, und betrifft nicht die spezifischen Alkaloide der vorliegenden Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Die folgenden Begriffe sollen, wenn sie hierin verwendet werden, die folgenden Bedeutungen zusätzlich zu jeglichen weiter (oder enger) gefassten Bedeutungen, die die Begriffe in dem Fachgebiet aufweisen können, haben, sofern nicht anders spezifisch darauf hingewiesen wird:
Der Begriff Pflanze wird hierin in einem weiten Sinne verwendet, so dass er nicht nur Pflanzen sensu stricto sondern auch Pilze und Bakterien umfasst.
Der Begriff phytochemisch wird hierin in einem weiten Sinne verwendet, so dass er jeden chemischen Bestandteil einer Pflanze, einschließlich Makromolekülen und kleinen Molekülen umfasst. Wichtige Beispiele umfassen Alkaloide (zum Beispiel Pyrrolidine, Piperidine, Pyrrolizidin, Indolizidine, Tropane und Nortropane), Kohlenwasserstoffanaloga, Phenolverbindungen, Terpenoide, Enzymhemmstoffe, Glycoside, Nukleotide, Aminosäuren, Lipide und Zucker. Die Phytochemikalien können unter anderem als Arzneimittel, Agrochemikalien, Template für die kombinatorische Chemie, Antioxidantien, Marker botanischen Ursprungs oder Qualität, Tiergifte, Pestizide, Kosmetika und Nahrungszusatzstoffe wirken.
Der Begriff Kräuterheilmittel wird hierin zum Definieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, in der wenigstens ein aktiver Wirkstoff nicht chemisch synthetisiert ist und ein phytochemischer Bestandteil einer Pflanze ist. In den meisten Fällen ist dieser nicht synthetischer aktiver Wirkstoff nicht gereinigt, aber zusammen mit anderen Phytochemikalien vorhanden, mit denen er in der Ausgangspflanze assoziiert ist. In manchen Fällen kann jedoch der von der Pflanze stammende bioaktive Wirkstoff bzw. die von der Pflanze stammenden bioaktiven Wirkstoffe in einer konzentrierten Fraktion oder isoliert (manchmal in hohen Reinheitsgraden) vorliegen. In vielen Fällen umfasst jedoch das Kräuterheilmittel ein mehr oder weniger rohes Extrakt, Aufguss oder Fraktion einer Pflanze oder sogar eine nicht verarbeitete ganze Pflanze (oder Teil davon), obwohl in solchen Fällen die Pflanze (oder der Pflanzenteil) normalerweise wenigstens getrocknet und/oder gemahlen ist.
Der Begriff bioaktiver Wirkstoff wird hierein zum Definieren einer Phytochemikalie verwendet, die für die pharmazeutische Wirksamkeit des Kräutermedikaments, das diese umfasst, notwendig oder ausreichend ist.
Der Begriff charakteristisch, wie er hierin verwendet wird, soll Daten definieren, die einen oder mehrere Aspekte eines phytochemischen Bestandteils eines Kräuterheilmittels, wie zum Beispiel seine spektralen Eigenschaften, Konzentration, chemische Struktur oder funktionale Eigenschaften charakterisieren.
Der Begriff phytochemisches Profil wird hierein verwendet, um einen Satz von Charakteristika zu definieren, die verschiedene phytochemische Bestandteile betreffen. Ein derartiger Satz von Eigenschaften oder Merkmalen kann ebenfalls als chemischer Fingerabdruck bezeichnet werden. Die Eigenschaften können irgendeine oder alle der hierin diskutierten Eigenschaften umfassen (siehe zum Beispiel den Abschnitt mit dem Titel „Charakterisierung einer Fraktion"), und umfassen typischerweise spektrale Daten, wie zum Beispiel Massenspektren und/oder PDA-Spektren.
Das phytochemische Profil kann aus der Analyse einer einzelnen Pflanzenspezies zum Nachweis des Vorhandenseins eines definierten Satzes von Chemikalien abgeleitet werden. Derartige Profilierungstechniken können ebenfalls auf Pflanzenextrakte (und Fraktionen davon) angewandt werden, wobei in diesem Falle das Profil spektrale Daten umfassen kann, die eine Sammlung phytochemischer Bestandteile (typischerweise mehr als 5, vorzugsweise mehr als 10, häufig mehr als 20) betreffen. Pflanzenextrakte und Fraktionen, die auf diese Weise profiliert worden sind, werden hierein als definierte Extrakte beziehungsweise definierte Fraktionen bezeichnet.
Der Begriff bioaktiver Marker wird hierin zum Definieren eines charakteristischen Merkmals (oder eines phytochemischen Profils) verwendet, das mit einem annehmbaren Grad an pharmazeutischer Aktivität korreliert ist.
Der Begriff Standardspezifikation wird hierein zum Definieren eines charakteristischen Merkmals oder eines phytochemischen Profils verwendet, das mit einer annehmbaren Qualität des Kräuterheilmittels korreliert ist. In diesem Zusammenhang wird der Begriff Qualität zum Definieren der gesamten Fähigkeit des Kräutermedikaments für seine beabsichtigte Verwendung verwendet und kann zum Beispiel das Vorhandensein von einem oder mehreren bioaktiven Wirkstoffen (bei einer geeigneten Konzentration), das Vorhandensein von einem oder mehreren bioaktiven Markern, ein phytochemisches Profil, das auf die Verwendung einer speziellen Quelle hinweist, Reinheit und ein annehmbarer oder nicht annehmbarer Grad der Verunreinigung mit unerwünschten Ergänzungsstoffen und/oder Verunreinigungen umfassen.
Der Begriff isoliert wird hierein verwendet, um darauf hinzuweisen, dass das isolierte Material (zum Beispiel die Phytochemikalie) in einem physikalischen Milieu vorkommt, das von demjenigen verschieden ist, in dem sie in der Natur vorkommt. Das isolierte Material kann zum Beispiel in Bezug auf das komplexe Zellmilieu, in dem es natürlich vorkommt, insbesondere im Zusammenhang mit der Sammlung von Veröffentlichungen der Erfindung, im wesentlichen isoliert (zum Beispiel gereinigt) sein.
Wird gereinigtes Material der Erfindung hierin beschrieben, ist der absolute Reinheitsgehalt nicht entscheidend und der Fachmann kann ohne weiteres geeignete Reinheitsgehalte gemäß der Verwendung bestimmen, der das Material zugeführt werden soll. Jedoch sind Reinheitsgehalte von 90% w/w, 99% w/w oder höher bevorzugt.
Unter manchen Umständen bildet die isolierte Phytochemikalie einen Teil einer Zusammensetzung (zum Beispiel ein mehr oder weniger rohes Extrakt, das viele andere Substanzen enthält) oder eines Puffersystems, das zum Beispiel andere Bestandteile enthalten kann. Unter anderen Umständen kann die isolierte Phytochemikalie im Wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt werden, wie zum Beispiel spektrophotometrisch, durch NMR oder durch Säulenchromatographie (zum Beispiel HPLC) nachgewiesen wird.
Der Begriff Index der biologischen Aktivität, wie er hierein verwendet wird, soll ein charakteristisches Merkmal oder Eigenschaft, die mit einer biologischen Aktivität korreliert ist, definieren. Zum Beispiel kann eine spezielle Konstellation reaktiver Gruppen auf einer Phytochemikalie als Toxizitätsmarker verwendet werden, während die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit einem speziellen Rezeptor in vitro ein Index der pharmazeutischen Aktivität sein kann.
Die Begriffe polar und nicht polar, wie sie hierein verwendet werden, werden als relative Begriffe für Lösungsmittel verwendet, um den Grad anzuzeigen, in welchem sie ein elektrisches Dipolmoment aufweisen und somit Hydrophilie (polar) oder Hydro phobie (nicht polar) zeigen. Sie werden zum Extrahieren polarer beziehungsweise nicht polarer Phytochemikalien verwendet.
Medikamentproben
Die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Medikamentproben können getrocknetes Pflanzenmaterial, nicht behandelte Aliquoten des Kräuterheilmittels in der Form sein, in der es verabreicht oder zum Verkauf angeboten wird. Alternativ dazu können die Proben vor der Charakterisierung auf irgendeine einer großen Vielfalt von Arten vorverarbeitet sein. Eine Vorverarbeitung kann mit einer physikalischen oder chemischen Vorverarbeitung verbunden sein, zum Beispiel mit einer Pulverisierung, Mahlen, Gefrieren, Eindampfung, Filtration, Pressen, Sprühtrocknung, Extrusion, superkritischen Lösungsmittelextraktion und Tinkturproduktion.
In den Fällen, in denen das Kräuterheilmittel in Form einer ganzen Pflanze (oder eines Teils davon) verabreicht oder verkauft wird, kann das Pflanzenmaterial vor Verwendung getrocknet sein. Jede praktische Form des Trocknens, einschließlich des Gefriertrocknens oder Lufttrocknens, kann verwendet werden.
Lösungsmittelextraktionen
Geeignete polare Lösungsmittel zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung umfassen ohne Beschränkung organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel organische Alkohole. Bevorzugt sind Ethanol und Methanol, sowie auch Ethanol/Wasser- oder Methanol/Wasser-Mischungen.
Das polare Lösungsmittel wird vorzugsweise unter 51 bis 80% Ethanol/Wasser, 31 bis 50% Ethanol/Wasser und bis zu 30% Ethanol/Wasser ausgewählt. Besonders bevorzugt ist ein polares Lösungsmittel, das näherungsweise 50% Ethanol/Wasser ist.
Geeignete nicht polare Lösungsmittels zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung umfassen ohne Beschränkung organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel He xan und Dichlormethan (DCM) oder Chloroform. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan.
Die Bedingungen (Zeit, Temperatur, Grad der Rührbewegung usw.), unter denen die Extraktion(en) durchgeführt wird, können ohne weiteres empirisch bestimmt werden und variieren gemäß der Art der Probe, der Art jeglicher Vorverarbeitung und des ausgewählten Lösungssystems.
Chromatographische Fraktionierung des angereichten Extrakts
Die chromatographische Fraktionierung kann die Gas-Flüssig-Chromatographie umfassen. Die Gas-Flüssig-Chromatographie ist ein Verfahren, bei dem eine komplexe Mischung flüchtiger Substanzen in ihre Bestandteile durch Aufteilen der Probe zwischen einem inerten Gas unter Druck und einer dünnen Schicht einer auf einem inerten Träger aufgetragenen nicht flüchtigen Flüssigkeit innerhalb einer erhitzten Säule getrennt wird. Zum Erreichen einer guten Trennung spezifischer Verbindungen in einer Mischung ist es entscheidend, eine Säule mit den richtigen charakteristischen Merkmalen zu verwenden. Die Art des festen Trägers, Art und Menge der flüssigen Phase, das Verfahren des Packens, die gesamte Länge und Säulentemperatur sind wichtige Faktoren.
Der Fachmann wird durch routinemäßiges Ausprobieren und unter Verwendung von gewöhnlichem Allgemeinwissen ohne weiteres in der Lage sein, die geeigneten Säulencharakteristika gemäß den Umständen, einschließlich des Extrakts, das untersucht wird, und der Art des in der Extraktion verwendeten Lösungsmittels, zu bestimmen. Besonders bevorzugt und in vielen Fällen nützlich sind Kapillarsäuren, die mit einer nicht polaren flüssigen Phase beschichtet sind (25 m × 0,22 mm id × 0,25 μm BPX stationäre Phase, hergestellt von SGE Ltd., oder dazu gleichwertige).
Viele Verbindungen sind aufgrund ihrer hohen Polarität, niedrigen Flüchtigkeit oder thermischen Instabilität zur direkten Einspritzung in einen Gaschromatographen ungeeignet. Verbindungen, die hoch hydroxyliert sind, sind aufgrund der intermolekularen Wasserstoffbindung schwierig zu verdampfen. Jedoch können sie durch Erset zen der Hydroxylwasserstoffatome durch andere chemische Gruppen für die GC-Analyse ausreichend flüchtig gemacht werden.
Die zwei beliebtesten Mittel zur Derivatisierung von Hydroxylgruppen sind die Acetylierung und Silylierung, wobei Acetylate [CH₃CO-O-R] oder Silylether, zum Beispiel Trimethylsilyl(TMS)-Ether [(CH₃)₃Si-O-R] gebildet werden.
Somit werden in Ausführungsformen, in denen das angereicherte Extrakt auf einer analytischen Skala chromatographisch fraktioniert wird, die phytochemischen Bestandteile des angereicherten Extrakts zum Beispiel durch Acylierung oder Silylierung vorzugsweise derivatisiert. Besonders bevorzugt ist die Trimethylsilyl(TMS)-Derivatisierung.
Die chromatographische Fraktionierung kann ebenfalls die Ionenaustauschchromatographie umfassen. Die Ionenaustauschchromatographie reinigt teilweise ionische Spezies, um sie zu konzentrieren und verunreinigende Substanzen zu entfernen. Der Fachmann wird durch routinemäßiges Ausprobieren und unter Verwendung von gewöhnlichem Allgemeinwissen ohne weiteres in der Lage sein, geeignete Packungsmaterialien und eine mobile Phase bzw. mobile Phasen für Säulen zu identifizieren, die unter anderem von den zu fraktionierenden Mengen, den Extrakten, die untersucht werden, und der Art des in der Extraktion verwendeten Lösungsmittels abhängen.
Besonders bevorzugt in den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind stark saure Kationenaustauschharze, die entweder in der Form der freien Säure oder Wasserstoff (H⁺)-Form oder in Form des Ammoniumsalzes (NH₄ ⁺)-Form verwendet werden können. Diese Formen absorbieren Kationen aus der Lösung und setzen in die Lösung zurück eine gleiche Anzahl von Gegenionen frei (entweder H⁺- oder NH₄ ⁺-Ionen in Abhängigkeit von der verwendeten Form).
Bei Verwendung auf einer präparativen Skala kann ebenfalls die Anionenaustauschchromatographie und/oder Adsorptionschromatographie verwendet werden.
Chromatographische Fraktionierung des aufgefangenen Extrakts
Das optionale Auffangverfahren der Erfindung erzeugt einen aufgefangenen an Zuckern verarmten nichtionischen Extrakt, der chromatographisch fraktioniert wird, um eine oder mehrere aufgefangene Fraktionen, umfassend eine oder mehrere nichtionische Phytochemikalien, zu ergeben.
Die chromatographische Fraktionierung umfasst vorzugsweise die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). Mit dieser Technik werden Proben in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und auf einer Säule unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung, die unter Druck durch die Säule gepumpt wird, getrennt. Der Fachmann wird durch routinemäßiges Ausprobieren und unter Verwendung von gewöhnlichem Allgemeinwissen ohne weiteres in der Lage sein, geeignete Packungsmaterialien für Säulen, Pumpdrucke, Durchflussraten und eine mobile Phase bzw. mobile Phasen zu identifizieren, die unter anderem von den zu fraktionierenden Mengen, dem Pflanzenmaterial, das untersucht wird, und der Art des in der Extraktion verwendeten Lösungsmittel abhängen werden.
Die chromatographische Fraktionierung auf einer präparativen Skala umfasst vorzugsweise die Flash-Fraktionierung (zum Beispiel die Normalphasen-Flash-Fraktionierung) in Verbindung mit (zum Beispiel gefolgt von der) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) (zum Beispiel Umkehrphasen-HPLC). Die Flash-Fraktionierung ist eine Form der präparativen Säulenchromatographie, die mit der Anwendung von Druck zum Beschleunigen des Lösungsmitteldurchflusses verbunden ist, und sie kann mit einer breiten Vielfalt an Trägern ausgeführt werden Die Fraktionierung kann ebenfalls die Glas-Flüssig-Chromatographie umfassen (wie vorstehend in dem die Fraktionierung des angereicherten Extrakts betreffenden Abschnitt beschrieben ist).
Chromatographische Fraktionierung des verarmten Extrakts
Die optionale nicht polare Fraktionierung der Erfindung umfasst das Unterwerfen eines nicht polaren Extrakts einer hydrophoben Wechselwirkung oder Umkehrphasen chromatographie zur Erzeugung eines an Fetten und Chlorophyll verarmten Extrakts und das chromatographische Fraktionieren des verarmten Extrakts, um eine oder mehrere nicht polare Fraktionen zu ergeben, die eine oder mehrere nicht polare Phytochemikalien umfassen.
Die Analyse des verarmten Extrakts umfasst vorzugsweise die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), obwohl die Gas-Flüssig-Chromatographie ebenfalls als eine Alternative dazu oder in Verbindung mit der HPLC verwendet werden kann.
Physikalischer Zustand der Fraktionen
Der physikalische Zustand der polaren Fraktion (und optional der aufgefangenen und/oder nicht polaren Fraktionen) hängt von den zu ihrer Herstellung verwendeten Fraktionierungstechniken ab und wird in Abhängigkeit von der Anwendung variieren.
In bestimmten Ausführungsformen ist eine isolierte Phytochemikalie im Wesentlichen die einzige Phytochemikalie in einer beliebigen gegebenen Fraktion. Jedoch enthalten in manchen Fällen die isolierten Fraktionen eine Vielzahl verschiedener Phytochemikalien, zum Beispiel weniger als ungefähr 100, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 aber besonders bevorzugt nicht mehr als ungefähr 5 verschiedene Phytochemikalien.
Besonders bevorzugt sind Fraktionen, die isolierte oder gereinigte Phytochemikalien, zum Beispiel gereinigt auf eine Reinheit von ungefähr 90% (zum Beispiel bis über 90% oder bis über 99% Reinheit) enthalten.
Charakterisierung der Fraktion
Die Form, die die Charakterisierung annimmt, hängt von der Art des zu untersuchenden Medikaments und den verwendeten Charakterisierungstechniken ab.
Im Allgemeinen kann jede oder alle der folgenden Methoden verwendet werden:
(a) Funktionelle Charakterisierung
Die funktionelle Charakterisierung kann einen biologischen Assay umfassen. Biologische Assays können in vivo oder in vitro ausgeführt werden und können Enzymhemmungsassays (zum Beispiel Glykosidase- und/oder Lipasehemmung) umfassen. Andere biologische Assays umfassen Rezeptorbindungsassays, Zellassays (einschließlich Zellreplikations-, Zellkrankheitserreger- und Zell-Zell-Wechselwirkungs- und Zellabsonderungsassays), Immunassays, Assays bezüglich antimikrobieller Aktivität (zum Beispiel Bakterien- und Viruszellbindungs- und/oder -replikationsassays und Toxizitätsassays (zum Beispiel LD₅₀-Assays).
Eine funktionelle Charakterisierung kann ebenfalls indirekt durch eine Form der Charakterisierung ausgeführt werden, die die Identifikation einer oder mehrerer Indices biologischer Aktivität erlaubt.
(b) Physikalische Charakterisierung
Diese kann die Form einer Quantifizierung der phytochemischen Komponente(n), die in einer beliebigen gegebenen Fraktion oder in einem beliebigen anderen Stadium des Verfahrens vorhanden ist (sind), einem Messen der Reinheit der Bestandteile, eines Bestimmen des Molekulargewichts (oder der Molekulargewichtsverteilung oder verschiedener statistischer Funktionen derselben im Falle von Fraktionen, die eine Vielzahl verschiedener phytochemischer Bestandteile umfassen), eines Bestimmens der molekularen Formel(n) (zum Beispiel durch Kernmagnetresonanz) und verschiedener Spektralanalysen annehmen.
Besonders nützliche spektrale Charakteristika umfassen:

• Massenspektren (zum Beispiel die Werte von Masse zu Ladung (m/z) gegen Häufigkeit), und/oder
• Chromatographische Daten (zum Beispiel Spektren, Säulenretentionszeiten, Elutionsprofile usw.), und/oder
• Photodiodenarray(PDA)-Spektren (zum Beispiel in sowohl UV- als auch sichtbaren Bereichen), und/oder
• Kernmagnetresonanz(NMR)-Spektren (einschließlich spektraler Datensätze, die über ¹H und/oder ¹³C NMR erhalten werden).

Die spektrale Charakterisierung kann mit dem Fraktionierungsschritt gekoppelt sein. Zum Beispiel kann GC-MS und HPLC-PDA-MS verwendet werden (wie hierin beschrieben ist), um die Fraktionierung mit dem Erhalten der Massenspektren-, UV-sichtbaren Spektral- und chromatographischen Spektraldaten zu koppeln.
Ein beliebiges oder alle der vorstehenden charakteristischen Merkmale können zum Definieren eines „chemischen Fingerabdrucks" für eine gegebene Probe (oder eine beliebige Fraktion eines phytochemischen Bestandteils davon) verwendet werden.
(c) Chemische Charakterisierung
Diese kann die Form von Messungen von unter anderem der chemischen Reaktivität des phytochemischen Bestandteils bzw. der phytochemischen Bestandteile, ihrer Löslichkeit, Stabilität und des Schmelzpunkts annehmen.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben. Diese dienen nur erläuternden Zwecken und beabsichtigen nicht auf irgendeine Weise den Rahmen des beanspruchten Monopols oder der beschriebenen Erfindung zu beschränken.
Erläuterung durch Beispiele
Binden ionischer Spezies
10 g getrocknetes Pflanzenmaterial wird in einen konischen 250 ml Kolben gegeben und dann wird genug 50% Ethanol/Wasser zugegeben, um das Pflanzenmaterial zu durchtränken, wobei zusätzlich darauf 2 cm Lösungsmittel gestattet sind. Dies wird zum Extrahieren während 15 Stunden über Nacht stehen gelassen.
Das Extrakt wird unter Verwendung eines Büchner-Trichters filtriert. Das Pflanzenmaterial wird entweder verworfen oder für eine sequentielle Extraktion mit Dichlormethan (DCM) aufbewahrt. Für den DCM-Schritt wird vorzugsweise frisches Material verwendet, wenn es jedoch nicht ausreichend verfügbar ist, kann eine sequentielle Extraktion durchgeführt werden oder es kann zur weiteren Charakterisierung der Bestandteile verwendet werden.
Dowex 50 Harz (50–100 mesh) wird durch Zugeben von 2N HCl im Überschuss und Durchtränken während minimal 15 Minuten hergestellt. Dann wird das Harz mit entionisiertem Wasser im Überschuss auf einen pH-Wert von 7 gewaschen. Das hergestellte Harz wird in 10 × 1 cm Säulen geschüttet und Vorratsgefäße werden angebracht. Die Säulen werden mit 25 ml 50% wässrigem Ethanol zum Äquilibrieren des Harzes mit demselben Lösungsmittel gewaschen, wie es zur Herstellung der Pflanzenproben verwendet wird.
Für jede Säule wird das Vorratsgefäß mit dem Extrakt gefüllt, das man langsam durch das Harz hindurch laufen lässt.
Fraktionen von näherungsweise 30 ml der ungebundenen Probe werden in einem großen Glasfläschchen gesammelt, beschriftet und für das HP-20 Auffangen aufbewahrt. Der pH-Wert des Eluents wird überwacht, wobei er ungefähr 1 oder 2 betragen sollte. Falls er auf 6 oder 7 ansteigt, ist das Harz erschöpft. Falls dies der Fall sein sollte wird ein wenig mehr Harz oben auf die Säule zugegeben und falls notwendig wird die gesamte Probe wieder auf die Säule aufgebracht, um ein Binden aller ionischen Bestandteile sicherzustellen. Nachdem die gesamte Probe auf die Säule aufgebracht worden ist, wird sie mit 75 ml 50% wässrigem Ethanol gefolgt von 75 ml Wasser gewaschen. Diese Spülungen werden verworfen. Das Wasser wird verwendet, um den Alkohol vor dem Eluieren der gebundenen Bestandteile zu entfernen.
Die Säule wird mit 100 ml 2 N Ammoniumhydroxid eluiert und dieses wird in einem 250 ml Rundkolben gesammelt. Dieser wird auf 3–5 ml an einem Rotationsverdampfer bei weniger als 40°C eingedampft und in ein gewogenes 7 ml Glasfläschchen überführt. Das Trocken wird durch Einblasen von Stickstoff und/oder Gefriertrocken beendet. Die Proben werden sorgfältig am gleichen Tag getrocknet und sie werden nicht länger in der Ammoniaklösung als notwendig (typischerweise weniger als 15 Minuten) stehengelassen, da ansonsten eine Verbindungszersetzung auftreten könnte. 1–3 mg von jeder getrockneten Probe werden in GC-Glasfläschchen gegeben und wieder vor der Analyse gefriergetrocknet.
Auffangen nichtionischer Spezies
Dieses Verfahren verwendet das ungebundene Material von den vorstehend beschriebenen Dowex 50 Säulen.
30 ml des ungebundenen Extrakts von einer Dowex 50 Säule werden in einem großen Glasfläschchen gesammelt. Ein Sep-pak-Vakuumverteilerstück wird mit einer Sep-pak-Patrone (diese enthält HP-20 Harz) verwendet. Die Sep-pak-Patronen können unter Verwendung einer 5 ml Pipettenspitze zur Herstellung einer größeren Säule modifiziert werden.
Ein großes Glasfläschchen oder kleiner Becher wird unter die Patrone zum Sammeln des Abfalls gestellt. 5 ml der Probe werden auf die Sep-pak-Patrone aufgebracht. Ein mildes Vakuum wird angewandt, um die Probe durch die Patrone bei gleichmäßig tropfender Flüssigkeit zu ziehen. Sobald die Probe auf das HP-20 Harz in der Patronen aufgebracht ist, wird die Säule mit 3 ml 25% Methanol in Wasser gewaschen. Dieses wird in demselben Becher/Glasfläschchen gesammelt und die Inhalte werden dann verworfen. Der Zweck dieses Waschens besteht in dem Entfernen des größten Teils der Zucker aus dem Harz vor der Elution. Diese sind ungewollte gewöhnliche Metaboliten, die im Allgemeinen in großer Menge in den wässrigen Ethanolpflanzenextrakten vorhanden sind und, falls sie nicht entfernt werden würden, würden sie die Analyse der Proben stören.
Die Säule wird mit 5 ml 10% Aceton in Methanol eluiert und diese Probe wird in einem gewogenen 7 ml Glasfläschchen gesammelt. Diese Probe wird unter Vakuum getrocknet und dann falls notwendig gefriergetrocknet. Das Glasfläschchen wird wieder gewogen und die Probe wird auf 10 mg/ml in Methanol aufgefüllt. 150 μl der Probe werden in ein beschriftetes HPLC- und GC-Glasfläschchen zur Analyse überführt.
Extraktion der nicht polaren Bestandteile
Eine Filterpapierhülse wird konstruiert und 10 g getrocknetes und zermahlenes Pflanzenmaterial wird zugegeben oder Pflanzenmaterial wird nach der Entfernung ionischer Chemikalien getrocknet. Ein paar Glasperlen werden in einen 500 ml Rundkolben gelegt, den dann in einen Heizmantel gestellt wird und 200 ml Dichlormethan (DCM) werden zugegeben. Die Probenhülse wird in ein Soxhletrohr gestellt und dieses wird an den Rundkolben angebracht. 150 ml DCM werden zu der Probe in dem Soxhletrohr gegeben. Ein Kondensator wird oben auf den Soxhletapparat gesetzt und das Kühlwasser wird aufgedreht. Der Heizmantel wird angeschaltet, wobei sicher gestellt wird, dass eine gleichmäßige Rückflussgeschwindigkeit eingestellt ist. Am Ende der Extraktion wird der Heizmantel ausgeschaltet. Man lässt das System während weiteren 30 Minuten abkühlen, bevor das Wasser abgedreht wird.
Nachdem man das Extrakt auf Umgebungstemperatur abkühlen ließ, wird die Soxhletapparatur abgebaut, wobei gestattet wird, dass jegliches in dem Soxhlet selbst verbliebenes DCM in den Kolben siphoniert. Der Kolben wird aus dem Mantel entfernt. 10 ml HP-20 Harz wird in einen beschrifteten 1000 ml Rundkolben gegeben und das DCM-Extrakt wird dann zugegeben. Das HP-20/Extrakt wird unter Vakuum auf einem Rotationsverdampfer, der auf weniger als 40°C eingestellt ist, bis zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Harz wird in ein konisches 250 ml Glasfläschchen überführt und mit 3 × 100 ml 10% Aceton in Methanol eluiert. Die Lösung wird durch ein Filter in einen vorher gewogenen 500 ml Rundkobeln dekantiert und bis zur Trockene am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rundkolben wird wieder gewogen, um das Gewicht des Extrakts zu bestimmen, und das Material wird dann bis auf 100 mg/ml in Methanol aufgefüllt und in ein beschriftetes Glasfläschchen überführt. Das Extrakt wird vor der Analyse durch HPLC-PDA/MS und GC-MS filtriert.
Anmerkungen
(a) HP-20 Harz
Diaion HP-20 (hergestellt von Sumitomo Ltd) ist ein Styrol-Divinylbenzolpolymerharz. Es ist hydrophob und adsorbiert lipophile Verbindungen und schwache Säuren. Die synthetischen Adsorptionsmittel der HP- und SP-Serien sind unlösliche dreidimensionale vernetzte Polymere mit Makroporen. Sie besitzen keine Ionenaustausch- oder funktionelle Gruppen, sie weisen jedoch eine große Oberfläche auf und sind in der Lage, eine Vielfalt organischer Substanzen mittels van der Waals-Kräfte zu absorbieren. Die Polymermatrix kann entweder als aromatischer (Styrol-Divinylbenzol)-Typ oder als Acryl-(Methacryl)-Typ klassifiziert werden.
Sobald die Verbindungen adsorbiert sind können sie durch Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels aus dem Harz gewaschen werden. HP-20 wird auf folgende Weise zum Entfernen überschüssiger Mengen an Fetten und Chlorophyll aus Dichlormethan(DCM)-Extrakten von Pflanzen verwendet.
Das solubilisierte Extrakt wird auf dem Harz unter Vakuum getrocknet. Das Harz wird mit Methanol, das zunehmende Mengen an Aceton (bis zu 30% Aceton) enthält, eluiert. Dies ist ausreichend, um alle interessierenden Verbindungen heraus zu waschen, während Fette und Chlorophylle auf dem HP-20 Harz adsorbiert bleiben. Das HP-20 Harz wird zur Wiederverwendung durch Waschen mit Aceton und Hexan gereinigt. Dies wäscht alle ungewollten Verbindungen heraus und das Harz kann nach einem letzten Waschen mit Methanol noch einmal verwendet werden.
Für das Auffangen nichtionischer Verbindungen sind die Bestandteile der Extrakte polarer (wasserlöslich) als diejenigen in den Dichlormethanextrakten. Daher wird das HP-20 Harz auf eine etwas unterschiedliche Art zum Trennen von Zuckern von den interessierenden Verbindungen verwendet, indem diese zuerst unter Verwendung von 25% Methanol in Wasser vor der Elution des restlichen gebundenen Materials unter Verwendung von 10% Aceton in Methanol ausgewaschen werden. Der Schlüssel zu den verschiedenen Verwendungen des HP-20 Harzes liegt in der Polarität der Lösungsmittelsysteme, die zum Eluieren des darauf adsorbierten Material verwendet werden.
(b) Ionenaustauschchromatographie
Der Ionenaustauschschritt erlaubt die Konzentrierung ionischer Spezies, um sie einzuengen und entfernt verunreinigende Substanzen, die ihre Analyse stören könnten.
Proben werden am Anfang durch Extraktion unter Verwendung von näherungsweise 50% wässrigem Alkohol verarbeitet, die die polaren Bestandteile von den mehr nicht polaren Bestandteilen jeder Pflanze trennt und jegliche Proteine, die in dem Extrakt vorhanden sein können, denaturiert. Dann werden die Extrakte durch Ionenaustauschchromatographie verarbeitet, die die ionischen Verbindungen in jedem Extrakt (überwiegend Alkaloide, Aminosäuren und kleine Amine) von den nicht ionischen Verbindungen, die in den Extrakten ebenfalls vorhanden sein können (hauptsächlich Zucker, Fette und die meisten Phenolverbindungen) trennt und konzentriert. Dann werden die Proben in Enzymassays durch GC-MS oder HPLC analysiert.
Die filtrierten Extrakte werden auf Dowex 50W-X8-Harz aufgebracht, das ein mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrolharz ist. Es ist ein stark saurer Kationenaustauscher, der entweder in der Form der freien Säure oder Wasserstoff (H⁺)-Form oder in Form des Ammoniumsalzes (NH₄ ⁺)-Form verwendet werden kann. Beide Formen des Harzes adsorbieren Kationen aus der Lösung und setzen in die Lösung zurück eine gleiche Anzahl von Gegenionen frei (entweder H⁺ oder NH₄ ⁺-Ionen in Abhängigkeit von der Form des verwendeten Harzes). In der H⁺-Form adsorbiert das Dowex 50W-X8-Harz alle ionischen Verbindungen ohne Rücksicht auf ihre Ladung aus der Lösung (abgesehen von sehr starken Säuren) und dies ist die bevorzugte Form.
Bei der Adsorption von Kationen aus dem Extrakt werden die Protonen aus dem Harz ersetzt, wodurch der pH-Wert des Eluats auf einen pH-Wert von 6,0 (der pH-Wert des destillierten Wassers, das zum Spülen des Harzes vor der Verwendung verwendet wurde) bis näherungsweise 2,0 in Abhängigkeit von der Konzentration der Probe fällt. Je mehr die Probe verdünnt ist, um so kleiner ist das Absinken des pH-Werts. Sobald jedoch die Leistungsfähigkeit des Harzes erreicht worden ist, bewirkt fortgesetztes Beladen mit der Probe einen Anstieg des pH-Werts zu demjenigen des Rohextrakts selbst.
Das Dowex 50W-X8-Harz (50–100 Meshgröße) wird zur Verwendung durch Waschen mit 2N HCl hergestellt, um eine vollständige Umwandlung zu der H⁺-Form sicher zu stellen. Die überschüssige Säure wird durch gründliches Spülen mit destilliertem Wasser entfernt. Nachdem das Rohextrakt auf das Harz aufgebracht worden ist wird die Säule mit destilliertem Wasser zum Entfernen jeglichen ungebundenen Materials gewaschen bis der pH-Wert des Eluats auf denjenigen des Wassers selbst steigt. Die gebundenen Verbindungen werden mit einer 2 N Lösung Ammoniumhydroxid (NH₄ ⁺OH^–) eluiert. Die Säule wird bis auf einen pH-Wert von 6,0 mit Wasser gewaschen und der Ammoniak wird aus der Probe durch Verdampfen unter verringertem Druck bei 40°C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt.
Das Volumen des nicht durch das Ionenaustauscherharz gebundenen Materials wird durch Eindampfen unter verringertem Druck für das HP-20 Auffangen von Chemikalien verringert.
(c) Gaschromatographie–Massenspektrometrie (GC-MS)
Diese Technik wird zum Nachweisen und quantitativen Bestimmen der Bestandteile der angereicherten, aufgefangenen und verarmten Extrakte verwendet.
Die Gas-Flüssig-Chromatographie ist ein Verfahren, bei dem eine komplexe Mischung flüchtiger Substanzen in ihre Bestandteile durch Aufteilen der Probe zwischen einem inerten Gas unter Druck und einer dünnen Schicht einer nicht flüchtigen Flüssigkeit, die auf einen inerten Träger innerhalb einer erhitzten Säule aufgetragen ist, getrennt wird. Zum Erreichen einer guten Trennung spezifischer Verbindungen in einer Mischung ist es entscheidend, eine Säule mit den richtigen charakteristischen Merkmalen zu verwenden. Die Art des festen Trägers, Art und Menge der flüssigen Phase, Verfahren des Packens, gesamte Länge und Säulentemperatur sind wichtige Faktoren. Vorzugsweise werden Kapillarsäulen, die mit einer nicht polaren flüssigen Phase (25 m × 0,22 mm id 0,25 μm BPX5 stationäre Phase, hergestellt von SGE Ltd) beschichtet sind, oder dazu gleichwertige verwendet.
Viele Verbindungen sind entweder aufgrund ihrer hohen Polarität, niedrigen Flüchtigkeit oder thermischen Instabilität für eine direkte Einspritzung in einen Gaschromatographen ungeeignet. Verbindungen, die hoch hydroxyliert sind, sind aufgrund der intermolekularen Wasserstoffbindung schwierig zu verdampfen. Jedoch können sie durch Ersetzen der Hydroxylwasserstoffatome durch andere chemische Gruppen für die GC-Analyse ausreichend flüchtig gemacht werden. Die zwei beliebtesten Mittel zur Derivatisierung von Hydroxylgruppen sind die Acetylierung und Silylierung, wobei Acetylate [CH₃CO-O-R] oder Silylether, zum Beispiel Trimethylsilyl(TMS)-Ether [(CH₃)₃Si-O-R] gebildet werden. Bevorzugt ist die Silylierung von Proben vor der Analyse unter Verwendung von Sigma Sil (eine Mischung aus Trimethylchlorsilan, Hexamethyldisilazan und Pyridin 1:3:9) hergestellt von dem Sigma Chemieunternehmen. Eine Derivatisierung wird durch die Zugabe von 100 μl Sigma Sil A zu jedem mg getrocknetem Material in einem verschlossenen Glasfläschchen (das Reagenz zerfällt in Gegenwart von Wasser) erreicht und die Reaktion wird durch Erhitzen der Proben bei 60°C während 15 Minuten beendet.
Die Trimethylsilylether in jeder derivatisierten Probe werden auf der Säule unter Verwendung eines Temperaturprogramms getrennt. Ein Temperaturprogramm wird verwendet, weil dieses die schnelle Trennung von Verbindungen über einen sehr großen Siedebereich erlaubt.
Bei der Elektronenstoßmassenspektrometrie wird das aus dem Gaschromatograph ausströmende Medium, das die getrennten und verdampften Verbindungen enthält, in die Ionenkammer des Massenspektrometers geleitet, in der Hochvakuum herrscht. Die Moleküle werden mit einem Strahl von ausgehend von einer Fadenkathode beschleunigten Elektronen beschossen, der sie ionisiert und fragmentiert. Am Anfang wird von jedem Molekül ein Elektron entfernt, um ein positiv geladenes Molekülion (M⁺), das heißt ein Radikalkation) zu bilden. Der Bruch von Bindungen findet im Vergleich zur Bindungsstärke in dem Molekülion schnell statt, um fragmentierte Ionen zu erzeugen. Die Art, auf welche die Moleküle fragmentieren ist hoch charakteristisch und kann als eine Form der „Fingerabdruck" Identifikation verwendet werden. Die verschiedenen Ionen werden in den Analysatorteil des Massenspektrometers hinein beschleunigt, in dem sie gemäß ihrer Masse zu Ladungsverhältnisse) m/z-Werte sortiert werden, die zu den Molekülgewichten der Fragmente äquivalent sind. Das Ionensignal wird durch einen Elektronenverstärker verstärkt und das Massenspektrum wird von niedriger bis hoher Masse aufgetragen. Die m/z-Werte werden gegen die relative Häufigkeit der Ionen aufgetragen, um den sichtbaren „Fingerabdruck" zu ergeben.
(d) HPLC-PDA/MS/ELS (Verdampfungslichtstreuungsnachweis)
Diese Technik wird zum Nachweisen und quantitativen Bestimmen der Bestandteile der aufgefangenen und verarmten Extrakte verwendet. Mit dieser Technik werden Proben in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und auf einer Säule unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung, die unter Druck durch die Säule gepumpt wird, getrennt. Drei Detektoren werden verwendet; ein Massenspektrometer, wie es vorstehend beschrieben ist und ein Potodiodenarraysystem, das misst, ob die Verbindungen Licht bei Wellenlängen in sowohl UV- als auch sichtbaren Bereichen absorbieren.
In den vorstehend beschriebenen Beispielen wurde ein Waters Integrity^TM HPLC-PDA/MS-System, ausgestattet mit einer Umkehrphase-C₈ HPLC-Säule (50 mm × 2,1 mm id × 3,5 μm, Waters) verwendet. Die Durchflussrate des Lösungsmittels durch die Säule betrug 0,35 ml/min und ein linearer Gradient wurde verwendet, der von 90% Wasser und 10% Acetonitril (das 0,01% Trifluoressigsäure enthielt) ausging und auf 100% Acetonitril während 6 Minuten anstieg und weitere 6,5 Minuten dort beibehalten wurde.
Extinktions-(Photodiodenarray – PDA)Daten wurden von 200–600 nm gesammelt und Massenspektrendaten wurden zwischen 71 und 600 m/z gesammelt.

Claims

Methode zum Überwachen der Qualität eines Kräuterheilmittels umfassend die Schritte des: (a) Bereitstellens einer ersten Probe des Kräuterheilmittels; (b) Extrahierens der Probe mit einem polaren Lösungsmittel zum Herstellen: (i) eines Extrakts polarer Phytochemikalien ausgewählt unter Pyrrolidin-, Piperidin-, Pyrrolizidin-, Indolizidin-, Tropan- und Nortropanalkaloiden; und (ii) eines nichtpolaren Rückstands; (c) Charakterisierens des Extrakts der polaren Phytochemikalien.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Extrakt polarer Phytochemikalien vor dem Charakterisieren fraktioniert wird durch: (a) Ionenaustauschchromatographie unter Bildung eines Extrakts, der an ionischen Verbindungen reich ist, und eines nichtionischen Rückstands; und daraufhin (b) chromatographisches Fraktionieren, z. B. durch Gas-Flüssig-Chromatographie, des angereicherten Extrakts aus Schritt (a), um eine oder mehrere polare Fraktionen umfassend eine oder mehrere ionische Phytochemikalien zu ergeben.
Methode nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, des Weiteren umfassend die Schritte des: (i) auffangendes Durchsuchen des nichtionischen Rückstands nach nichtionischen Spezies durch Unterwerfen des nichtionischen Rückstands einer hydrophoben Wechselwirkung oder Umkehrphasenchromatographie, um einen aufgefangenen nichtionischen Extrakt, der an Zuckern verarmt ist, zu erzeugen; und (ii) Charakterisieren des aufgefangenen Extrakts.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Weiteren umfassend: (i) das Extrahieren einer zweiten Probe des Kräuterheilmittels oder das sequentielle Extrahieren des nichtpolaren Rückstands der ersten Probe mit einem nichtpolaren Lösungsmittel unter Bildung eines nichtpolaren Extrakts; und (ii) Charakterisieren des nichtpolaren Extrakts. 5 Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der polare und/oder nichtpolare Extrakt: (a) funktionell; und/oder (b) physikalisch; und/oder (c) chemisch charakterisiert werden.
Methode nach Anspruch 5, wobei: (a) die funktionelle Charakterisierung einen biologischen Assay ausgewählt unter in vivo- oder in vitro-Assays; und/oder Enzymhemmungsassays, Glykosidase- und/oder Lipasehemmung; und/oder Rezeptorbindungsassays; und/oder Zellassays, z. B. Zellreplikations-, Zellkrankheitserreger-, Zell-Zell-Wechselwirkungs- und Zellabsonderungsassays; und/oder Immunassays; und/oder Assays bezüglich der antimikrobiellen Aktivität, z. B. Bakterien- und Viruszellbindungs und/oder -replikationsassays; und/oder Toxizitätsassays z. B. LD₅₀-Assays umfasst und/oder (b) die physikalische Charakterisierung ausgewählt wird unter: der Quantifizierung der phytochemischen Komponente(n); und/oder dem Messen der Reinheit der Bestandteile; und/oder dem Bestimmen des Molekulargewichts oder der Molekulargewichtsverteilung oder verschiedener statistischer Funktionen derselben im Falle von Fraktionen, die mehrere verschiedene phytochemische Bestandteile umfassen; und/oder dem Bestimmen der molekularen Formel(n), z. B. durch Kernmagnetresonanz; und/oder Spektralanalyse und/oder (c) die chemische Charakterisierung Messbestimmungen der chemischen Reaktivität der phytochemischen Bestandteils bzw. der chemischen Bestandteile; und/oder der Löslichkeit des phytochemischen Bestandteils bzw. der phytochemischen Bestandteile; und/oder der Beständigkeit und des Schmelzpunkts des phytochemischen Bestandteils bzw. der phytochemischen Bestandteile umfasst.
Methode nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das Fraktionieren des Extrakts polarer Phytochemikalien eine definierte Fraktion oder eine isolierte, z. B. im Wesentlichen reine, polare Phytochemikalie ergibt.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Charakterisierung ein phytochemisches Profil ergibt, die wahlweise des Weiteren den Schritt des Analysierens der phytochemischen Profils umfasst, um zu bestimmen, ob: (a) ein oder mehrere bioaktive Wirkstoff(e) oder bioaktive(r) Marker in der bzw. des Probe(n) vorliegen; und/oder (b) es der Standardspezifikation entspricht.
Verfahren für die Herstellung eines Kräuterheilmittels umfassend den Schritt des Überwachens der Qualität des Kräuterheilmittels durch eine Methode, wie durch irgendeinen der Ansprüche 1 bis 8 definiert.