DE60120209T2 - Effiziente methode zur herstellung von zusammensetzungen, die mit anthocyaninen angereichert sind - Google Patents

Effiziente methode zur herstellung von zusammensetzungen, die mit anthocyaninen angereichert sind Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung ist auf effiziente ein- oder zweistufige Verfahren zum Herstellen von mit Phenolen angereicherten Zusammensetzungen aus getrocknetem oder frischem Pflanzenmaterial gerichtet. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen von mit Anthocyaninen und Proanthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen bereit.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik:
  • Anthocyanine sind natürlich vorkommende Verbindungen, welche für die rote, purpurfarbene und blaue Farbe von vielen Früchten, Gemüsepflanzen, Getreidekörnern und Blumen verantwortlich sind. Zum Beispiel sind die Farben von Beerenfrüchten wie Blaubeeren, Heidelbeeren, Erdbeeren, Himbeeren, Boysenbeeren, Marionbeeren (marionberries), Moosbeeren bzw. Preiselbeeren (cranberries) auf viele verschiedene Anthocyanine zurückzuführen. Es wurden in der Natur über 300 strukturell verschiedene Anthocyanine identifiziert. Da Anthocyanine natürlich vorkommen, haben sie viel Interesse zur Verwendung als Farbmittel für Lebensmittel und Getränke geweckt.
  • In letzter Zeit hat sich das Interesse an Anthocyaninpigmenten verstärkt aufgrund ihres möglichen Gesundheitsnutzens als Nahrungsmittelantioxidanzien. Zum Beispiel wurden Anthocyaninpigmente von Heidelbeeren (Vaccinium myrtillus) seit langem zum Verbessern der Sehschärfe und zum Behandeln von Kreislaufstörungen verwendet. Es gibt experimentelle Beweise dafür, dass bestimmte Anthocyanine und Flavonoide entzündungshemmende Eigenschaften haben. Außerdem gibt es Berichte, dass oral verabreichte Anthocyanine zum Behandeln von Diabetes und Geschwüren günstig sind und antivirale und antimikrobielle Aktivitäten aufweisen können. Es wird angenommen, dass die chemische Grundlage für diese wünschenswerten Eigenschaften von Flavonoiden mit ihrem Antioxidationsvermögen zusammenhängt. So wurden die Antioxidationseigen schaften, die mit Beeren und anderen Früchten und Gemüsepflanzen verbunden sind, ihrem Anthocyaningehalt zugeschrieben.
  • Proanthocyanine sind eine weitere Klasse von Flavonoidverbindungen, welche in Früchten und Gemüsepflanzen vorkommen und, wenngleich sie farblos sind, antioxidative Aktivitäten aufweisen.
  • Aufgrund der vorstehenden Eigenschaften und Vorteile von Anthocyaninen und Proanthocyaninen wurden große Anstrengungen unternommen im Hinblick auf das Extrahieren dieser Verbindungen aus Früchten, Gemüsepflanzen und anderen pflanzlichen Ausgangsmaterialien. Außer Anthocyaninen enthalten Pflanzen, Früchte und Gemüsepflanzen auch andere Verbindungen wie Mineralsalze, gewöhnliche organische Säuren wie Zitronensäure oder Weinsäure, Kohlenhydrate, Flavonoidglycoside und Catechine. Es ist häufig wünschenswert, die Anthocyanine und Proanthocyanine von diesen Verbindungen zu isolieren. Anthocyanine wurden durch verschiedene Verfahren aus Pflanzen und Früchten extrahiert. Ein Extraktionsverfahren zum Extrahieren von Anthocyaninen setzt Schwefeldioxid ein. Der Extrakt wird durch eine Ionenaustauschsäule geleitet, um die Anthocyaninmaterialien zu adsorbieren, und die adsorbierten Anthocyanine werden mit Aceton, Alkali oder Dimethylformamid (DMF) eluiert. Zu Nachteilen dieses Verfahrens gehört die Anwesenheit von Schwefeldioxid, welches die Adsorption der Anthocyanine stört, wodurch mehrfache Säulenadsorptionen erforderlich sind. Eine Elution mit Alkali baut die Anthocyanine beträchtlich ab, während DMF kein zugelassener Lebensmittelzusatzstoff ist und deshalb eine vollständige Entfernung des DMF aus den Anthocyaninen erfolgen muss, bevor die Anthocyanine zu irgendwelchen Lebensmittelprodukten zugegeben werden können.
  • Shrikhande offenbart im US-Patent Nr. 4,452,822 ein Verfahren zur Herstellung eines rot färbenden Materials zur Verwendung als Farbmittel für Lebensmittel und Getränke, worin ein Anthocyanin enthaltendes pflanzliches Ausgangsmaterial mit Schwefeldioxid extrahiert wird, um einen Extrakt aus Anthocyaninmaterial zu bilden. Der Extrakt wird zuerst enzymatisch behandelt, um in dem Extrakt vorhandenes festes Material zu verringern oder zu eliminieren, und anschließend durch Oxidieren des Schwefeldioxids mit Wasserstoffperoxid behandelt. Nach dem Verringern des pH-Werts wird der Extrakt auf ein Ionenaustauschmedium (ein Copolymer von Styrol und Divinylbenzolpolymer oder vernetztem Polymethacrylat) aufgegeben, welches die Anthocyanine adsorbiert. Es ist je doch sehr schwierig, den gesamten Schwefel zu entfernen, wenn er erst einmal eingeführt worden ist. Außerdem baut Wasserstoffperoxid die Anthocyanine in dem Endprodukt ab.
  • Gabetta, et al., offenbart im US-Patent Nr. 5,200,186 ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten mit einem hohen Gehalt an Anthocyanosiden, welches das Behandeln eines Rohextrakts mit Bisulfitionen zum Bereitstellen von Anthocyanin-Bisulfit-Addukten beinhaltet. Nach dem Einstellen des pH-Werts des Extrakts auf 5–6 durch Zugabe eines wässrigen Alkalis wird der Extrakt auf ein nicht-polares Polystyrolharz aufgegeben und die Anthocyanin-Bisulfit-Addukte werden eluiert. Die erhaltene Lösung wird mehrmals mit Butanol oder Amylalkohol extrahiert. Nach einer Konzentration und Ansäuerung (pH 1–2) der organischen Phase wird der Extrakt mit hohem Anthocyaningehalt durch Lyophilisierung oder durch Fällung mit einem aprotischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, isoliert. Wiederum ist es schwierig, den gesamten Schwefel zu entfernen, wenn er erst einmal eingeführt worden ist. Außerdem ist es schwierig, das Butanol, den Amylalkohol oder das Ethylacetat zu entfernen, wenn diese Lösungsmittel erst einmal eingeführt worden sind.
  • Langston offenbart im US-Patent Nr. 4,500,556 ein Verfahren zum Herstellen eines Anthocyaninfarbmittels aus Traubentrester durch Inkontaktbringen mit einem wässrigen Extraktionslösungsmittel, das Bisulfitionen enthält, um ein Anthocyanin-Bisulfitionen-Addukt zu extrahieren. Der Extrakt wird anschließend mit einem nichtionischen Adsorbens in Kontakt gebracht, um das Anthocyanin-Bisulfit-Addukt zu adsorbieren, und das Adsorbens wird gewaschen, um lösliche Zucker, organische Säuren und andere wasserlösliche, nicht-pigmentierte Materialien zu entfernen. Dann werden die Anthocyanine mit einem angesäuerten organischen Lösungsmittel von dem Adsorbens eluiert. Wiederum ist es schwierig, den gesamten Schwefel zu entfernen, wenn er erst einmal eingeführt worden ist.
  • Lietti offenbart im US-Patent Nr. 4,413,004 ein Verfahren zum Extrahieren von Anthocyaninen aus Heidelbeeren durch Extrahieren der Frucht mit wasserfreiem Methanol, das Chlorwasserstoffsäure enthält, gefolgt von der Zugabe von Bleiacetat, um die Anthocyanine als die Bleisalze zu fällen. Die Verwendung von Blei macht jedoch die durch dieses Verfahren erhaltenen Produkte für eine Verwendung in Lebensmitteln ungeeignet.
  • Die vorstehenden Beispiele beschreiben einige im Fachgebiet bekannte Verfahren zum Extrahieren und Isolieren von Anthocyaninen aus verschiedenen Pflanzenmaterialien. Jedes der vorstehenden Verfahren schließt jedoch die Verwendung von toxischen und/oder umweltgefährdenden Materialien ein. Folglich ist es nicht leicht möglich, die derzeitigen Verfahren, die zum Isolieren und Reinigen von Anthocyaninen zur Verfügung stehen, zu einem effizienten kommerziellen Verfahren in großem Maßstab weiter zu entwickeln, bei dem die Berücksichtigung der Entsorgung von verschiedenen Chemikalien und Lösungsmitteln für die Durchführbarkeit des Verfahrens insgesamt eine wichtige Rolle spielt. Ferner müssen Anthocyanine auf eine Weise isoliert werden, welche ihre natürliche Instabilität gegenüber einem Abbau minimiert.
  • Deshalb besteht noch immer ein Bedarf für ein effizientes Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Zusammensetzungen, die Anthocyanine enthalten, für eine Verwendung in Nutrazeutika und Pharmazeutika, welches kosteneffektiv, in großem Maßstab durchführbar und wirtschaftlich vernünftig ist und nicht die Verwendung von toxischen Lösungsmitteln oder Reagenzien erfordert und die Anthocyanine auf eine Weise isoliert, welche ihre Instabilität gegenüber einem Abbau minimiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung vereinfachte und wirtschaftliche Verfahren zur Extraktion, Isolierung und Reinigung von mit Anthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen bereit. Genauer gesagt stellt ein Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von mit Anthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen bereit, umfassend: (a) Extrahieren von Pflanzen oder Pflanzenteilen, von denen bekannt ist, dass sie Anthocyanine enthalten, um einen Rohextrakt zu bilden, der Anthocyanine und Fremdverbindungen umfasst; (b) Zugeben eines Ausgangsmaterials für Bisulfit-(HSO3 –)-Ionen, um einen sulfitierten Extrakt zu bilden, der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte enthält; (c) Filtrieren des sulfitierten Extrakts; (d) Inkontaktbringen des sulfitierten Extrakts mit einem ersten Harz, welches einen Teil der Fremdmaterialien zurückhält; (e) Waschen der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte von dem Harz; (f) Ansäuern des teilweise gereinigten Extrakts, der von dem ersten Harz gewaschen wurde, um die Anthocyanine aus Anthocyanin-Bisulfit-Addukten freizusetzen; (g) Inkontaktbringen des angesäuerten Extrakts mit einem bromierten Polystyrolharz, welches die Anthocyanine adsorbiert, aber die üb rigen Fremdmaterialien nicht zurückhält; und (h) Eluieren der Anthocyanine von dem bromierten Styrolharz, um einen mit Anthocyaninen angereicherten Extrakt zu erhalten.
  • Diese Erfindung stellt ferner Verfahren zum Herstellen von mit Anthocyaninen und Proanthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen bereit, die als Nutrazeutika und Pharmazeutika brauchbar sind. Genauer gesagt stellt ein Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von mit Anthocyaninen und Proanthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen bereit, umfassend: (a) Extrahieren von Pflanzen oder Pflanzenteilen, von denen bekannt ist, dass sie Anthocyanine enthalten, mit einem angesäuerten Extraktionslösungsmittel, um einen Rohextrakt zu bilden, der Anthocyanine und Fremdverbindungen umfasst; (b) Filtrieren des Rohextrakts; (c) Inkontaktbringen des filtrierten Rohextrakts mit einem bromierten Polystyrolharz, welches die Anthocyanine adsorbiert, aber Fremdmaterialien nicht zurückhält; (d) Waschen des Harzes; und (e) Eluieren der Anthocyanine von dem bromierten Polystyrolharz, um einen mit Anthocyaninen angereicherten Extrakt zu erhalten.
  • Diese Erfindung stellt außerdem durch die Verfahren dieser Erfindung isolierte, mit Anthocyanin angereicherte Zusammensetzungen bereit. Die Zusammensetzungen sind als Nutrazeutika und Pharmazeutika brauchbar.
  • Die vorstehenden und andere Merkmale, Brauchbarkeiten und Vorteile der Erfindung gehen aus den folgenden ausführlicheren Beschreibungen von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hervor, wie sie in den beigefügten Abbildungen veranschaulicht sind und insbesondere in den beigefügten Ansprüchen dargelegt sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Die beigefügten Abbildungen, welche in diese Anmeldung aufgenommen sind und einen Teil der Beschreibung bilden, veranschaulichen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erläutern.
  • In den Abbildungen:
  • 1 ist ein Fließdiagramm zum Herstellen eines angereicheren Extrakts gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung, welche zwei getrennte Reinigungsschritte unter Verwendung von zwei verschiedenen Harzen umfasst.
  • 2 ist ein Fließdiagramm zum Herstellen eines angereicherten Extrakts gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung, umfassend eine (einzige) Reinigung des Extrakts.
  • 3 ist ein HPLC-Chromatogramm eines angereicherten Heidelbeerenextrakt-Endprodukts bei 510 nm.
  • 4 ist ein HPLC-Chromatogramm eines angereicherten Heidelbeerenextrakt-Endprodukts bei 280 nm.
  • 5 ist ein HPLC-Chromatogramm eines angereicherten Blaubeerenextrakt-Endprodukts bei 510 nm.
  • 6 ist ein HPLC-Chromatogramm eines angereicherten Blaubeerenextrakt-Endprodukts bei 280 nm.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Verfahren dieser Erfindung erzeugen gereinigte Extrakte und mit Anthocyaninen angereicherte Zusammensetzungen aus Pflanzenmaterialien, welche natürlicherweise Anthocyanine enthalten. Die Verfahren dieser Erfindung stellen ferner mit Gesamtanthocyaninen und Proanthocyaninen angereicherte Extrakte und Zusammensetzungen bereit. So wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Extrakt" auf eine Substanz, die aus einem Pflanzenausgangsmaterial gewonnen wird, welches natürlicherweise Anthocyanine enthält, einschließlich Extrakte, die aus der ganzen Pflanze oder aus verschiedenen Teilen der Pflanze wie den Früchten, Blättern, Stängeln, Wurzeln usw. hergestellt werden. Somit ist das Verfahren dieser Erfindung nicht auf den bestimmten Teil der Pflanze beschränkt, der zum Herstellen des Extrakts verwendet wird. Außerdem kann das Pflanzenmaterial frisches oder getrocknetes Pflanzenmaterial sein.
  • Zu Beispielen für Pflanzen und Früchte, welche bei der Herstellung der gereinigten Extrakte dieser Erfindung verwendet werden können, gehören beliebige Pflanzen, einschließlich Früchte und Gemüsepflanzen, welche Anthocyanine enthalten, einschließlich Blaubeeren, Heidelbeeren, Brombeeren, Erdbeeren, rote Johannisbeeren, schwarze Johannisbeeren, Moosbeeren bzw. Preiselbeeren, Kirschen, Himbeeren, Weintrauben, Korinthen, Holunderbeeren, Hibiskusblüten, Gemüsepaprika, Rotkohl, Purpurmais und violette Süßkartoffeln. Es ist bekannt, dass die meisten farbigen Früchte und Gemüsepflanzen Anthocyanine enthalten.
  • Die in dieser Anmeldung beschriebenen, mit Anthocyanin angereicherten Zusammensetzungen wurden durch standardmäßige, spektralfotometrische Bestimmung gegen einen Delphinidinchlorid-Standard getestet. Delphinidinchlorid ist ein Aglycon, wogegen Anthocyanine Glycoside sind, d.h. Aglycone, die an einen oder mehrere Zucker gebunden sind). Deshalb sind die Prozent Gesamtanthocyanine, die für die in dieser Anmeldung beschriebenen, mit Anthocyanin angereicherten Zusammensetzungen angegeben sind, tatsächlich als Prozent Gesamtaglycone angegeben. Folglich versteht der Fachmann, dass die Prozentsätze der Gesamtanthocyanine (Glycoside) in den mit Anthocyanin angereicherten Zusammensetzungen tatsächlich wenigstens 1,4-mal größer sind als die gemessenen Gesamtaglycone. Somit bezieht sich in der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen der Begriff "Prozent Anthocyanine" auf die Prozent Gesamtaglycone, die gegen einen Delphinidinchlorid-Standard bestimmt sind, wobei diese Messung mit den Gesamtanthocyaninen in Zusammenhang gebracht werden kann.
  • Zweisäulen-Reinigungsverfahren
  • 1 ist ein Fließdiagramm, das die Schritte von einer Ausführungsform dieser Erfindung zeigt, in welcher ein gereinigter Extrakt dieser Erfindung, der mit Anthocyaninen angereichert ist, durch ein Zweisäulen-Reinigungsverfahren hergestellt werden kann. Das Zweisäulen-Reinigungsverfahren dieser Erfindung schließt einen Schritt (Schritt 60, 1) ein, bei dem ein teilweise gereinigter Extrakt unter Verwendung eines bromierten Polystrolharzes gereinigt wird. Das in 1 veranschaulichte Verfahren beruht auf der Entdeckung, dass das Ersetzen des im Fachgebiet verwendeten herkömmlichen Polystyrolharzes in dem zweiten Säulenreinigungsschritt (Schritt 60) durch ein bromiertes Polystyrolharz Zusammensetzungen mit höheren Reinheiten ergibt als mit anderen Polystyrolharzen, wie nachstehend ausführlich erörtert wird.
  • Vor den in dieser Anmeldung beschriebenen Reinigungsverfahren wurden Anthocyanine (typischerweise zusammen mit Proanthocyaninen) aus einem Pflanzenmaterial extrahiert, um einen Rohextrakt zu bilden (Schritt 5, 1). Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe von Extraktionsverfahren in der Literatur zur Verfügung stehen, wie eine Extraktion in einem Bottich (vat extraction), eine Perkolation, eine Gegenstromextraktion usw. Das spezielle Extraktionsverfahren, das eingesetzt wird, ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich. Der Zerkleinerungsgrad des Pflanzenmaterials vor dem Extraktionsverfahren sollte eine ausreichende Teilchenoberfläche für den Kontakt mit dem Extraktionslösungsmittel bereitstellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Extraktionsverfahren (Schritt 5, 1) durchgeführt, indem frisches oder getrocknetes Pflanzenmaterial in eine geeignete Menge Extraktionslösungsmittel gegeben wird, um einen Rohextrakt zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Extraktionslösungsmittel eine wässrige Lösung, die ungefähr 0–95% Ethanol in Wasser oder 0–100% Methanol in Wasser umfasst. Das Pflanzenmaterial wird mit der Extraktionslösung während eines angemessenen Zeitraums bei einer Temperatur zwischen ungefähr Raumtemperatur und 75°C, vorzugsweise 40°C, in Kontakt gebracht, um den Rohextrakt zu bilden. Die Menge des Pflanzenmaterials zu dem in dem Extraktionsverfahren verwendeten Extraktionslösungsmittel schwankt zwischen ungefähr 2 : 1 bis ungefähr 1 : 20, auf einer Gramm-zu-Milliliter-Basis, wobei ungefähr 1 : 4 bis 1 : 8 bevorzugt ist. Der Rohextrakt enthält sowohl die gewünschten Anthocyanine sowie Fremdmaterialien (z.B. pflanzliche Sterole, Fettsäuren, Triglyceride, Zucker, organische Säuren und andere Arten von Flavonoidglycosiden) in dem Extraktionslösungsmittel gelöst. Die in dem Rohextrakt enthaltenen pflanzlichen Feststoffe werden von dem flüssigen Anteil abgetrennt und die pflanzlichen Feststoffe werden entweder erneut extrahiert, wie es vorstehend beschrieben ist, oder verworfen.
  • In einer Ausführungsform von Schritt 5 (1) wird vor oder während des Extraktionsverfahrens entweder zu dem Pflanzenmaterial oder zu dem Extraktionslösungsmittel Pektinase zugegeben. Alternativ kann die Pektinase zu dem Rohextrakt zugegeben werden, nachdem das Extraktionsverfahren abgeschlossen ist. Die Pektinase dient dazu, zu verhindern, dass der Extrakt zu irgendeinem Zeitpunkt während oder nach dem Extraktionsverfahren geliert, so dass er während der Säulenreinigung fließfähig bleibt. Die Menge der zugegebenen Pektinase hängt natürlich von der Menge des zum Herstellen des Extrakts verwendeten Pflanzenmaterials ab. Typischerweise wird die Pektinase in einer Menge zwischen ungefähr 0 und 0,12 Gew.-%, bezogen auf das Pflanzenausgangsmaterial, zugegeben.
  • Schritt 10 (1) des Zweisäulen-Reinigungsverfahrens dieser Erfindung umfasst das Zugeben von Bisulfitionen (HSO3 –) zu dem Rohextrakt, um einen Extrakt zu bilden, der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte enthält. Anthocyanine sind positiv geladene Moleküle und reagieren deshalb mit den negativ geladenen Bisulfitionen, während ebenfalls in dem Rohextrakt vorhandene Flavonoidglycoside nicht mit den Bisulfitionen reagieren. Die Bisulfitionen können auf jede zweckmäßige Weise zugegeben werden, wie etwa durch die Zugabe von Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit, schwefliger Säure, SO2-Gas und dergleichen. In einer Ausführungsform wird Natriummetabisulfit in Wasser gelöst und zu dem Rohextrakt zugegeben. Die Menge der zugegebenen Bisulfitionen liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 10–20 Äquivalenten, wobei 15 Äquivalente bevorzugt sind. Der Rohextrakt umfasst nun die Anthocyanin-Bisulfit-Addukte zusammen mit den vorstehend erwähnten Fremdmaterialien, die in der Extraktionslösung gelöst sind. Die Bildung der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte ermöglicht die Trennung der Anthocyanine von den in dem Rohextrakt vorhanden, nicht komplexierten neutralen Verbindungen, wie es nachstehend beschrieben ist.
  • Wenn eine alkoholische Extraktionslösung zum Herstellen des Rohextrakts in Schritt 5 (1) verwendet wurde, wird der sulfitierte Rohextrakt in Schritt 20 konzentriert, bis er weniger als 6% Alkohol enthält, vorzugsweise unter Beibehaltung einer Temperatur von 40°C oder weniger während der Konzentration. Wasser wird zugegeben, um den konzentrierten, sulfitierten Rohextrakt zu verdünnen, und der verdünnte sulfitierte Rohextrakt wird entweder konzentriert und erneut mit Wasser vor Schritt 30 verdünnt oder direkt zu Schritt 30 weitergeleitet, ohne eine zweite Verdünnung durchzuführen. Wenn Wasser als die Extraktionslösung bei der Herstellung des Rohextrakts verwendet wurde, ist der Konzentrationsschritt 20 natürlich nicht erforderlich und in diesem Fall wird der Rohextrakt von Schritt 10 direkt zu Schritt 30 weitergeleitet, wie durch den gestrichelten Pfeil in 1 gezeigt ist.
  • Schritt 30 (1) des Zweisäulen-Verfahrens umfasst das Filtrieren des sulfitierten Rohextrakts von Schritt 20, um Feststoffe zu entfernen, welche aus dem Rohextrakt ausgefallen sein können. Der Filtrationsschritt 30 umfasst das Zugeben einer abgemessenen Menge eines Filterhilfsmittels zu dem Rohextrakt von Schritt 20. Zu Beispielen für geeignete Filterhilfsmittel gehören Diatomeenerde und Cellulose. Das Gemisch aus Rohextrakt und Filterhilfsmittel wird vorzugsweise geschüttelt oder gerührt, bis es homogen ist. Das Gemisch wird durch ein Bett aus dem Filterhilfsmittel filtriert und das Bett wird mit entionisiertem Wasser gewaschen.
  • Der sulfitierte, filtrierte Extrakt, welcher einen pH von ungefähr 3,5 aufweist, wird anschließend in dem ersten Reinigungsschritt (Schritt 40, 1) des Zweisäulen-Verfahrens dieser Erfindung gereinigt. In Schritt 40 wird der filtrierte Extrakt von Schritt 30 mit einem adsorbierenden Material oder Harz in Kontakt gebracht, welches nicht-komplexierte Flavonoidglycoside, pflanzliche Sterole, Fettsäuren und Triglyceride adsorbiert, aber sehr wenig von dem Anthocyanin-Bisulfit-Addukt absorbiert, das in dem sulfitierten filtrierten Extrakt enthalten ist. Die in dem ersten Harz-Kontaktschritt 40 verwendeten Harze sind nichtionische, vernetzte Umkehrphasenharze. Zu den nichtionischen Materialien, die als Adsorbenzien für den ersten Reinigungsschritt 40 geeignet sind, gehören alle bekannten makroporösen vernetzten Polymere, die durch Polymerisation von Styrol, Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Alkylvinylbenzol, Acrylvinylbenzol, Methylmethacrylat und dergleichen erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Harz ein Polymethacrylatharz wie CG-71cd Amberchrom (TosoHaas; Montgomery, PA). Im Allgemeinen ist ungefähr ein Liter Harz pro 100 Gramm Gesamtanthocyanine, die in dem sulfitierten, filtrierten Extrakt vorhanden sind, erforderlich. Wenngleich die Schritte des Inkontaktbringens von rohen oder teilweise gereinigten Extrakten mit einem Harz in dieser Anmeldung im Hinblick auf das Inkontaktbringen der Extrakte mit einem Harz beschrieben werden, welches in eine Säule geladen ist, dient eine solche Beschreibung lediglich zur leichteren Erläuterung. Somit braucht das Harz nicht in eine Säule gepackt sein, um die Verfahren dieser Erfindung durchzuführen.
  • In einer Ausführungsform ist das erste Harz von Schritt 40 (1) in eine Säule gepackt und der sulfitierte, filtrierte Extrakt wird mit einer Geschwindigkeit von ungefähr einem halben bis einem Säulenvolumen pro Minute durch das erste Harz geleitet. Das heißt, während Schritt 40 läuft das Anthocyanin-Bisulfit-Addukt durch das Harz, während unerwünschte Fremdmaterialien wie nicht-komplexierte Flavonoidglycoside, pflanzliche Sterole, Fettsäuren und Triglyceride von dem Harz zurückgehalten werden. Nachdem der gesamte sulfitierte, filtrierte Extrakt durch das Harz hindurchgelaufen ist, wird das Harz mit ungefähr 10 Säulenvolumina entionisiertem Wasser gewaschen, um den Rest des Anthocyanin-Bisulfit-Addukts zu eluieren. Das aufgegebene Elutionsmittel (load eluent) und das Wasser-Elutionsmittel von Schritt 40 werden kombiniert, um ein erstes gereinigtes Extraktprodukt zu ergeben, welches das Anthocyanin-Bisulfit-Addukt sowie Zucker, Salze, organische Säuren und verschiedene in dem Pflanzenmaterial vorhandene Phenole und zusätzlich Anthocyanine, welche von dem Harz nicht zurückgehalten wurden, umfasst.
  • Das erste gereinigte Extraktprodukt von Schritt 40, das das Anthocyanin-Bisulfit-Addukt enthält, wird durch die Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure in Schritt 50 (1) unter Mischen auf ungefähr pH 1,0 bis 1,25 angesäuert. Die Säure bewirkt das Spalten des Anthocyanin-Bisulfit-Addukts, wobei nicht-komplexierte Anthocyanine erhalten werden. Die angesäuerte Lösung in Schritt 50 wird durch teilweise Eindampfung konzentriert, um aus dem Addukt während der Ansäuerung freigesetztes Schwefeldioxid (SO2) zu entfernen. Die angesäuerte Lösung von Schritt 50 wird dann für die zweite Reinigung des Extrakts zu Schritt 60 weitergeleitet.
  • Der Zweck des zweiten Reinigungsschritts (Schritt 60, 1) ist, die Anthocyanine von Zuckern, Salzen und organischen Säuren abzutrennen, die immer noch in der angesäuerten Lösung von Schritt 50 (1) vorhanden sind. Herkömmliche Verfahren, die zum Erreichen dieses Reinigungsniveaus verwendet werden, umfassen typischerweise das Extrahieren der Anthocyanine in ein polares organisches Lösungsmittel, z.B. durch mehrmaliges Extrahieren der angesäuerten Lösung mit einem Lösungsmittel wie Butanol oder Amylalkohol. Extraktionen mit Butanol oder Amylalkohol sind jedoch aus vielen Gründen unerwünscht, zu denen auch die Tatsache gehört, dass solche Lösungsmittel hohe Siedepunkte aufweisen und deshalb durch Verdampfung schwer zu entfernen sind. Außerdem werden solche Lösungsmittel als Reizstoffe klassifiziert und es gibt somit spezielle Entsorgungsanforderungen. Deshalb ist das Reinigen von Anthocyaninen durch Ausführen von Extraktionen mit Butanol oder Amylalkohol kein wünschenswertes oder effizientes Verfahren, wenn Überlegungen hinsichtlich der Entsorgung solcher Lösungsmittel für die Durchführbarkeit des Verfahrens insgesamt eine wichtige Rolle spielen.
  • In Schritt 60 (1) der vorliegenden Erfindung wird die angesäuerte Lösung von Schritt 50, welche die nicht-komplexierten Anthocyane umfasst, mit einem zweiten adsorbierenden Material oder Harz in Kontakt gebracht. Das in Schritt 60 verwendete zweite Harz ist in der Lage, die nicht-komplexierten Anthocyanine zu adsorbieren, hält aber sehr wenig von den unerwünschten Fremdmaterialien zurück, die in der angesäuerten Lösung verbleiben. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten ein effizientes und wirtschaftliches Verfahren zum Erhalten einer Anthocyaninzusammensetzung mit hoher Reinheit durch Reinigen der angesäuerten Lösung von Schritt 50 auf einer Säule durch Inkontaktbringen der angesäuerten Lösung mit einem bromierten Polystyrolharz wie SP207 (Supelco; Bellafonte, PA), hergestellt von Mitsubishi Chemical America. SP207-Harz ist ein makroporöses, bromiertes polymeres Styrolharz vom Perltyp, das für umkehrphasenchromatografische Anwendungen bestimmt ist, und weist eine Teilchengrößenverteilung zwischen ungefähr 250–600 μm und einen Porengrößenbereich zwischen ungefähr 100–300 Angström auf. Die Bromierung der aromatischen Ringe ergibt eine erhöhte Hydrophobie gegenüber dem Polystyrolharz und ist dazu bestimmt, ein Harz mit einer erhöhten Selektivität für hydrophobe Moleküle, bezogen auf herkömmliche Styrol- oder Divinylbenzolpolymer-Umkehrphasenträger, bereitzustellen. Aufgrund seiner starken Bindungseigenschaften wird ein bromiertes Polystyrolharz bei der Reinigung von Naturprodukten typischerweise nicht verwendet. Da bekannt war, dass herkömmliche Polystyrolharze dazu neigen, Anthocyanine so fest zu binden, dass es sehr schwierig ist, die Anthocyanine von dem Polystyrolharz zu eluieren, wurde somit erwartet, dass das bromierte Polystyrolharz Anthocyanine noch fester binden würde. Somit wurde nicht erwartet, dass ein bromiertes Polystyrolharz für die Reinigung von Anthocyaninen geeignet sein würde. Die Erfinder entdeckten jedoch überraschenderweise und unerwartet, dass das bromierte Polystyrolharz Anthocyanine weniger fest bindet als nicht-bromierte Polystyrolharze, aber immer noch die Trennung von Anthocyaninen von unerwünschten Fremdverunreinigungen ermöglicht, welche polarer sind als die Anthocyanine.
  • Um den Reinigungsschritt 60 durchzuführen, wird das konzentrierte angesäuerte Produkt von Schritt 50 mit dem bromierten Polystyrolharz, wie etwa einem Harz, welches in eine Säule gepackt ist, in Kontakt gebracht. Wenn eine mit Harz gepackte Säule für den Reinigungsschritt 60 verwendet wird, werden im Allgemeinen ungefähr 40 Gramm Anthocyanine pro Liter Harz auf die Säule aufgegeben. Eine Verdünnung mit Wasser kann erforderlich sein, falls die Feststoffkonzentration in dem konzentrierten angesäuerten Produkt 200 Gramm pro Liter übersteigt.
  • Im Anschluss an das Aufgeben des angesäuerten filtrierten Extrakts auf das bromierte Polystyrolharz werden unerwünschte Materialien wie Zucker, Salze und organische Säu ren, welche wenig oder keine Affinität für das Adsorbens aufweisen, mit 0,1%iger wässriger Essigsäure spezifisch von dem Harz gewaschen. Vorzugsweise werden ungefähr zwei Säulenvolumina von 0,1%iger wässriger Essigsäure verwendet, um die Fremdmaterialien zu eluieren. Die gewünschten Anthocyanine werden dann unter Verwendung eines polaren organischen Lösungsmittels wie 50–75% Ethanol/Wasser oder 50–100% Methanol/Wasser von dem Harz eluiert. Es sind ungefähr vier bis zehn Säulenvolumina Elutionslösungsmittel erforderlich, um die Anthocyanine von dem Harz zu eluieren. Die Rückgewinnung der Anthocyanine aus dem Elutionsmittel kann auf eine beliebige zweckmäßige Weise, wie etwa durch Eindampfen, Destillation, Gefriertrocknen und dergleichen erfolgten, um einen angereicherten Extrakt dieser Erfindung bereitzustellen.
  • Die in dem Zweisäulen-Verfahren dieser Erfindung eingesetzten Bedingungen ergeben Extrakte, die mit Anthocyaninen angereichert sind, wobei die Blaubeerenextrakt-Endprodukte wenigstens 8% Anthocyanine, bezogen auf das Gewicht des Extrakts, enthalten. Zum Beispiel enthält in einer Ausführungsform das angereicherte Blaubeerenextrakt-Endprodukt zwischen ungefähr 8–40 Gew.-% Anthocyanine. In einer anderen Ausführungsform enthält das angereicherte Blaubeerenextrakt-Endprodukt ungefähr 15 Gew.-% Anthocyanine. In bestimmten Ausführungsformen enthält das angereicherte Blaubeerenextrakt-Endprodukt auch wenigstens 5% Proanthocyanine.
  • Das Zweisäulen-Verfahren dieser Erfindung stellt auch Heidelbeerenextrakte bereit, die wenigstens 8% Anthocyanine umfassen. In einer Ausführungsform enthält der Heidelbeerenextrakt zwischen ungefähr 8–55% Anthocyanine, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 28% und 45% Gesamtanthocyanine. In einigen Ausführungsformen enthalten die Extrakte auch wenigstens 5% Proanthocyanine. Das vorstehend beschriebene Zweisäulen-Verfahren ermöglicht auch vorteilhafterweise eine hohe Beladung sowohl auf der ersten als auch der zweiten Säule.
  • Einsäulen-Reinigungsverfahren
  • 2 ist ein Fließdiagramm, das die Schritte einer zweiten Ausführungsform dieser Erfindung zeigt, in welcher ein gereinigter Extrakt dieser Erfindung, der mit Anthocyaninen angereichert ist, durch ein Einsäulen-Reinigungsverfahren hergestellt werden kann. Das Einsäulen-Reinigungsverfahren dieser Erfindung stellt mit Anthocyaninen angereicherte Zusammensetzungen bereit, wobei die Zusammensetzungen geeignete Konzentrationen von Gesamtanthocyaninen zur Verwendung als Nutrazeutika umfassen. Wenngleich das Vorhandensein von Proanthocyaninen schwierig zu messen ist, wird angenommen, dass die mit dem Einsäulen-Verfahren isolierten Zusammensetzungen auch Proanthocyanine enthalten. Das Einsäulen-Verfahren dieser Erfindung gestattet es, die erste Säule (Schritt 40, 1), die in dem vorstehend beschriebenen Zweisäulen-Verfahren verwendet wird, wegzulassen. Ferner lässt das Einsäulen-Verfahren dieser Erfindung den Sulfitierungsschritt (Schritt 10, 1) des Zweisäulen-Reinigungsverfahrens dieser Erfindung weg und beseitigt somit vorteilhafterweise das Erfordernis, ein sulfitierendes Reagenz zu verwenden, und lässt wiederum den Ansäuerungsschritt 50 (1) des Zweisäulen-Verfahrens weg. Somit stellt das Einsäulen-Verfahren dieser Erfindung ein noch wirtschaftlicheres und effizienteres Verfahren zum Erhalten von mit Anthocyaninen angereicherten Zusammensetzungen durch Weglassen von verschiedenen Verfahrensschritten und durch Verringern der Menge an Reagenzien, die in dem Verfahren benötigt werden, bereit, wodurch die Herstellungskosten und Probleme im Zusammenhang mit der Abfallbeseitigung verringert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Einsäulen-Verfahrens dieser Erfindung, wie es in den Schritten 105–160 in 2 veranschaulicht ist, werden Anthocyanine aus einem frischen oder getrockneten Pflanzenmaterial extrahiert (Schritt 105, 2). Wie es in dem Zweisäulen-Verfahren beschrieben ist, stehen aus der Literatur eine Reihe von Extraktionsverfahren wie Extraktion in einem Bottich, Perkolation, Gegenstromextraktion usw. zur Verfügung. Das speziell eingesetzte Extraktionsverfahren ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Der Zerkleinerungsgrad des Pflanzenmaterials vor dem Extraktionsverfahren sollte eine ausreichende Teilchenoberfläche für den Kontakt mit dem Extraktionslösungsmittel bereitstellen.
  • Das Extraktionsverfahren (Schritt 105, 2) wird vorzugsweise dadurch erzielt, dass man frisches oder getrocknetes Pflanzenmaterial zu einer geeigneten Menge des Extraktionslösungsmittels gibt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Extraktionslösungsmittel eine angesäuerte Alkohollösung mit ungefähr 0–95% Ethanol in Wasser und eine geeignete Säure in einer Menge von ungefähr 0,5–3%, mehr bevorzugt ungefähr 0,5–1,0 Gew.-%. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Extraktionslösungsmittel eine angesäuerte Alkohollösung mit zwischen ungefähr 0–100% Methanol in Wasser oder zwischen ungefähr 0–95% Ethanol in Wasser und zwischen ungefähr 0,5–3 Gew.-% einer geeigneten Säure. Zu geeigneten Säuren, welche in dem Extraktionsschritt verwendet werden können, gehören Schwefelsäure (H2SO4) oder Chlorwasserstoffsäure (HCl). Das Pflanzenmaterial wird mit der Extraktionslösung während eines geeigneten Zeitraums bei einer Temperatur zwischen ungefähr Raumtemperatur und 75°C, vorzugsweise bei 40°C in Kontakt gebracht, um den Rohextrakt zu bilden. Die Menge des Pflanzenmaterials zu dem in dem Extraktionsverfahren verwendeten Extraktionslösungsmittel schwankt zwischen ungefähr 2 : 1 bis ungefähr 1 : 20 auf einer Gramm-zu-Milliliter-Basis, wobei ungefähr 1 : 4 bis 1 : 8 bevorzugt ist. Der Rohextrakt enthält Anthocyanine (und höchstwahrscheinlich Proanthocyanine) sowie Fremdmaterialien wie pflanzliche Sterole, Fettsäuren, Triglyceride und unerwünschte Verbindungen, welche polarer sind als die Anthocyanine, in dem Extraktionslösungsmittel gelöst. Der in dem Rohextrakt enthaltene feste Rückstand wird von dem flüssigen Anteil abgetrennt und der Rückstand wird entweder erneut extrahiert, wie es vorstehend beschrieben ist, oder verworfen.
  • In einer Ausführungsform von Schritt 105 (2) wird vor oder während des Extraktionsverfahrens entweder zu dem Pflanzenmaterial oder zu dem Extraktionslösungsmittel Pektinase zugegeben. Alternativ kann die Pektinase zu dem Rohextrakt zugegeben werden, nachdem das Extraktionsverfahren abgeschlossen ist. Die Pektinase dient dazu, zu verhindern, dass der Extrakt zu irgendeinem Zeitpunkt während oder nach dem Extraktionsverfahren geliert, so dass er während der Säulenreinigung fließfähig bleibt. Die Menge der zugegebenen Pektinase hängt natürlich von der Menge des zum Herstellen des Extrakts verwendeten Pflanzenmaterials ab. Typischerweise wird die Pektinase in einer Menge zwischen ungefähr 0 und 0,12 Gew.-%, bezogen auf das Pflanzenmaterial, zugegeben.
  • Wenn entweder eine ethanolische oder methanolische Extraktion zum Herstellen des Rohextrakts verwendet wurde, wird der Rohextrakt konzentriert, bis der Rohextrakt weniger als 6% Ethanol oder Methanol enthält, wobei vorzugsweise eine Temperatur von 40°C oder weniger während der Konzentration beibehalten wird. Wasser wird zugegeben, um den konzentrierten Rohextrakt zu verdünnen, und der verdünnte Rohextrakt wird entweder konzentriert und vor dem Schritt 130 wieder mit Wasser verdünnt oder direkt zu Schritt 130 weitergeleitet, ohne eine zweite Verdünnung durchzuführen. Wenn Wasser als die Extraktionslösung beim Herstellen des Rohextrakts verwendet wurde, ist Schritt 120 natürlich nicht erforderlich und in diesem Fall wird der Rohextrakt von Schritt 105 direkt zu Schritt 130 weitergeleitet, wie durch den gestrichelten Pfeil in 2 gezeigt ist.
  • Schritt 130 (2) des Einsäulen-Verfahrens umfasst das Filtrieren des Rohextrakts vom Schritt 120, um Feststoffe zu entfernen, welche aus dem Rohextrakt ausgefallen sein können. Die Erfinder entdeckten, dass die Menge an unerwünschten Fremdverbindungen, welche aus der Extraktionslösung ausfallen, durch Einstellen der Extraktionsbedingungen in Schritt 105 erhöht werden kann. Die ausgefallenen Fremdverbindungen können anschließend durch Filtration in Schritt 130 leicht entfernt werden. Es können verschiedene Filtrationsverfahren in dem Filtrationsschritt 130 des Einsäulen-Verfahrens dieser Erfindung eingesetzt werden. Ein Filtrationsverfahren, welches in Schritt 130 eingesetzt werden kann, umfasst das Zugeben einer abgemessenen Menge eines Filterhilfsmittels wie Diatomeenerde oder Cellulose zu dem Rohextrakt. Das Gemisch aus Rohextrakt und Filterhilfsmittel wird vorzugsweise geschüttelt oder gerührt, bis es homogen ist, und anschließend wird das Gemisch durch ein Bett aus Filterhilfsmittel filtriert. Das Bett wird mit einer wässrigen sauren Lösung, vorzugsweise ungefähr 1%iger wässriger Schwefelsäure, gewaschen.
  • Zu weiteren Filtrationsverfahren, welche im Schritt 130 verwendet werden können, gehört das Filtrieren des Rohextrakts durch Sand oder durch ein 30 Mikrometer Polypropylenfilter, welches vorzugsweise mit Glaswolle zugestopft ist. Noch ein weiteres Filtrationsverfahren umfasst das Verwenden eines Sackfilters (ein sackförmiges Tuchfilter, das sich aus Polyethylen oder Polypropylen zusammensetzt), welches vorteilhafterweise in Reihe mit der Reinigungssäule von Schritt 160, der nachstehend beschrieben ist, angeordnet sein kann.
  • In Schritt 160 (2) wird der filtrierte Extrakt von Schritt 130, der die erwünschten Anthocyanine und die unerwünschten Fremdverbindungen umfasst, mit einem bromierten Polystyrol-Adsorptionsmaterial oder Harz in Kontakt gebracht, das imstande ist, die Anthocyanine (und die Proanthocyanine) zu adsorbieren. Wie vorstehend in dem Zweisäulen-Verfahren erörtert wurde, entdeckten die Erfinder überraschenderweise und unerwarteterweise, dass das bromierte Polystyrolharz Anthocyanine weniger fest bindet als nicht-bromiertes Polystrolharz, während es immer noch eine saubere Trennung der Anthocyanine von unerwünschten Fremdverbindungen wie Zuckern, Salzen und organischen Säuren gestattet. Wenngleich die Schritte des Inkontaktbringens von rohen oder teilweise gereinigten Extrakten mit einem Harz in dieser Anmeldung im Hinblick auf das Inkontaktbringen der Extrakte mit einem Harz beschrieben sind, das in eine Säule gepackt ist, dient auch hier wieder eine solche Beschreibung lediglich zur leichten Erläuterung. Somit braucht das Harz nicht in eine Säule gepackt sein, um das Verfahren dieser Erfindung durchzuführen.
  • In einer Ausführungsform des Reinigungsschritts 160 wird der filtrierte Rohextrakt von Schritt 130 auf eine Säule aufgegeben, die mit bromiertem Polystyrolharz mit einer Teilchengrößenverteilung zwischen ungefähr 250–600 Mikrometer und einem Porengrößenbereich zwischen ungefähr 100–300 Angström gepackt ist. Die Menge des Rohextrakts, welcher auf die Säule aufgegeben wird, hängt von dem zum Herstellen des Rohextrakts verwendeten Pflanzenmaterial ab. Wenn z.B. der Rohextrakt aus Heidelbeeren hergestellt wird, können ungefähr 16–30 Gramm Anthocyanine pro Liter Harz aufgegeben werden. Wenn der Rohextrakt aus Blaubeeren hergestellt wird, können ungefähr 9–25 Gramm Anthocyanine pro Liter Harz aufgegeben werden. Der Rohextrakt kann vor dem Aufgeben mit Wasser verdünnt werden, wenn die Feststoffkonzentration in dem konzentrierten Rohextrakt 200 Gramm pro Liter Rohextrakt überschreitet.
  • Im Anschluss an die Aufgabe des filtrierten Rohextrakts auf das Harz werden unerwünschte Materialien wie Zucker, Salze und organische Säuren, welche wenig oder keine Affinität für das Adsorbens aufweisen, mit 0,1%iger wässriger Essigsäure spezifisch von dem Harz gewaschen. Vorzugsweise werden ungefähr zwei Säulenvolumina von 0,1%iger wässriger Essigsäure verwendet, um die Fremdmaterialien zu eluieren. Die gewünschten Anthocyanine (und die Proanthocyanine) werden anschließend unter Verwendung eines polaren organischen Elutionslösungsmittels wie 50–75% Ethanol/Wasser oder 50–100% Methanol/Wasser von dem Harz eluiert. Es sind ungefähr vier bis zehn Säulenvolumina Elutionslösungsmittel erforderlich, um die Anthocyanine von dem Harz zu eluieren. Die Rückgewinnung des Anthocyanins aus dem Elutionsmittel kann auf jede zweckmäßige Weise erfolgen, wie etwa durch Verdampfung, Destillation, Gefriertrocknen und dergleichen, um einen angereicherten Extrakt dieser Erfindung bereitzustellen.
  • Das vorstehend beschriebene Einsäulen-Verfahren eignet sich zum Herstellen von Zusammensetzungen, die ausreichend mit Anthocyaninen angereichert sind zur Verwendung als Nutrazeutika, aus einer Reihe von Pflanzenmaterialien, welche Anthocyanine enthalten, wie Blaubeeren, Heidelbeeren, Brombeeren, Erdbeeren, rote Johannisbeeren, schwarze Johannisbeeren, Moosbeeren bzw. Preiselbeeren, Kirschen, Himbeeren, Weintrauben, Korinthen, Holunderbeeren, Hibiskusblüten, Gemüsepaprika, Rotkohl, Purpurmais und violette Süßkartoffeln. Wenn z.B. angereicherte Extrakte aus getrockneten Heidelbeeren hergestellt wurden, enthielt das angereicherte Heidelbeerenextrakt-Endprodukt, das unter Verwendung des Einsäulen-Verfahrens dieser Erfindung hergestellt wurde, wenigstens 8 Gew.-% Gesamtanthocyanine. Zum Beispiel enthalten in einer Ausführungsform die angereicherten Heidelbeerenextrakt-Endprodukte ungefähr 8–50 Gew.-% Gesamtanthocyanine. In einem anderen Beispiel wurden angereicherte Extrakte aus getrockneten Blaubeeren unter Verwendung des Einsäulen-Verfahrens dieser Erfindung hergestellt, und die angereicherten Blaubeerenextrakt-Endprodukte, die unter Verwendung des Einsäulen-Verfahrens dieser Erfindung hergestellt wurden, umfassten zwischen ungefähr 8–35% Gesamtanthocyanine. Wie vorstehend angegeben ist, enthalten viele der Pflanzenmaterialien, welche Anthocyanine enthalten, auch andere Phenolverbindungen. Deshalb können die angereicherten Extrakt-Endprodukte dieser Erfindung auch wenigstens 20% Gesamtphenole enthalten. Mit "Gesamtphenolen" ist die Gesamtmenge all der verschiedenen Phenolverbindungen gemeint, die in dem angereicherten Extrakt isoliert werden, der durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt wird. Die Arten von Phenolverbindungen, die in den Pflanzenmaterialien vorhanden sind, welche in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt und brauchen nicht weiter beschrieben werden.
  • Falls es erwünscht ist, die entweder durch das Zweisäulen-Verfahren oder das Einsäulen-Verfahren dieser Erfindung erhaltenen angereicherten Extrakte weiter zu reinigen, können die vorstehend beschriebenen angereicherten Extrakte mit einem Anionenaustauschharz in Kontakt gebracht werden, um organische Säuren zu entfernen, welche immer noch in dem angereicherten Extrakt vorhanden sein können. Zu Anionenaustauschmedien, die sich zur weiteren Reinigung der angereicherten Extrakte eignen, gehören schwache Anionenaustauschharze, z.B. ein Diethylaminoethanolharz, wie DEM-63 (Whatman) oder Toyopearl DEAE-650M (TosoHaas). Alternativ kann ein starkes Anionenaustauschharz verwendet werden, um die angereicherten Extrakte dieser Erfindung weiter zu reinigen. Zu Beispielen für starke Anionenaustauschharze gehören quaternäre Aminharze wie Super Q-650M (TosoHaas). Vorzugsweise ist das Anionenaustauschharz ein schwaches Anionenaustauschharz. Um die Anionenaustauschsäulenreinigung durchzuführen, wird der angereicherte Extrakt in Wasser gelöst und mit dem Anionenaustauschharz in Kontakt gebracht, welches in eine Säule gepackt sein kann.
  • Das Harz wird mit Wasser gewaschen, um den weiter angereicherten Extrakt zu eluieren. Unter Verwendung des zusätzlichen Anionenaustauschharzreinigungsschritts wurde ein aus getrockneten Blaubeeren isolierter angereicherter Extrakt, der ungefähr 24% Gesamtanthocyanine enthielt, auf ungefähr 38% Gesamtanthocyanine weiter angereichert.
  • Die 3 und 4 sind HPLC-Chromatogramme von Heidelbeerenextrakten, die gemäß dem Einsäulen-Verfahren hergestellt wurden, bei 510 nm bzw. 280 nm. Tabelle 1 fasst den Prozentsatz von jedem Anthocyanid in dem am Ende erhaltenen Heidelbeerenextrakt zusammen, identifiziert durch die HPLC von 3.
  • TABELLE 1: Prozent Anthocyanide in Heidelbeerenextrakt
    Figure 00190001
  • Die 5 und 6 sind HPLC-Chromatogramme von Blaubeerenextrakten, die gemäß dem Einsäulen-Verfahren hergestellt wurden, bei 510 nm bzw. 280 nm.
  • Die angereicherten Extrakte dieser Erfindung können als Pillen, Kapseln oder Tinkturen formuliert werden. Beim Formulieren von Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung kann ein weiter Bereich von Excipienzien verwendet werden, deren Natur natürlich von der beabsichtigten Art der Anwendung der Zusammensetzung abhängt. Zu Beispielen für Excipienzien gehören Konservierungsmittel, Träger und Puffersubstanzen, Verdickungsmittel, Suspendiermittel, Stabilisiermittel, Netzmittel, Emulgiermittel, Färbemittel und Aromastoffe, und insbesondere Carboxyvinylpolymere, Propylenglycol, Ethylalkohol, Wasser, Cetylalkohol, gesättigte pflanzliche Triglyceride, Fettsäureester oder Propylenglycol, Triethanolamin, Glycerin, Stärke, Sorbitol, Carboxymethylcellulose, Laurylsulfat, Dicalciumphosphat, Lecithin usw.
  • Die angereicherten Extrakte dieser Erfindung können als Nahrungsergänzungsmittel (z.B. Nahrungs-Antioxidanzien) und zur Behandlung von Störungen bei Menschen und Säugern verwendet werden. Zum Beispiel können die angereicherten Extrakte dieser Erfindung zum Verbessern der Sehschärfe und zum Behandeln von Kreislaufstörungen, Diabetes und Geschwüren verwendet werden. Außerdem können die angereicherten Extrakte als entzündungshemmende Mittel, antivirale Mittel und antimikrobielle Mittel verwendet werden.
  • Die vorstehende Beschreibung wird nur als Veranschaulichung der Prinzipien der Erfindung angesehen. Da zahlreiche Modifizierungen und Abwandlungen dem Fachmann geläufig sind, ist es ferner nicht erwünscht, die Erfindung auf die vorstehend beschriebene exakte Konstruktion und das gezeigte Verfahren zu beschränken. Entsprechend kann auf alle geeigneten Modifizierungen und Äquivalente zurückgegriffen werden, die unter den Umfang der Erfindung fallen, wie er durch die nachfolgenden Ansprüche definiert ist.
  • Die Worte "umfassen", "umfassend", "einschließen", "einschließlich" und "schließt ein", sollen, wenn sie in dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen verwendet werden, das Vorhandensein von angegebenen Merkmalen, ganzen Zahlen, Komponenten oder Schritten spezifizieren, sie schließen aber nicht das Vorhandensein oder die Hinzufügung von einem oder mehreren weiteren Merkmalen, ganzen Zahlen, Komponenten, Schritten oder Gruppen davon aus.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Einsäulen-Verfahren-Reinigung von Heidelbeeren mit Wasser-Extraktion
  • Es wurden drei Extraktionen an 1 kg getrocknetem Heidelbeerenrohmaterial durchgeführt. Eine Extraktion verwendete 6 l Wasser und die anderen zwei Extraktionen verwendeten 4 l Wasser. Alle Extraktionen wurden auf 5 g/l Schwefelsäure angesäuert. Es gab eine ungefähr 88%ige Rückgewinnung von Anthocyaninen in den Extrakt. Genau 2,3 l des Rohextrakts wurden durch ein 30 μm-Polypropylenfilter mit einer Schicht Glaswolle über dem Filter filtriert. Die Glaswolle wurde einmal ausgetauscht und das Filter mit entionisiertem Wasser abgespült. Das Endvolumen des Filtrats betrug 2,43 l mit einer 90,9%igen Rückgewinnung von Anthocyaninen in dem Filtrat.
  • Eine Säule wurde mit bromiertem Polystyrolharz SP207 (Supelco; Belefonte, PA) gepackt und mit 0,1% Essigsäure äquilibriert. Auf die Säule wurden 2,24 l Filtrat mit einer Feststoffkonzentration von 29,8 g/l und einer Fließgeschwindigkeit von 2,2 ml/min aufgegeben. Der Aufgabeverlust (loading bleed) betrug weniger als 0,9% mit einem Gesamtverlust von 4,07% der Anthocyanine bei der Aufgabe und den ersten zwei Säulenwaschungen. Es gab eine 88,4%ige Rückgewinnung der Anthocyanine in dem Elutionsschritt und eine Anthocyanin-Massenbilanz von 92,5%. Einige hundert Milliliter Elutionsprodukt wurden an einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und anschließend lyophilisiert. Der abschließende Test erfolgte durch eine spektralfotometrische Standardbestimmung der Extinktion bei 535 nm gegen einen Delphinidinchlorid-Standard (102 Extinktionseinheiten/g/l bei 1,0 cm) des getrockneten Produkts. Die angereicherte Zusammensetzung enthielt 43 Gew.-% Gesamtanthocyanine.
  • Beispiel 2: Einsäulen-Verfahren-Reinigung von Heidelbeeren mit 70% Ethanol-Extraktion
  • Getrocknete Heidelbeeren-Biomasse (667 g), mit einem getesteten Anthocyaningehalt von 2,0%, wurde durch Perkolation unter Verwendung von 70% Ethanol/Wasser, enthaltend 3% Schwefelsäure, extrahiert. Der Rohextrakt enthielt 3,9% Gesamtanthocyanine. Ein Liter des ersten Extraktionsvolumens wurde mit 100 ml entionisiertem Wasser vermischt und im Vakuum auf ungefähr 460 ml eingedampft. Entionisiertes Wasser (300 ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und weitere 170 ml Flüssigkeit wurden ab gedampft. Entionisiertes Wasser (210 ml) wurde zugegeben, um ein Endvolumen von 800 ml zu erhalten. Zu dem wässrigen Gemisch wurden 150 g Celite (0,5 bis 0,9 g Celite pro Gramm Feststoffe) zugegeben. Das Gemisch wurde geschüttelt, bis es homogen war. Das Celite/Extrakt-Gemisch wurde über ein 30 g-Bett von feuchtem Celite 512 unter Vakuum gegossen. Nach der Beendigung der Filtration wurde das Bett mit 1,20 l 1%iger wässriger Schwefelsäure in 200 ml-Schritten gewaschen. Das Filtratvolumen betrug 1855 ml. Zu dem Filtrat wurden 145 ml entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Endvolumen von 2,0 l zu erhalten. Das Filtrat wurde mit 2,2 ml/Minute (1,3 ml/cm2/min) auf eine mit 170 ml bromiertem Polystyrolharz (Supelco) beladene Säule aufgegeben. Die aufgegebene Menge betrug 675 ml, was einen Aufgabewert von 17 g Anthocyaninen pro Liter Säulenmedium ergibt. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen von 0,1%iger wässriger Essigsäure und mit 2,5 Säulenvolumina von 0,1% HOAc/10% Ethanol/90% Wasser gewaschen. Anthocyanine wurden mit 10 Säulenvolumina von 70% Ethanol/Wasser eluiert. Das Produkt wurde im Vakuum bei 60°C und 50 mbar zu einem schwarzen, trockenen, glänzenden amorphen Feststoff eingedampft. Der abschließende Test erfolgte durch spektralfotometrische Standardbestimmung der Extinktion bei 535 nm gegen einen Delphinidinchlorid-Standard (102 Extinktionseinheiten/g/l bei 1,0 cm) des getrockneten Produkts. Durch den Test wurde festgestellt, dass der angereicherte Extrakt eine auf das Gewicht bezogene Reinheit (purity by weight) von 32% Gesamtanthocyaninen enthielt.
  • Beispiel 3: Zweisäulen-Reinigung von Heidelbeeren
  • Getrocknete Heidelbeeren (1,00 kg) wurden in einer Wiley-Mühle auf ungefähr 2 mm zermahlen. Die zermahlene Biomasse wurde in einen 10 l Rundkolben eingewogen. Zu dem Kolben wurden 4,00 l von 90% Ethanol/Wasser zugegeben. Das Gemisch wurde an einen Rotationsverdampfer angehängt, mit 90 U/min bei Atmosphärendruck rotieren gelassen und vier Stunden bei einer Temperatur von 74°C gehalten. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, durch Whatman #1-Papier filtriert und aufbewahrt. Genau 2,0 l des Extrakts wurden mit 150 ml entionisiertem Wasser, das 17,1 g Natriummetabisulfit enthielt, vermischt, an einem Rotationsverdampfer auf 500 ml konzentriert, mit entionisiertem Wasser auf 750 l verdünnt, an einem Rotationsverdampfer auf 400 ml konzentriert und mit entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1200 ml verdünnt. Zu dem verdünnten Gemisch wurden 110 g Celite 512 zugegeben. Die Suspension wurde gründlich vermischt und durch ein Bett von Celite 512 filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen.
  • Der sulfitierte, filtrierte Extrakt wurde auf eine Polymethacrylatsäule (CG-71cd Amberchrom; (TosoHaas; Montgomery, PA), Säulenvolumen 60 ml, mit einer Rate von 30 ml pro Minute aufgegeben. Die Säule wurde mit 600 ml entionisiertem Wasser eluiert und mit Methanol gesäubert. Das aufgegebene Elutionsmittel und das Wasser-Elutionsmittel wurden kombiniert, um das erste Säulenprodukt zu ergeben.
  • Das erste Säulenprodukt wurde mit Schwefelsäure auf pH 1 angesäuert, an einem Rotationsverdampfer konzentriert, um Schwefeldioxid zu entfernen, und auf eine Säule aufgegeben, die mit 80 ml bromiertem Polystyrolharz (Supelco) beladen war. Die Aufgabe wurde fortgesetzt, bis ein starkes Anthocyanin-Bluten auftrat. Das Säulenmedium wurde dann mit ungefähr 400 ml 0,1%iger wässriger HOAc gewaschen und Anthocyanine wurden mit 12 Säulenvolumina Methanol eluiert. Der abschließende Test erfolgte durch spektralfotometrische Standardbestimmung der Extinktion bei 535 nm gegen einen Delphinidinchlorid-Standard (102 Extinktionseinheiten/g/l bei 1,0 cm). Feststoffe wurden durch gravimetrischen Rückstand bestimmt. Die auf das Gewicht bezogene Reinheit des angereicherten Extrakts wurde getestet und betrug 41,6% Gesamtanthocyanine.
  • Beispiel 4: Angereicherte Extrakte aus Blaubeerenbiomasse
  • Zu 940 g getrockneten und zermahlenen Blaubeeren (Van Drunen FutureCeuticals; Momence, IL) wurden 4,0 Liter Extraktionslösungsmittel (1,0% Gew./Vol. Schwefelsäure/70% wässriges Ethanol) in einen 10 l Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur, die bei 40°C gehalten wurde, 2 Stunden lang rotieren gelassen. Das Gemisch wurde umgeschwenkt und durch ein 150 g-Bett aus Celite 512 unter Vakuum filtriert. Der Blaubeerenbiomassekuchen wurde mit 500 ml Extraktionslösungsmittel gewaschen. Der Kuchen wurde sorgfältig von dem Celitebett abgekratzt, in einen Rundkolben gegossen und unter Befolgung des vorstehend beschriebenen Verfahrens erneut extrahiert. Dann wurde eine dritte Extraktion durchgeführt. Die drei Rohextrakte wurden kombiniert.
  • Die kombinierten Extrakte (2,00 l) wurden im Vakuum bei einer Außentemperatur von 40°C zu 175 ml eingedampft. Der eingedampfte Extrakt wurde mit entionisiertem Wasser verdünnt, so dass 675 ml roher Blaubeerenextrakt erhalten wurden. Der Rohextrakt wurde ohne Filtration auf eine zuvor konditionierte (d.h. mit Aceton gewaschene) und äqui librierte Säule aufgegeben, die mit 170 l bromiertem Polystyrolharz (Supelco) beladen war. Die Säule wurde mit 0,1%iger wässriger Essigsäure und mit 0,1%iger wässriger HOAc/10%igem wässrigem Ethanol gewaschen. Die Anthocyanine wurden dann mit 70%igem wässrigem Ethanol eluiert. Der Produktpool wurde im Vakuum bei 50 mbar Druck und 60°C eingedampft. Der abschließende Test erfolgte durch spektralfotometrische Standardbestimmung der Extinktion bei 535 nm gegen einen Delphinidinchlorid-Standard (102 Extinktionseinheiten/g/l bei 1,0 cm). Die auf das Gewicht bezogene Reinheit des gereinigten Blaubeerenextrakts wurde bestimmt und betrug 18% Gesamtanthocyanine, und die Gesamtrückgewinnung der Anthocyanine betrug 95%.
  • Beispiel 5: Reinigung eines angereicherten Blaubeerenextrakts
  • In diesem Beispiel wurden Portionen eines angereicherten Blaubeerenextrakts mit 18 Gew.-% Gesamtanthocyaninen, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, entweder durch ein starkes oder ein schwaches Anionenaustauschharz geleitet, um restliche Säuren zu entfernen, um die Reinheit des angereicherten Extrakts zu erhöhen.
  • Ungefähr 1,0 g des angereicherten Blaubeerenextrakts wurden in 50 ml Wasser gelöst und durch eine 9 ml-Säule geleitet, die entweder ein starkes Anionenaustauschharz (Super Q-650M; TosoHaas; Montgomery, PA) oder ein schwaches Anionenaustauschharz (DEM-63; Whatman) enthielt. Die Säule wurde mit 30–35 ml Wasser gewaschen. Im Fall der Säule mit dem starken Anionenaustauschharz wurde das Harz mit 25 ml von 20%igem Ethanol und anschließend mit 40%igem Ethanol weiter gewaschen. Die von der Säule mit dem starken Anionenaustauschharz isolierte Zusammensetzung enthielt 28,3 Gew.-% Gesamtanthocyanine und die Rückgewinnung betrug 88%. Die von der Säule mit dem schwachen Anionenaustauschharz isolierte Zusammensetzung enthielt 30,6 Gew.-% Gesamtanthocyanine und die Rückgewinnung betrug 88%.
  • Beispiel 6: Angereicherte Extrakte aus Heidelbeerenbiomasse unter Verwendung einer Pektinasebehandlung
  • Zu 1024 g gefrorenen Heidelbeeren wurden 548 g warmes Wasser zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Mischer püriert und anschließend auf 40°C erwärmt. Danach wurden 150 μl Pektinase (Quest Super 7x) für eine 30 Minuten-Behandlung bei 40°C unter Rühren zugegeben. Annähernd 4 ml Schwefelsäure wurden in die Aufschlämmung hineingemischt, um eine Säurekonzentration von 0,5% zu erzielen. Das Gemisch wurde dann auf 45°C erwärmt und 15 Minuten unter sehr langsamem Rühren extrahiert. Zu dem extrahierten Gemisch wurden 164 g Dicalite zugegeben, welches dann über ein 26 g-Dicalite-Bett filtriert wurde. Der Kuchen wurde dreimal mit 400 ml warmer 0,1%iger wässriger Schwefelsäure gewaschen. Dieser Extrakt wurde durch ein 25 μm-Druckfilter filtriert. Der gesamte filtrierte Extrakt (2,4 l) wurde auf eine SP-207-Säule (0,96 m, 170 ml) aufgegeben. Nach der Aufgabe wurde die Säule mit 0,1%iger wässriger Essigsäure gewaschen und anschließend mit 70%igem wässrigem Ethanol eluiert. Das Säulenprodukt wurde zur Trockne eingedampft und dann 48 Stunden lang in einen Lyophilisator gegeben. Das Endprodukt wurde durch eine spektralfotometrische Standardbestimmung der Extinktion bei 535 nm im Hinblick auf die Gesamtanthocyanine getestet. Durch den Test wurde festgestellt, dass der gereinigte Heidelbeerenextrakt eine auf das Gewicht bezogene Reinheit von 40% Gesamtanthocyaninen enthielt. Die Gesamtrückgewinnung betrug ungefähr 79% für die Anthocyanine.

Claims (60)

  1. Verfahren zum Herstellen einer mit Anthocyaninen angereicherten Zusammensetzung, umfassend: a) Bereitstellen eines Rohextrakts aus einem Pflanzenmaterial, wobei das Pflanzenmaterial Anthocyanine enthält; b) Filtrieren des Rohextrakts; c) Inkontaktbringen des Rohextrakts mit einem bromierten Polystyrolharz, wobei das Harz die Anthocyanine adsorbiert; d) Waschen des Harzes; und e) Eluieren der Anthocyanine von dem bromierten Polystyrolharz, um eine mit Anthocyaninen angereicherte Zusammensetzung zu erhalten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung wenigstens 8% Anthocyanine umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung zwischen ungefähr 8–40% Anthocyanine umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung ungefähr 25% Anthocyanine umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung außerdem Proanthocyanine umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung wenigstens 5% Proanthocyanine umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung außerdem Gesamtphenole umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung wenigstens 20% Gesamtphenole umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rohextrakt durch Extrahieren eines getrockneten oder frischen Pflanzenmaterials mit einem angesäuerten Extraktionslösungsmittel hergestellt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das angesäuerte Extraktionslösungsmittel eine wässrige Lösung mit zwischen ungefähr 0–95% Ethanol und zwischen ungefähr 0,5–3% Säure umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Säure Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das angesäuerte Extraktionslösungsmittel eine wässrige Lösung mit zwischen ungefähr 0–100% Methanol und zwischen ungefähr 0,5–3% Säure umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Säure Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Filtrieren das Hinzufügen eines Filterhilfsmittels zu dem Rohextrakt zum Bilden einer Suspension und das Filtrieren der Suspension durch ein Bett aus dem Filterhilfsmittel umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Filterhilfsmittel Diatomeenerde oder Cellulose ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Filtrieren das Leiten des Rohextrakts durch ein Sackfilter umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Harz mit Wasser gewaschen wird, das wenigstens 0,1% Säure enthält.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Säure Essigsäure ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anthocyanine von dem bromierten Polystyrolharz mit 70 : 30 Ethanol/Wasser eluiert werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Blaubeeren, Heidelbeeren, Brombeeren, Erdbeeren, roten Johannisbeeren, schwarzen Johannisbeeren, Moosbeeren bzw. Preiselbeeren (cranberries), Kirschen, Himbeeren, Weintrauben, Korinthen, Holunderbeeren, Hibiskusblüten, Gemüsepaprika, Rotkohl, Purpurmais (purple corn) und violetten Süßkartoffeln.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei sich bei dem Pflanzenmaterial um Heidelbeeren handelt.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Pflanzenmaterial um Blaubeeren handelt.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Leiten der in Schritt (e) isolierten Zusammensetzung durch eine Anionenaustauschsäule.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung außerdem mit einem Exzipiens kombiniert wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Exzipiens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Konservierungsmitteln, Trägern, Puffersubstanzen, Verdickungsmitteln, Suspendiermitteln, Stabilisiermitteln, Netzmitteln, Emulgiermitteln, Färbemitteln und Aromastoffen.
  26. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rohextrakt von Schritt (a) außerdem Pektinase umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Pektinase in einer Menge zwischen ungefähr 0 und 0,12 Gew.-% des Pflanzenmaterials vorhanden ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zum Behandeln von Menschen und Säugern brauchbar ist.
  29. Verfahren zum Herstellen einer mit Anthocyaninen angereicherten Zusammensetzung, umfassend: a) Bereitstellen eines Rohextrakts aus einem Pflanzenmaterial, wobei das Pflanzenmaterial Anthocyanine zusätzlich zu Flavonoidglycosiden, Pflanzensterolen, Fettsäuren, Triglyceriden und anderen Verunreinigungen enthält, welche polarer sind als die Anthocyanine; b) Filtrieren des Rohextrakts; c) Zugeben eines Ausgangsmaterials für Bisulfitionen zu dem filtrierten Rohextrakt, um einen sulfitierten Extrakt zu bilden, der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte umfasst; d) Inkontaktbringen des sulfitierten Extrakts mit einem ersten Harz, das die Flavonoidglycoside, Pflanzensterole, Fettsäuren und Triglyceride adsorbieren kann; e) Eluieren der Anthocyanin-Bisulfit-Addukte von dem ersten Harz zusammen mit den polareren Verunreinigungen, um ein erstes Produkt zu bilden, das die Anthocyanin-Bisulfit-Addukte enthält; f) Ansäuern des ersten Produkts, wodurch die Anthocyanin-Bisulfit-Addukte gespalten werden, so dass nicht-komplexierte Anthocyanine erhalten werden; g) Inkontaktbringen der angesäuerten Lösung von Schritt (f) mit einem bromierten Polystyrolharz, wobei das Harz die nicht-komplexierten Anthocyanine adsorbiert; h) Waschen des bromierten Polystyrolharzes, um die polareren Verunreinigungen zu entfernen; und i) Eluieren der Anthocyanine von dem bromierten Polystyrolharz, um eine mit Anthocyaninen angereicherte Zusammensetzung zu erhalten.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung wenigstens 8% Anthocyanine umfasst.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung zwischen ungefähr 8–55% Anthocyanine umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung ungefähr 25% Anthocyanine umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Rohextrakt durch Extrahieren eines getrockneten oder frischen Pflanzenmaterials mit einem Extraktionslösungsmittel hergestellt wird.
  34. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Extraktionslösungsmittel eine Lösung umfasst, die ungefähr 0–95% Ethanol in Wasser enthält.
  35. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Extraktionslösungsmittel eine Lösung umfasst, die ungefähr 0–100% Methanol in Wasser enthält.
  36. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Filtrieren das Zugeben eines Filterhilfsmittels zu dem Rohextrakt zum Bilden einer Suspension und das Filtrieren der Suspension durch ein Bett aus dem Filterhilfsmittel umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Filterhilfsmittel Diatomeenerde oder Cellulose ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Ausgangsmaterial für Bisulfitionen Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit oder schweflige Säure ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das erste Harz ein Umkehrphasenharz ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Umkehrphasenharz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polymethacrylat, Styrol, Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Alkylvinylbenzol, Acrylvinylbenzol und Methylmethacrylat.
  41. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Anthocyanin-Bisulfit-Addukte von dem ersten Harz mit Wasser eluiert werden.
  42. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das erste Produkt in Schritt (f) auf pH 1,0–1,25 angesäuert wird.
  43. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Anthocyanine von dem bromierten Polystyrolharz mit 70 : 30 Ethanol/Wasser eluiert werden.
  44. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Pflanzenmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blaubeeren, Heidelbeeren, Brombeeren, Erdbeeren, roten Johannisbeeren, schwarzen Johannisbeeren, Moosbeeren bzw. Preiselbeeren, Kirschen, Himbeeren, Weintrauben, Korinthen, Holunderbeeren, Hibiskusblüten, Gemüsepaprika, Rotkohl, Purpurmais und violetten Süßkartoffeln.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei es sich bei dem Pflanzenmaterial um Heidelbeeren handelt.
  46. Verfahren nach Anspruch 44, wobei es sich bei dem Pflanzenmaterial um Blaubeeren handelt.
  47. Verfahren nach Anspruch 29, außerdem umfassend das Leiten der in Schritt (i) isolierten Zusammensetzung durch eine Anionenaustauschsäule.
  48. Verfahren nach Anspruch 29, außerdem umfassend das Kombinieren der Zusammensetzung mit einem Exzipiens.
  49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Exzipiens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Konservierungsmitteln, Trägern, Puffersubstanzen, Verdickungsmit teln, Suspendiermitteln, Stabilisiermitteln, Netzmitteln, Emulgiermitteln, Färbemitteln und Aromastoffen.
  50. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Rohextrakt aus Schritt (a) außerdem Pektinase umfasst.
  51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei die Pektinase in einer Menge zwischen ungefähr 0 und 0,12 Gew.-% des Pflanzenmaterials vorhanden ist.
  52. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung zum Behandeln von Menschen und Säugern brauchbar ist.
  53. Gereinigter Blaubeerenextrakt, der mit Anthocyaninen angereichert und gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt ist.
  54. Blaubeerenextrakt nach Anspruch 53, wobei der Extrakt zwischen ungefähr 8–35% Anthocyanine, bezogen auf das Gewicht des Extrakts, umfasst.
  55. Gereinigter Heidelbeerenextrakt, der mit Anthocyaninen angereichert und gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt ist.
  56. Heidelbeerenextrakt nach Anspruch 55, wobei der Extrakt ungefähr 8–50% Anthocyanine, bezogen auf das Gewicht des Extrakts, umfasst.
  57. Heidelbeerenextrakt, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Extrakt 3,3% Delphinidin-3-O-galactosid, 3,9% Delphinidin-3-O-glucosid, 2,1% Cyanidin-3-O-galactosid, 2,6% Delphinidin-3-O-arabinosid, 2,8% Cyanidin-3-O-glucosid, 1,0% Petunidin-3-O-galactosid, 2,5% Petunidin-3-O-glucosid, 1,7% Cyanidin-3-O-arabinosid, 0,3% Peonidin-3-O-galactosid, 0,8% Petunidin-3-O-arabinosid, 2,1% Malvidin-3-O-galactosid/Peonidin-3-O-glucosid, 2,5% Malvidin-3-O-glucosid, 0,1% Peonidin-3-O-arabinose und 0,6% Malvidin-3-O-arabinose umfasst.
  58. Zusammensetzung, umfassend den Blaubeerenextrakt nach Anspruch 53 oder 54 oder den Heidelbeerenextrakt nach Anspruch 55 oder 56, außerdem umfassend ein Exzipiens.
  59. Zusammensetzung nach Anspruch 58, wobei das Exzipiens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Konservierungsmitteln, Trägern, Puffersubstanzen, Verdickungsmitteln, Suspendiermitteln, Stabilisiermitteln, Netzmitteln, Emulgiermitteln, Färbemitteln und Aromastoffen.
  60. Verwendung des gereinigten Extrakts nach einem der Ansprüche 53 bis 56 zum Herstellen eines Medikaments zum Verbessern der Sehschärfe, zum Behandeln von Kreislaufstörungen, Diabetes, Geschwüren oder zum Behandeln von entzündlichen, viralen oder mikrobiellen Erkrankungen.
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