CN108567807A - 黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及黑果小檗花色苷提取技术领域，是一种黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法，该黑果小檗总花色苷提取物按照下述方法得到：将黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取、过滤后，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，用缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到总花色苷稀释液，将总花色苷稀释液通过大孔树脂吸附后，用蒸馏水洗涤该树脂后并抽干，向抽干树脂中加入乙醇溶液洗脱后，浓缩干燥后得到黑果小檗总花色苷提取物。本发明通过采用XDA‑7A型大孔吸附树脂对黑果小檗花色苷进行提纯，具有操作简便，成本低、工艺稳定的特点，提高了所得到的黑果小檗总花色苷提取物的纯度和色价。

Description

黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法
技术领域
本发明涉及黑果小檗花色苷提取技术领域，是一种黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法。
背景技术
黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk.)是小檗科小檗属灌木植物，主要分布在新疆维吾尔族自治区，资源丰富，是一种药食两用植物，其成熟果实中含有丰富的花色苷类化合物。花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的黄酮多酚类化合物，具有抗自由基、预防心血管疾病、抗肿瘤等多种生理功能，在药品、食品以及化妆品等领域具有广阔的应用前景。
花色苷类化合物的分离纯化的方法有大孔吸附色谱法，聚酰胺色谱法，凝胶色谱法，离子交换色谱法，高速逆流色谱法，膜分离法等。其中，大孔吸附色谱法效率高、成本低，并且大孔树脂具有物化稳定性高、吸附选择性强、再生简便及使用周期长等优点，故常被应用于花色苷类化合物的分离纯化。虽然有关花色苷类化合物的纯化分离已有大量报道，而大多是对其提取方法及稳定性的考察，对于黑果小檗总花色苷的纯化研究较少，同时报道的纯化分离方法中，所得到的黑果小檗总花色苷纯度较低，色价不高。
发明内容
本发明提供了一种黑果小檗总花色苷提取物及其纯化分离方法，克服了上述现有技术之不足，通过采用XDA-7A型大孔吸附树脂对黑果小檗花色苷进行提纯，其能有效解决现有提取方法得到的黑果小檗总花色苷提取物纯度低、色价不高的的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种黑果小檗总花色苷提取物，按下述方法得到：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0至5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0至3.0、质量浓度为0.1mg/mL至1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min至3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min至3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0至3.0，体积百分比浓度为20％至95％。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述提取时用的含酸乙醇溶液的体积百分比浓度为60％至80％，含酸乙醇溶液所含的酸为盐酸，盐酸的体积百分比浓度为0.8％，每次提取时间为20min至30min；或/和，大孔树脂为NKA-9大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、XDA-6大孔树脂、XDA-7A大孔树脂、D101大孔树脂、XAD-16大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂中的一种。
上述滤液旋蒸时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃；或/和，乙醇洗脱液旋蒸浓缩时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃。
上述缓冲溶液为盐酸-氯化钾缓冲液和醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。
上述黑果小檗果实浆液用含酸乙醇溶液提取时，采用超声提取，超声提取的频率为3KHz。
上述乙醇溶液洗脱抽干树脂时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
上述大孔树脂吸附总花色苷稀释液时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
上述乙醇洗脱液冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃。
上述大孔树脂的预处理过程为：第一步，用体积百分比浓度为95％的乙醇溶液浸泡大孔树脂24h后，将大孔树脂湿法装柱；第二步，乙醇溶液第一次洗涤大孔树脂，至洗涤液与水混合不产生白色浑浊时，用蒸馏水第二次洗涤大孔树脂，至洗涤液无乙醇味；第三步，用体积百分比为2％的氢氧化钠溶液第三次洗涤无乙醇味的大孔树脂后，用蒸馏水第四次洗涤大孔树脂，至洗涤水的酸碱度为中性时，用体积百分比为5％的盐酸溶液第五次洗涤大孔树脂，其中，大孔树脂与氢氧化钠溶液的体积比为1:4，大孔树脂与盐酸溶液的体积比为1:4；第四步，盐酸溶液洗涤后的大孔树脂，用蒸馏水洗涤至洗涤液酸碱度为中性时，将洗涤后的大孔树脂置于体积百分比为95％的乙醇溶液中得到预处理后的大孔树脂。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种黑果小檗总花色苷提取物的纯化分离方法，按照下述步骤进行：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0至5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0至3.0、质量浓度为0.1mg/mL至1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min至3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min至3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0至3.0，体积百分比浓度为20％至95％。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述提取时用的含酸乙醇溶液的体积百分比浓度为60％至80％，含酸乙醇溶液所含的酸为盐酸，盐酸的体积百分比浓度为0.8％，每次提取时间为20min至30min；或/和，大孔树脂为NKA-9大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、XDA-6大孔树脂、XDA-7A大孔树脂、D101大孔树脂、XAD-16大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂中的一种。
上述滤液旋蒸时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃；或/和，乙醇洗脱液旋蒸浓缩时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃。
上述缓冲溶液为盐酸-氯化钾缓冲液和醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。
上述黑果小檗果实浆液用含酸乙醇溶液提取时，采用超声提取，超声提取的频率为3KHz。
上述乙醇溶液洗脱抽干树脂时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
上述大孔树脂吸附总花色苷稀释液时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
上述乙醇洗脱液冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃。
上述大孔树脂的预处理过程为：第一步，用体积百分比浓度为95％的乙醇溶液浸泡大孔树脂24h后，将大孔树脂湿法装柱；第二步，乙醇溶液第一次洗涤大孔树脂，至洗涤液与水混合不产生白色浑浊时，用蒸馏水第二次洗涤大孔树脂，至洗涤液无乙醇味；第三步，用体积百分比为2％的氢氧化钠溶液第三次洗涤无乙醇味的大孔树脂后，用蒸馏水第四次洗涤大孔树脂，至洗涤水的酸碱度为中性时，用体积百分比为5％的盐酸溶液第五次洗涤大孔树脂，其中，大孔树脂与氢氧化钠溶液的体积比为1:4，大孔树脂与盐酸溶液的体积比为1:4；第四步，盐酸溶液洗涤后的大孔树脂，用蒸馏水洗涤至洗涤液酸碱度为中性时，将洗涤后的大孔树脂置于体积百分比为95％的乙醇溶液中得到预处理后的大孔树脂。
本发明通过采用XDA-7型大孔吸附树脂对黑果小檗花色苷进行提纯，具有操作简便，成本低、工艺稳定的特点，提高了所得到的黑果小檗总花色苷提取物的纯度和色价。
附图说明
附图1为黑果小檗总花色苷吸收光谱图。
附图2为静态吸附动力学曲线图。
附图3为静态解析动力学曲线图。
附图4为泄露曲线图。
附图5为上样液质量浓度对转移率的影响曲线图。
附图6为上样流速对转移率的影响曲线图。
附图7为上样液pH值对转移率的影响曲线图。
附图8为乙醇浓度对转移率的影响曲线图。
附图9为洗脱流速对转移率的影响曲线图。
附图10为洗脱液pH值对转移率的影响曲线图。
附图11为洗脱曲线图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该黑果小檗总花色苷提取物，按下述方法得到：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0至5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0至3.0、质量浓度为0.1mg/mL至1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min至3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min至3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0至3.0，体积百分比浓度为20％至95％。
实施例2：该黑果小檗总花色苷提取物，按下述方法得到：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0或5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0或3.0、质量浓度为0.1mg/mL或1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min或3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min或3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0或3.0，体积百分比浓度为20％或95％。
实施例3：作为上述实施例的优化，提取时用的含酸乙醇溶液的体积百分比浓度为60％至80％，含酸乙醇溶液所含的酸为盐酸，盐酸的体积百分比浓度为0.8％，每次提取时间为20min至30min；或/和，大孔树脂为NKA-9大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、XDA-6大孔树脂、XDA-7A大孔树脂、D101大孔树脂、XAD-16大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂中的一种。
实施例4：作为上述实施例的优化，滤液旋蒸时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃；或/和，乙醇洗脱液旋蒸浓缩时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃。
实施例5：作为上述实施例的优化，缓冲溶液为盐酸-氯化钾缓冲液和醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。
实施例6：作为上述实施例的优化，黑果小檗果实浆液用含酸乙醇溶液提取时，采用超声提取，超声提取的频率为3KHz。
实施例7：作为上述实施例的优化，乙醇溶液洗脱抽干树脂时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
实施例8：作为上述实施例的优化，大孔树脂吸附总花色苷稀释液时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
实施例9：上述乙醇洗脱液冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃。
实施例10：作为上述实施例的优化，大孔树脂的预处理过程为：第一步，用体积百分比浓度为95％的乙醇溶液浸泡大孔树脂24h后，将大孔树脂湿法装柱；第二步，乙醇溶液第一次洗涤大孔树脂，至洗涤液与水混合不产生白色浑浊时，用蒸馏水第二次洗涤大孔树脂，至洗涤液无乙醇味；第三步，用体积百分比为2％的氢氧化钠溶液第三次洗涤无乙醇味的大孔树脂后，用蒸馏水第四次洗涤大孔树脂，至洗涤水的酸碱度为中性时，用体积百分比为5％的盐酸溶液第五次洗涤大孔树脂，其中，大孔树脂与氢氧化钠溶液的体积比为1:4，大孔树脂与盐酸溶液的体积比为1:4；第四步，盐酸溶液洗涤后的大孔树脂，用蒸馏水洗涤至洗涤液酸碱度为中性时，将洗涤后的大孔树脂置于体积百分比为95％的乙醇溶液中得到预处理后的大孔树脂。
本发明中，通过对上述大孔树脂筛选，XDA-7A大孔树脂为最佳型号。
为维持总花色苷的稳定性，在提取纯化以及含量测定过程中，应保持总花色苷溶液为酸性，将提取液及纯化物于冰箱中低温避光储存，除此之外，XDA-7A大孔树脂为弱极性树脂，其对黑果小檗总花色苷具有较好的分离纯化效果。
树脂极性是影响树脂吸附性能的主要因素，通常极性大小是由分子中糖基等极性基团与烷基、苯环、环烷母核等非极性基团的数量和大小决定。大孔树脂吸附时，非极性物质在极性介质(水)内被非极性吸附剂吸附，极性物质在非极性介质中被极性吸附剂吸附，带强极性基团的吸附剂在非极性溶剂里能很好的吸附极性化合物，故实际生产中需要依据被分离物质的特性选择合适的树脂。
实施例11：该黑果小檗总花色苷提取物，按下述方法得到：第一步，在室温条件下，将10g的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0、质量浓度为0.2339mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将50ml的总花色苷稀释液，以2mL/min的流速通过1g预处理后的XDA-7A型大孔树脂，XDA-7A型大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的XDA-7A型大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤该树脂后并抽干；第四步，将50mL的乙醇溶液加入到抽干的XDA-7A型大孔树脂中，以2mL/min的流速对抽干的XDA-7A型大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0，体积百分比浓度为50％。
本发明上述实施例中各工艺参数的优选按下述进行：
1试验仪器与材料
1.1仪器
yp3002N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)；JYL-C022E九阳料理机；AS10200AD超声波清洗器；RE5220旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；754型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；TGL-16M台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-88水浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂)。
1.2材料
药材新鲜黑果小檗果实采自新疆乌鲁木齐南山，置于-20℃冰箱中低温避光储存备用，经由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所贾晓光研究员鉴定为小檗科小檗属黑果小檗的果实。大孔吸附树脂(NKA-9、X-5、AB-8、HPD-100、HPD-300、XDA-6、XDA-7、D101，陕西乐博生化科技有限公司)；(XAD-16、XAD-7HP，美国罗门哈斯公司)。其他试剂均为市售分析纯。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品(批号：R24N7F25521，上海源叶生物科技有限公司)。
2方法
2.1黑果小檗总花色苷提取液的制备
称取一定量的黑果小檗果实，经料理机匀浆后置避光锥形瓶中，以70％乙醇(含0.8％HCL，V/V)为提取溶剂，料液比为1:25(g:mL)，室温超声提取3次，每次20min，过滤后合并滤液，旋蒸得到浓缩液，置于-20℃冰箱中低温避光储存，备用。
2.2黑果小檗总花色苷吸收光谱的测定
取2mL上述浓缩液分别于2支离心管中，12000r/min，离心5min，取上清液0.1mL于10mL棕色容量瓶中，平行2份，分别用pH1.0缓冲溶液和pH4.5缓冲溶液定容至刻度，平衡10分钟后，用紫外-可见分光光计在200nm至800nm进行全波长扫描，结果如图1，在可见光区范围内，确定黑果小檗总花色苷在PH1.0缓冲溶液中的最大吸收波长为515nm，而在PH4.5缓冲溶液中，溶液无色，在515nm处无最大吸收。同法检测，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品的最大吸收波长为515nm，故选择515nm为检测波长。其中，pH1.0缓冲溶液：0.2mol/LKCL-0.2mol/LHCL(25:67)；pH4.5缓冲溶液:1mol/L醋酸钠-1mol/L醋酸。
2.3对照品溶液的制备
精密称定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品11.1mg，置于50mL棕色容量瓶中，用酸性甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.2220mg/mL的对照品溶液。
2.4标准曲线的制备
精密吸取上述对照品溶液0.10mL、0.30mL、0.50mL、0.70mL、0.90mL分别于5个10mL棕色容量瓶中，各平行两份，分别用pH1.0缓冲溶液和pH4.5缓冲溶液定容至刻度，于515nm和700nm处测定pH1.0和pH4.5条件下的吸光度值A。以总花色苷浓度C(mg/mL)为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，制作标准曲线方程：Y＝42.0946X+0.0012(r＝1)；线性范围：2.22μg/mL至19.98μg/mL；精密度：RSD＝0.11％；稳定性：RSD＝0.56％；重复性：RSD＝0.47％；加样回收率：102.90％，RSD＝1.04％。
3公式计算
3.1采用pH示差法测定总花色苷吸光度值
A＝(A515-A700)pH1.0－(A515-A700)pH4.5
3.2总花色苷色价的测定
精密称定纯化后的黑果小檗总花色苷冷冻干燥粉末0.0215g，用pH3.0的盐酸溶液溶解，转移至100mL棕色容量瓶后定容至刻度，取1cm的比色皿，在波长515nm下测定吸光度值A，计算色价的公式为：
E＝A×f/m
式中：E为色价；A为溶液的吸光度；f为稀释倍数；m为样品的质量(g)。
3.3总花色苷纯度的测定
精密称定纯化后的黑果小檗总花色苷冷冻干燥粉末0.0215g，用酸性甲醇溶解后，置于50mL棕色容量瓶后定容至刻度，从中吸取一定体积平行2份，分别用pH1.0缓冲溶液和pH4.5缓冲溶液稀释相同倍数，于515nm和700nm处分别测定pH1.0和pH4.5条件下的吸光度值A，则：
纯度(％)＝C×V/m×100％
式中：C为溶液的质量浓度(mg/mL)；V为溶液的体积(mL)；m为样品的质量(g)。
4静态吸附实验
4.1树脂预处理
10种大孔树脂分别用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后湿法装柱。用95％乙醇洗至流出液与适量水不产生白色浑浊为止后，用蒸馏水洗至无醇味。用相对于树脂4倍体积(4BV)的2％NaOH溶液洗涤，用蒸馏水冲洗至流出液为中性，继续用4BV的5％HCL溶液洗涤后，用蒸馏水冲洗至流出液为中性，树脂置于95％乙醇中备用。
4.2大孔树脂的筛选
本研究考察XNKA-9大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、XDA-6大孔树脂、XDA-7大孔树脂、D101大孔树脂、XAD-16大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂等10种大孔树脂对花色苷的吸附解析情况，如表1。用pH1.0缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液到一定浓度，波长515nm处测其吸光度值A0。精密称定预处理后大孔树脂各1g，分别置于100mL具塞锥形瓶中，各加入50mL上述稀释后的浓缩液，置恒温振荡器上25℃，135r/min振荡24h，充分吸附后，过滤树脂，测滤液吸光度值A1。用蒸馏水洗涤吸附饱和后的树脂，抽干后，向滤出的树脂中加入50mLpH2.0的95％乙醇溶液，25℃，135r/min振荡24h，充分解吸后，分别检测解析液的吸光度值A2，通过以下公式计算大孔树脂的吸附率α和解吸率β，作为选择最佳大孔树脂的指标，结果如表1所示。通过表1可知，XDA-7大孔树脂的吸附率和解析率都较高，因此，选择XDA-7大孔树脂为最佳型号。
α＝(C0-C1)/C0×100％
β＝C2/(C0-C1)×100％
转移率(％)＝C2V2/C0V0×100％
式中：C0为上样吸附前溶液的质量浓度(mg/mL)；C1为上样吸附后流出液的质量浓度(mg/mL)；C2为解析液的质量浓度(mg/mL)；V0为上样吸附前溶液的体积(mL)；V2为解析液的体积(mL)。
4.3总花色苷在XDA-7A大孔树脂上吸附平衡时间的测定
用pH1.0缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，波长515nm处测其吸光值A0，精密称取预处理树脂1g置于100mL具塞锥形瓶中，取上述溶液50mL加入其中，置恒温振荡器上25℃，135r/min震荡，每隔30min取样测溶液的吸光度值A1，以吸附率α-时间t作图，绘制静态吸附动力学曲线图，如图2所示。由图2可知，起始的3h内曲线趋势快速上升，之后随着时间的延长，上升趋势逐渐缓慢，吸附11h后，树脂对总花色苷的吸附基本达到平衡状态，故XDA-7A大孔树脂对总花色苷吸附平衡的时间至少为11h。
4.4总花色苷在XDA-7A大孔树脂上解析平衡时间的测定
过滤上述吸附饱和后的树脂，加入pH2.0的95％乙醇溶液50mL，置振荡器上25℃，135r/min，每30min取样测定溶液的吸光度值A2，以解吸率β-时间t作图，绘制静态解吸动力学曲线图，如图3所示。由图3可知，在起始的一段时间内，总花色苷的解析率急剧增加，当解析时间超过5h后，解析率几乎不变，因此，解析平衡时间至少要5h。
5动态吸附实验
5.1泄露曲线的绘制
用pH1.0缓冲溶液配制质量浓度为0.4033mg/mL花色苷溶液，通过预处理好的10gXDA-7A大孔树脂柱，以1mL/min的流速进行上样吸附，每18mL分段收集流出液，分别于515nm下检测各段的吸光度值，计算其质量浓度，以柱体积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制泄露曲线图，如图4所示。由图4可知，泄漏曲线起始段上升趋势平缓，当流出液体积为第18个柱体积时，曲线趋势急剧上升，表明已经开始出现泄露，故上样液体积最多为17BV，XDA-7A大孔树脂的最大上样量为12.34mg/g。
5.2上样液质量浓度的选择
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行5根，用pH1.0缓冲溶液配制质量浓度分别为0.1169、0.2339、0.4683、0.9396、1.4479mg/mL的花色苷溶液，于515nm下分别测定吸光度值A0，以1mL/min的流速分别进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，加入pH2.0的95％乙醇以1mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图5所示。由图5可知，随着上样液质量浓度的增加，转移率先增加后减小，浓度为0.4683mg/mL时转移率最大,故最佳上样液质量浓度为0.4683mg/mL。
5.3上样流速的确定
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行3根，用pH1.0的缓冲溶液配制质量浓度为0.4683mg/mL的花色苷溶液，于515nm下测定其吸光度值A0，分别以1、2、3mL/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，加入pH2.0的95％乙醇以1mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图6所示。大孔树脂的吸附过程是动态的，上样液的流速不同影响着花色苷分子向树脂内部的扩散，若上样流速过快，部分花色苷分子还未被树脂吸附完全，就随着流出液流出，发生泄露，转移率降低。若上样流速过慢，耗时耗力，效率不高。由图6可知，上样流速在2mL/min时，转移率较高，吸附效果较好。
5.4上样液pH的确定
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行3根，分别配制pH1.0、pH2.0、pH3.0的质量浓度为0.4683mg/mL的花色苷溶液，于515nm下测定其吸光度值A0，以2mL/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，加入pH2.0的95％乙醇以1mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图7所示。由图7可知，随着pH值的增大，转移率逐渐减小，pH1.0上样液的转移率较大。这可能是由于随着pH值的逐渐增加，花色苷存在的4种结构形式的比例不同而造成差异，从而影响了树脂对其吸附力。花色苷在在低pH下主要以稳定的黄烊盐形式存在，颜色为红色。pH为2-4时，花色苷主要以醌式结构存在，此时颜色为蓝色。pH为5-6时，羟基进攻C2位，形成半缩醛化合物假碱，由于半缩醛化合物的不稳定性，假碱进而转变为查尔酮形式化合物，假碱和查尔酮都为无色。
5.5洗脱液乙醇浓度的确定
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行5根，用pH1.0的缓冲溶液配制质量浓度为0.4683mg/mL的花色苷溶液，于515nm下测定其吸光度值A0，以2ml/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，分别用pH2.0的20％、30％、50％、70％、95％乙醇以1mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图8所示。由图8可知，当乙醇浓度大于50％时，转移率波动不大，故选择最佳乙醇浓度为50％。
5.6洗脱流速的确定
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行5根，用pH1.0的缓冲溶液配制质量浓度为0.4683mg/mL的花色苷溶液，于515nm下测定其吸光度值A0，以2ml/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，分别控制流速为1、2、3mL/min用pH2.0的50％乙醇分别进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图9所示。由图9可知，当流速为2ml/min时，转移率较大。
5.7洗脱液pH值的确定
取已处理好大孔树脂5g装柱，平行3根，用pH1.0的缓冲液配制质量浓度为0.4683mg/mL的花色苷溶液，于515nm下测定其吸光度值A0，以2ml/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，分别配制pH1.0、pH2.0、pH3.0的50％乙醇以2ml/mL的速度分别进行洗脱，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值A2，计算转移率，结果如图10所示。由图10可知，当50％乙醇的pH为1.0时，转移率较大。
5.8洗脱曲线的绘制
用pH1.0缓冲液配制质量浓度为0.4683mg/mL花色苷溶液，以2ml/min的流速进行上样吸附，吸附完毕后用蒸馏水洗至流出液无色，然后用pH1.0的50％乙醇溶液以2ml/min的流速进行洗脱，每0.5个柱体积分段收集流出液，分别于515nm下检测各段的吸光度值，计算其质量浓度，以柱体积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线图，如图11所示。由图11可知，洗至第6BV时，洗脱液已将绝大多数的总花色苷洗脱下来，继续洗脱，洗脱液的质量浓度几乎不再变化，且可忽略不计，故可认为在进行洗脱时，6BV即可洗脱完全。
6正交试验设计
在单因素的基础上，以总花色苷的转移率为考察指标，选择上样液质量浓度、上样流速、乙醇浓度为3个考察因素，每因素设计3水平如表2所示，按L9(34)进行正交试验设计，收集洗脱液，于515nm下分别测定吸光度值，计算转移率。试验安排及结果如表3所示，方差分析表如表4所示。
根据表2、表3、表4分析可知，各因素对黑果小檗总花色苷转移率影响的程度大小依次为：C＞A＞B。分别对各因素进行方差分析，其结果表明，因素A、B、C对黑果小檗总花色苷转移率的影响具有显著性，综合考虑优选出最佳条件为:A1B2C2，即上样液质量浓度为0.2339mg/mL，上样流速为2mL/min，乙醇浓度为50％。
7验证试验
取0.2339mg/mL黑果小檗总花色苷提取液3份，按照优选的最佳纯化工艺条件，分别进行上样吸附、洗脱，收集50％乙醇洗脱液，于515nm下进行检测，其平均转移率为：90.25％；平均纯度为：39.42％；平均色价为：332，表明优选的纯化工艺稳定可行。
根据以上所述，通过对黑果小檗总花色苷提取物的纯化分离方法工艺进行优化，考察了大孔树脂型号、上样液的浓度和流速以及pH、洗脱乙醇溶液的浓度和流速以及pH等重要影响因素，并对其进行研究。根据分析结果，黑果小檗总花色苷提取物提取的最佳提取工艺为：大孔树脂型号为XDA-7A、上样液的浓度为0.2339mg/mL、上样液的pH为1.0、上样液的流速为2mL/min、洗脱乙醇溶液的浓度为50％、洗脱乙醇溶液的流速为2mL/min、洗脱乙醇溶液的pH为1.0。
根据实施例11得到的黑果小檗总花色的纯度为39.42％，色价为332，而现有从黑果小檗中提取总花色苷的方法中，所得到的黑果小檗总花色苷纯度为20％至30％，色价为100至200。本发明得到的黑果小檗总花色苷提取物的纯度和色价，较现有提取方法得到的黑果小檗总花色苷提取物的纯度和色价有很大的提高。
综上所述，本发明通过采用XDA-7A型大孔吸附树脂对黑果小檗花色苷进行提纯，具有操作简便，成本低、工艺稳定的特点，很大程度提高了所得到的黑果小檗总花色苷提取物的纯度和色价，更能满足现代化工业生产的要求。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。表1
树脂型号 极性 吸附率(％) 解析率(％)
NKA-9 极性 59.05％ 92.53％
X-5 非极性 73.49％ 92.07％
AB-8 弱极性 86.16％ 90.36％
HPD-100 非极性 85.71％ 90.59％
XAD-16 非极性 93.07％ 90.42％
HPD-300 非极性 86.90％ 89.84％
XAD-7HP 弱极性 69.09％ 93.85％
XDA-6 中极性 87.77％ 90.68％
XDA-7A 弱极性 96.69％ 94.66％
表2
表3
NO A B C D(空白) 转移率(％)
1 1 1 1 1 74.52
2 1 2 2 2 90.94
3 1 3 3 3 83.04
4 2 1 2 3 84.76
5 2 2 3 1 86.16
6 2 3 1 2 65.26
7 3 1 3 2 80.54
8 3 2 1 3 63.30
9 3 3 2 1 70.45
K1 82.833 79.940 67.693 77.043 -
K2 78.727 80.133 82.050 78.913 -
K3 71.430 72.917 83.247 77.033 -
R 11.403 7.216 15.554 1.880 -
表4
方差来源 SS f MS F P
A 22.142 2 28.466 19.000 ＜0.05
B 101.445 2 14.428 19.000 ＞0.05
C 449.452 2 63.924 19.000 ＜0.05
D 7.03 2 - - -

Claims (10)

1.一种黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0至5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0至3.0、质量浓度为0.1mg/mL至1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min至3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min至3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0至3.0，体积百分比浓度为20％至95％。
2.根据权利要求1所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于提取时用的含酸乙醇溶液的体积百分比浓度为60％至80％，含酸乙醇溶液所含的酸为盐酸，盐酸的体积百分比浓度为0.8％，每次提取时间为20min至30min；或/和，大孔树脂为NKA-9大孔树脂、X-5大孔树脂、AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、XDA-6大孔树脂、XDA-7A大孔树脂、D101大孔树脂、XAD-16大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于滤液旋蒸时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃；或/和，乙醇洗脱液旋蒸浓缩时，旋蒸仪的温度为30℃至40℃。
4.根据权利要求1或2或3所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于缓冲溶液为盐酸-氯化钾缓冲液和醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于黑果小檗果实浆液用含酸乙醇溶液提取时，采用超声提取，超声提取的频率为3KHz。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于大孔树脂吸附总花色苷稀释液时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于乙醇溶液洗脱抽干树脂时，在25℃的水浴中恒温振荡20小时至24小时，其中，振荡频率为135r/min。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于乙醇洗脱液冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃。
9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的黑果小檗总花色苷提取物，其特征在于大孔树脂的预处理过程为：第一步，用体积百分比浓度为95％的乙醇溶液浸泡大孔树脂24h后，将大孔树脂湿法装柱；第二步，乙醇溶液第一次洗涤大孔树脂，至洗涤液与水混合不产生白色浑浊时，用蒸馏水第二次洗涤大孔树脂，至洗涤液无乙醇味；第三步，用体积百分比为2％的氢氧化钠溶液第三次洗涤无乙醇味的大孔树脂后，用蒸馏水第四次洗涤大孔树脂，至洗涤水的酸碱度为中性时，用体积百分比为5％的盐酸溶液第五次洗涤大孔树脂，其中，大孔树脂与氢氧化钠溶液的体积比为1:4，大孔树脂与盐酸溶液的体积比为1:4；第四步，盐酸溶液洗涤后的大孔树脂，用蒸馏水洗涤至洗涤液酸碱度为中性时，将洗涤后的大孔树脂置于体积百分比为95％的乙醇溶液中得到预处理后的大孔树脂。
10.一种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的黑果小檗总花色苷提取物的纯化分离方法，其特征在于按照下述步骤进行：第一步，在室温条件下，将所需量的黑果小檗果实粉碎后取浆液，用含酸乙醇溶液提取四次，过滤，合并滤液并旋蒸得到总花色苷浓缩液，其中，黑果小檗果实浆液与含酸乙醇溶液的质量浓度之比为1:25；第二步,用pH为1.0至5.0的缓冲溶液稀释总花色苷浓缩液，得到pH为1.0至3.0、质量浓度为0.1mg/mL至1.5mg/mL的总花色苷稀释液；第三步，将总花色苷稀释液，以0.5mL/min至3mL/min的流速通过预处理后的大孔树脂，每50mL的总花色苷稀释液采用1g预处理后的大孔树脂吸附，大孔树脂吸附总花色苷稀释液后，过滤吸附总花色苷稀释液饱和后的大孔树脂，去除滤液，用蒸馏水洗涤去除滤液的大孔树脂后并抽干；第四步，将乙醇溶液加入到抽干的大孔树脂中，以1mL/min至3mL/min的流速对抽干的大孔树脂进行洗脱后，收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液旋蒸浓缩、冷冻干燥后，得到黑果小檗总花色苷提取物，其中，乙醇溶液的pH为1.0至3.0，体积百分比浓度为20％至95％。
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