CN107497409A - 一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法 - Google Patents
一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，属于含有来自植物的药物制剂技术领域。将大孔树脂以无水乙醇进行浸泡，待充分溶胀，置入层析柱中，控制使树脂层无气泡产生，取无水乙醇上柱洗脱，在洗脱液加等体积蒸馏水后洗脱液不变混后停止；再用蒸馏水洗脱树脂至其中乙醇含量小于10%；待蒸馏水流尽后，加入碱液浸泡一段时间后，用蒸馏水洗脱树脂至洗脱液呈中性，再加入酸溶液浸泡相同时间，用蒸馏水洗至中性，即可得处理好的大孔树脂，将树脂加蒸馏水浸泡于烧杯中备用。将发明应用于纯化吸附大孔树脂的制备，具有纯化效率高、多酚活性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，属于含有来自植物的药物制剂技术领域。
背景技术
咖啡酰奎宁酸类，是一种广泛存在于植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌等药理活性，由一分子的奎宁酸和多个咖啡酸通过缩合反应形成的化合物。Zhang等对24种五加属植物进行了黄酮及咖啡酸奎宁等酚类物质进行了含量测定，证实了不同产地的白簕叶中均含有丰富的咖啡酰奎宁酸多酚类物质。Kiem等首次报道了从白簕茎皮中分离得到的苯丙素糖苷类成分，分别为1-β-D-吡喃葡萄糖基-2,6-二甲氧基-4-丙炔基—烯醇(1)和1-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-2,6-二甲氧基-4-丙烯基苯酚(2)；张元对白簕不同部位多酚含量及活性研究发现，白簕叶中多酚含量高且含量最好。综上研究结果表明，在白簕植株的各个部位中均有酚类物质存在，其中黄酮和酚酸类含量相当可观，可作为进一步开发利用基础。
通过前期研究表明：五加属植物白簕叶中咖啡酰奎宁酸类多酚类化学成分群含量丰富，通过HPLC-UV法对白簕叶中多酚类成分进行定性定量分析，发现其含量达到2％。而且研究发现，近些年对于白簕多酚类化合物的研究仅限于白簕总多酚的提取工艺研究；对不同品种的白簕总多酚含量研究；以及对白簕不同部位的多酚含量及抗氧化活性比较，且其他研究并未公布于众，这也为本课题的研究提供机会。我国作为白簕主要生产国之一，深度利用这一资源研究开发白簕叶中总多酚纯化工艺对后期开发相应医药及保健品奠定科学基础，具有良好的应用前景。
在对于传统药用植物中多酚类化合物的分离和纯化，据相关文献记述，主要方法有金属离子沉淀法、柱层析法、色谱法及生物膜技术等。其中利于大孔树脂对天然植物中活性化学成分的分离和纯化分析取得了极大的进展，也有工厂中放大生产的应用。在Wu等通过利用不同类型大孔吸附树脂对枸杞中类黄酮化合物进行吸附与解吸附的研究中可以得出，D101型树脂能够将溶质中黄酮类化合物的含量从0.58％提高到10.77％。Kim等也利用大孔吸附树脂对褐藻多酚进行吸附与解吸附纯化。这些实验虽然验证了大孔树脂在分离和纯化中的作用，然而含量均在15％以下，无法真正应用到实际操作中。
基于此，做出本申请。
发明内容
本申请以五加属药食同源植物白簕作为材料，同时利用超声提取-石油醚去脂溶性成分法获得白簕叶总多酚粗提取物，然后选出适合的填充材料，从而获得白簕叶总多酚的工业化、高纯的总多酚分离纯化工艺。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，先将大孔树脂进行预处理，然后置于蒸馏水中浸泡待用，所述的预处理是指：将大孔树脂以无水乙醇进行浸泡，待充分溶胀，置入层析柱中，控制使树脂层无气泡产生，取无水乙醇上柱洗脱，在洗脱液加等体积蒸馏水后洗脱液不变混后停止；再用蒸馏水洗脱树脂至其中乙醇含量小于10％；待蒸馏水流尽后，加入碱液浸泡一段时间后，用蒸馏水洗脱树脂至洗脱液呈中性，再加入酸溶液浸泡相同时间，用蒸馏水洗至中性，即可得处理好的大孔树脂，将树脂加蒸馏水浸泡于烧杯中备用。
进一步的，作为优选：
所述的碱液为5％NaOH，其添加量为3倍大孔树脂量。
所述的酸溶液为5％HCl溶液，其添加量为3倍大孔树脂量。
所述的大孔树脂为HPD100、AB-8、D101、HPD400、HPD600中的任一种，并优选为HPD100。大孔树脂要实现良好的纯化效果，不仅要考虑其吸附能力，还要考虑其解吸能力。大孔树脂HPD100对五加属植物白簕叶中总多酚有较强的吸附效果，其吸附率达到64％，其他4种树脂的吸附率从高到低依次是AB-8、D101、HPD400、HPD600。由此可见，不同类型的树脂对于白簕叶总多酚的吸附性能各不相同。可能原因是，对于5种不同类型树脂，其内部结构、构成分子的对称性、以及多酚的溶解度等，这些情况的存在对于树脂吸附多酚能力均有不同程度的关系。而多酚由于在其分子中由酚羟基的存在，使得其分子对称性并不是很高，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。而在解吸过程中，上述五种大孔树脂对于白簕叶总多酚的解吸率都普遍较高，其中以D101树脂的解吸附效果最好，其解吸率达78.2％。而HPD100仅次之，HPD400、HPD600、AB-8再次之。整体来讲，D101型树脂对白簕叶总多酚的解吸效果最好，但吸附率却并不是最高的；而HPD100型树脂吸附率最大，解吸率也仅次于D101，达到77.9％，能够将大部分多酚洗脱下来，因此最优选使用HPD100型大孔吸附树脂作为对白簕叶中总多酚的纯化大孔树脂材料。
所述的大孔树脂用于纯化时，对应的白簕叶片总多酚粗取液浓度为0.5-10mg/mL，pH为1-6，流速1-3mL/min。更选的，所述的粗提液的浓度为1-3mg/mL，pH为2-4，流速1-2mL/min。更优选的，所述的粗提液的浓度为1.0mg/mL，pH为3，流速2mL/min。
所述的大孔树脂纯化吸附多酚后以乙醇水溶液作为脱附液，乙醇水溶液的体积浓度为10-90％，脱附液pH2-7，速度为1-3mL/min。优选的，乙醇水溶液的体积浓度为10-50％，脱附液pH4-6，速度为1-2mL/min。更优选的，所述的脱附液乙醇水溶液的体积浓度为50％，脱附液pH6，速度为2mL/min。
将上述树脂纯化吸附后脱附所得多酚样品溶解，采用DPPH法、ABTS+法对纯化前后总多酚进行抗氧化活性测定，并以VC、VE作为对照，比较其抗氧化活性，为大孔树脂纯化白簕叶总多酚作为保健品使用提供实验基础。并通过高效液相色谱法进行纯度测定，获得大孔树脂对白簕叶中各多酚组分纯化的具体情况。结果表明：采用本申请上述大孔树脂进行纯化处理后，总多酚纯度较纯化前高，由纯化前的28.76％提升到90.17％，纯化效率为3.14倍；通过DPPH、ABTS+自由基清除实验得出纯化后多酚抗氧化活性较纯化前强，因此HPD100型树脂对白簕叶多酚的纯化并没有对其结构和性质造成影响。
HPD100型大孔树脂是五种树脂中效果最好的白簕叶总多酚纯化材料。在所研究条件中，最终所得优化工艺为：取1.7cm*50cm的玻璃层析柱，加入4.0g HPD100树脂，以浓度为1.0mg/mL，pH为3.0左右的白簕叶总多酚粗提液作为上样液，同时控制其流速为2.0mL/min，上样量控制为30mL；然后以体积分数50％的乙醇水溶液洗脱，调节pH值为6.0，并控制洗脱流速为2.0mL/min，洗脱量为40mL。按照此工艺参数控制进行扩大实验，也证实白簕叶总多酚的纯化效率并不随大孔树脂数量改变而有所影响，即为HPD100型大孔树脂对白簕叶总多酚纯化的工业生产提供参考。
附图说明
图1为本申请中白簕叶总多酚纯化流程示意图；
图2为不同类型树脂对白簕叶中多酚的静态吸附率曲线；
图3为不同类型树脂对白簕叶中多酚的静态解吸率曲线；
图4为HPD100树脂对多酚的动力学吸附与解吸附曲线；
图5为上样液浓度对树脂吸附的影响趋势图；
图6为解吸液乙醇体积分数对解吸的影响趋势图；
图7为白簕叶多酚吸附液pH值与吸附率的关系对应图；
图8为乙醇溶液pH值与树脂解吸附后多酚浓度的关系对应曲线；
图9为多酚上柱速度与吸附率的关系对应曲线；
图10为解吸液流速对解吸率的影响趋势图；
图11为HPD100树脂的动态洗脱曲线；
图12为纯化前后多酚DPPH自由基清除试验(多酚浓度3mg/mL以下)；
图13为纯化前后多酚DPPH自由基清除试验(多酚浓度45mg/mL以下)；
图14为纯化前后多酚ABTS+自由基清除试验(多酚浓度3mg/mL以下)；
图15为纯化前后多酚ABTS+自由基清除试验(多酚浓度45mg/mL以下)；
图16为5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA混合标样的HPLC谱图；
图17为纯化前多酚中5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA的含量的HPLC图谱；
图18为纯化后多酚中5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA的含量的HPLC图谱；
图19为VC、VE对DPPH自由基清除实验；
图20为VC、VE对ABTS+自由基清除实验；
图21为绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸混合标样的高效液相色谱图；
图22为纯化前多酚中绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量的高效液相色谱图；
图23为纯化后多酚中绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量的高效液相色谱图。
具体实施方式
1.材料与试剂
白簕叶：采集于广东省凤凰山(干燥)，分别取细茎、叶，粉碎备用。绿原酸标准品：为实验室自制，纯度经HPLC-DAD验证达98％以上。无水乙醇，石油醚等为分析纯且均采购于国药集团化学试剂有限公司。Folin-Ciocalteu试剂为分析纯购自上海瑞永生物科技有限公司。无水碳酸钠，盐酸，氢氧化钠等为分析纯采购于高晶化工有限公司。ABTS、DPPH、VC、VE为分析纯，纯度达98％，购于上海麦克林生化科技有限公司。过硫酸钾为分析纯采购于天津市永大化学试剂有限公司。实验用水：蒸馏水，为实验室自制所得。大孔树脂AB-8、D-101、HPD100、HPD400、HPD600：购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
2.仪器与设备
旋转蒸发仪(附真空泵、水浴锅及循环冷水浴)，购买于杭州惠创仪器设备有限公司。玻璃层析柱：规格Φ1.7cm*50cm、Φ4.0cm*50cm，自上海五相仪器仪表有限公司购买。电子天平，购于赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。UV-5200紫外分光光度计，来自上海元新仪器有限公司。KQ-500DE型超声波清洗器由昆山市超声仪器有限公司出品。HPLC色谱仪，购买于沃特世科技(上海)有限公司。
3.实验方法
3.1白簕叶总多酚标准曲线绘制
式(1)、(2)、(3)、(4)分别为咖啡酰奎尼酸结构为白簕叶中主要酚酸类天然化合物，其中，式(1)为绿原酸(5-CQA)，式(2)为隐绿原酸(4-CQA)，式(3)为4,5-二咖啡酰奎宁酸(4,5-DCQA)，式(4)为3,5-二咖啡酰奎宁酸(3,5-DCQA)。对于工艺优化过程中其含量的测定本申请选择通过Folin-Ciocalteu法(Ough C S,Amerine M A.Methods for analysis ofmusts and wines[M].J.Wiley,1988:203-205)在750nm紫外下测定相关吸光度。
Folin-Ciocalteu法：分别准确量取0.025mL，0.05mL，0.100mL，0.200mL，0.400mL，0.600mL 1mg/mL的绿原酸标准品溶液，置于25mL的容量瓶中，向量好后的绿原酸溶液中加入1.25mL Folin-Ciocalteu试剂和3.75mL的20％的碳酸钠溶液，用适量蒸馏水定容至刻度。取配置好的溶液与对照组溶液一起进行紫外分光吸光度的测定，并通过所得数据绘制标准曲线。
3.2白簕叶总多酚上样液的制备
由于本实施例研究白簕叶为新鲜绿叶经干燥所得，故需要将其中多酚成分提取，而本申请所研究为保健品工艺开发，应尽量避免有毒有害试剂的使用，因此本实施例选用乙醇作为萃取试剂。因为乙醇对于大多数有机物均能溶解，进行超声能够使其中的总多酚尽可能的提取出来。但是提取所得物中会含有大量叶绿素等脂溶成分，需要去除。
超声提取—石油醚去脂法：将干燥的白簕叶粉碎，过筛，称取1kg于锥形瓶中，加入3倍白簕叶粉末体积的95％乙醇后，将锥形瓶放入超声清洗池超声(因为需要多次进行，具体超声时间可由自己安排)。一段时间后，过滤，取其中清液置于旋蒸上浓缩。同时将滤渣收集，置于锥形瓶中重复提取3～4遍，合并浓缩所得浸膏。加入适量45℃蒸馏水溶解(由于含有大量脂溶性成分，如叶绿素。如有必要，可适当超声加速溶解)，将溶液置于分液漏斗中，加入3倍量的石油醚，振荡混合，静置30min。当下层富集有多酚的水相与上层脂溶性成分较多的有机相在彻底分离(在分液漏斗中无明显界面移动)后，将下层水相从漏斗下端缓缓放出，而有机相则从上口倒出并弃去。再将水相倒入分液漏斗中，重复萃取3～4次，将所得水相合并，蒸发浓缩，并进行冷冻干燥，即得白簕叶总多酚粗提物。称取3g白簕叶总多酚提取物，超声溶解(加快溶解速率)并定容于500mL容量瓶中，制备成浓度为6mg/mL的总多酚上样液，备用。
3.3大孔树脂前处理
分别称取一定量的5种类型大孔吸附树脂于编号1～5的烧杯中，加入3～4倍于树脂体积的无水乙醇浸泡，待树脂充分溶胀。大约24h后，将树脂装于层析柱中，控制使树脂层无气泡产生，取无水乙醇上柱洗脱，在洗脱液加等体积蒸馏水后洗脱液不变混后停止，然后再用蒸馏水洗脱树脂至其中乙醇含量小于10％。待蒸馏水流尽后，加入3倍量的5％NaOH浸泡，3h后用蒸馏水洗脱树脂至洗脱液经pH计测定呈中性，再加入3倍量5％HCl溶液浸泡相同时间，用蒸馏水洗至中性，即可得处理好的大孔树脂，将树脂加蒸馏水浸泡于烧杯中备用。
3.4大孔树脂的筛选
(1)静态吸附实验
分别称取经过前处理的五种大孔树脂适量，用干净滤纸吸去表面水分。然后各取1.0g，加入到编号1～5的相同大小的带塞锥形瓶中，再加入25mL 6mg/mL的白簕叶总多酚提取液，塞上瓶塞。置于30℃，100r/min的恒温振荡器中充分振荡吸附24h，吸附结束后，取1mL上清液，按照Folin-Ciocalteu法测定吸光值。然后由绿原酸标准方程得各多酚含量，并比较分析实验结果。
Q＝(C0-C1)*V/M (5)；
W＝(C0-C1)/C0*100％ (6)；
式中：Q：吸附量，mg/g；W：吸附率，％；C0、C1：吸附前、后吸附液中多酚浓度，mg/mL；V：吸附液体积，mL；M：树脂吸去水分的重量，g。
(2)静态解吸附实验
将步骤(1)即静态吸附试验中所用树脂过滤，用蒸馏水冲洗去表面残余物质，并吸干表面水分。再置于带塞锥形瓶中，加入25mL体积分数60％的乙醇，同样在30℃，100r/min恒温振荡器中充分解吸附24h，取1mL上清液，按照3.1的方法测定其吸光度。并将得到的数据根据式(7)计算解吸率，将所得结果分析获得最优性能大孔树脂。
R＝(C2*V2)/[(C0-C1)*V1]*100％ (7)；
式中：R：解吸附率，％；C2：解吸附后多酚浓度，mg/mL；V2：解吸附后溶液体积，mL；V1：吸附多酚溶液体积，mL。
3.5大孔树脂HPD100的动力学吸附与解吸附实验
根据静态吸附实验的方法对HPD100型树脂进行白簕叶总多酚的静态吸附，并在每间隔1h吸取1mL上清液，根据3.1的方法测定吸光度，并通过绿原酸标准方程计算吸附率，并绘制吸附时间与大孔树脂吸附率的动力学吸附曲线。
如静态解吸实验的方法处理已吸附结束的树脂，并进行解吸附，同样每间隔1h取1mL上清液，根据3.1的方法测定吸光度，并计算对应时间的解吸率，根据得出的数据结果绘制动力学解吸附曲线。
3.6HPD100大孔吸附树脂对白簕叶总多酚静态吸附与解吸附试验
(1)多酚上样液浓度对吸附率的影响
分别称取经过前处理的HPD100大孔吸附树脂1.0g 8份于编号1～8的带塞锥形瓶中，依次加入浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL的上样液25mL，置于30℃，100r/min的恒温振荡器中吸附5h，并在吸附结束后，根据3.1的方法处理并计算吸附率，根据各锥形瓶中树脂的吸附率大小绘制与多酚浓度的关系曲线并分析结果。
(2)解吸附液浓度对解吸率的影响
称取经过处理的HPD100型树脂10.0g，取最佳上样浓度的白簕叶总多酚提取液250mL，置于500mL带塞锥形瓶中，与30℃，100r/min的恒温振荡器中吸附5h，将吸附结束的HPD100大孔树脂过滤，用蒸馏水洗去表面残余多酚和其他杂质化合物，吸去水分，从中分别称取1.0g 5份于编号1～5的带塞锥形瓶中，各加入25mL体积分数为10％、30％、50％、70％、90％的乙醇溶液进行解吸3h，按照3.1的方法测定其吸光度并计算解吸浓度，通过解吸液中多酚浓度的差异绘制多酚浓度与乙醇浓度的关系曲线，分析比较得出实验所需解吸浓度(即最适浓度)。
(3)多酚上样液pH对吸附率的影响
取5只带塞锥形瓶，并编号1～5，分别加入25mL浓度为1mg/mL的白簕叶总多酚上样液，通过1mol/L的盐酸溶液调节上样液pH分别为2、3、4、5、6(多酚本身呈弱酸性，因此若调节pH为7及以上，则为中和多酚，改变多酚结构并不是实验目的)。分别称取前处理过的HPD100大孔吸附树脂1.0g于各锥形瓶中，通过吸附获得上样液pH与吸附率的关系，绘制相关曲线并分析实验数据，得出最优上样液pH。
3.7HPD100大孔吸附树脂动态吸附与解吸附工艺优化
(1)上柱流速对吸附的影响
取1.7cm*50cm的玻璃层析柱固定，取适量HPD100树脂过滤，吸去表面水分，称取4.0g树脂，通过湿法上柱法上柱，轻敲柱壁，使柱内树脂平衡，打开下端阀门，控制流速使柱内蒸馏水流出，在液面距树脂约1cm时，将白簕叶总多酚上样液(浓度为1.0mg/mL，pH为3，上样量为30mL)以不同流速上柱，即1.0、2.0、3.0mL/min，同时收集下端流出液，再用蒸馏水冲洗树脂至无多酚流出，合并流出液、水洗液，通过Folin-Ciocalteu法测定吸光度并计算溶液中多酚含量，得出吸附率，绘制流速与吸附率的关系。
(2)洗脱速度对解吸的影响
与步骤(1)的上柱流速对吸附影响部分的方法相同，将白簕叶总多酚上样液(浓度为1.0mg/mL，pH为3，上样量为30mL)以2.0mL/min的流速上样，用大量蒸馏水冲洗至无多酚流出，用pH为6.0的50％的乙醇溶液分别以1.0、2.0、3.0mL/min的流速上柱洗脱。收集所流出溶液中所含白簕叶多酚含量无变化，然后根据3.1的方法测定所洗脱多酚含量，并根据公式计算树脂解吸附率，根据解吸率绘制与洗脱流速的关系曲线图，分析最优洗脱速度。
3.8动态洗脱曲线的绘制
根据上述试验所得最优纯化工艺条件，将白簕叶总多酚粗提液以试验所得最佳上样浓度、pH、上样量和最佳流速上样，用蒸馏水冲洗树脂至流出液经检测多酚含量无变化，然后用最佳pH、体积分数的乙醇溶液以试验中最优流速对层析柱内树脂进行上柱洗脱，每5mL一管分段收集流出液，将流出液按Folin-Ciocalteu法测定多酚含量，根据实验数据绘制动态洗脱曲线。并将动态洗脱所得流出液合并，浓缩干燥，得纯化后总多酚。
3.9验证实验与放大实验
(1)验证实验
由于本申请目的是为白簕叶总多酚的后续发展提供实验数据参考，需要通过验证实验确定纯化工艺的准确性，并通过放大实验确定最佳大孔树脂对白簕叶多酚的工业化生产能否实施进行必要性研究。
与动态洗脱实验相同，收集所有洗脱液，通过旋蒸得浓缩浸膏，再通过真空冷冻干燥获得纯化后白簕叶多酚并对其中多酚含量进行紫外测定。
(2)放大实验
与验证试验相同，将树脂含量扩大30倍，装于Φ4.0cm*50cm的层析柱中，轻敲柱壁使树脂表面平整。将最适pH和浓度的白簕提取液以相同速度上柱，上样量为900mL。利用相同方法收集洗脱液，旋蒸浓缩，再通过真空冷冻干燥获得扩大试验所得总多酚并对其多酚含量进行紫外测定。
3.10纯化前后白簕叶总多酚抗氧化活性测定
(1)DPPH自由基清除实验
精密称取DPPH试剂3.943mg，加入适量无水乙醇溶解，置于100mL棕色容量瓶中，(适当添加无水乙醇调节)制成在517nm时吸光值为0.78～0.82(最好)的标准品储备液。
分别称取纯化前后多酚样品，用70％乙醇溶液制备成一定梯度浓度的试液，准确吸取0.1mL试液于试管中，并加入3mL配置好的DPPH试液，摇匀，置于阴暗处反应30min后，在517nm处进行吸光度测定，注为A1；取样品液0.1mL与3mL 70％乙醇溶液混合，测定吸光值，注为A2；0.1mL乙醇溶液与DPPH试液混合，测定吸光值，注为A3。则不同浓度多酚对应清除率为：
(1-(A1-A2)/A3)*100％ (8)
根据测定所得数据绘制清除率与多酚浓度的关系曲线，并比较IC50值(清除率达50％时的多酚浓度)。同时取VC和VE对DPPH自由基的清除率作为对照，为纯化前后多酚抗氧化活性提供参考。
(2)ABTS+自由基清除实验
准确称取ABTS试剂20.3mg，加入5mL蒸馏水溶解；称取过硫酸钾粉末3.51mg，加入5mL蒸馏水溶解。将两者混合均匀，在室温下，于阴暗处反应12～16h，取1mL混合试液，加入40mL乙醇，摇匀测定在734nm处吸光值(最好为0.7左右，便于测定)。
称取纯化前后多酚样品，用70％乙醇溶液制备成一定梯度浓度的试液，取0.1mL试液，加入4mL ABTS+试液，摇匀，快速反应5min，在734nm处进行吸光度测定，注为A1；取样品液0.1mL与4mL蒸馏水，测定吸光值，注为A2；0.1mL蒸馏水与ABTS试液混合，测定吸光值，注为A3。则不同浓度多酚对应清除率计算方式同DPPH实验结果计算。根据测定所得数据绘制清除率与多酚浓度的关系曲线，并比较IC50值。同样以VC、VE作为对照。
3.11高效液相色谱法(HPLC)测定纯化前后总多酚纯度
由于紫外分光光度法测定白簕叶总多酚含量并不能对5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA这四种主要咖啡酰奎尼酸类化合物进行准确测定，而通过HPLC能够对四种酚酸类物质的含量作出精确测定。
本实施例采用ODS反相柱，以乙腈-水(0.2％甲酸)系统以90：10→40：60的比例梯度洗脱。
表1HPLC条件
首先分别精密称取5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA的标准品1mg，加入1mL甲醇(色谱纯)溶解，分别吸取100μL各标准溶液配成100μg/mL的混合标样。以此方法，将干燥后的纯化后白簕叶多酚与纯化前粗提取多酚分别配制成100μg/mL的样品溶液。在通过0.45μm滤膜后进行高效液相测定其中4种主要酚酸含量。并通过所得液相图谱分析纯化前后各组分变化。
4.结果与分析
4.1多酚标准曲线的绘制
通过3.1的方法，计算得出绿原酸浓度与吸光值的标准曲线方程为：Y750nm＝0.449x-0.017，R2＝0.993。
4.2大孔树脂型号筛选
4.2.1静态吸附试验
由图2可以看出，大孔树脂HPD100对五加属植物白簕叶中总多酚有较强的吸附效果，其吸附率达到64％，其他4种树脂的吸附率从高到低依次是AB-8、D101、HPD400、HPD600。由此可见，不同类型的树脂对于白簕叶总多酚的吸附性能各不相同。可能原因是，对于5种不同类型树脂，其内部结构、构成分子的对称性、以及多酚的溶解度等，这些情况的存在对于树脂吸附多酚能力均有不同程度的关系。而多酚由于在其分子中由酚羟基的存在，使得其分子对称性并不是很高，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。
4.2.2静态解吸附试验
本实施例由于对白簕叶多酚解吸液浓度还未进行研究，因此在此处打算采用体积分数为60％的乙醇水溶液对树脂进行解吸附，通过图3可知，5种大孔树脂对于白簕叶总多酚的解吸率都普遍较高，其中以D101树脂的解吸附效果最好，其解吸率达78.2％。而HPD100仅次之，HPD400、HPD600、AB-8再次之。结合对白簕提取液的静态吸附与解吸附试验来看，D101型树脂对白簕叶总多酚的解吸效果最好，但吸附率却并不是最高的。而HPD100型树脂吸附率最大，解吸率也仅次于D101，达到77.9％，能够将大部分多酚洗脱下来，因此本课题选择使用HPD100型大孔吸附树脂作为对白簕叶中总多酚进行后续纯化工艺研究的材料。
4.2.3HPD100大孔吸附树脂静态吸附及解吸动力学曲线
由图4可知，从0h开始，树脂对白簕提取液中总多酚的吸附率缓慢上升，在5h达到吸附率达到最大值。随着时间的推移，其吸附率略有下降，因此在5h后树脂对总多酚的吸附达到平衡。通过解吸曲线可知，在0～3h这段时间里，树脂的解吸附效率呈上升趋势，并在3h达到解吸附的最大值，为89.3％。但在随后时间里解吸率随时间逐渐降低，可能原因是由于洗脱液逐渐饱和造成的，也有可能是因为多酚结构的变化引起。
4.2.4静态吸附与解吸附试验结果分析
(1)多酚上样液浓度的影响
由图5可知，大孔吸附树脂对于不同浓度的白簕叶提取液的吸附有明显的差异。当提取液浓度小于1.0mg/mL时，HPD100树脂对白簕叶中多酚的吸附率随多酚浓度的增加呈逐渐上升趋势，造成这种现象的原因大概是由于多酚浓度比较低时，其分子能够有更多机会与大孔树脂的内表面接触，从而使多酚分子能够加快扩散至树脂孔道内，并形成吸附。随着白簕叶总多酚浓度的增加，树脂对多酚的吸附率反而逐渐降低，造成这种现象的产生是因为当多酚浓度处于较高状态时，位于树脂孔道内的白簕叶多酚分子的扩散运动受到抑制，从而导致树脂对多酚的吸附率下降。而且，在高浓度的多酚提取液中，一些其他化合物也可能会与多酚分子存在吸附竞争，甚至可能会生成沉淀造成堵塞孔道的现象，使多酚分子向树脂孔道内部扩散受到抑制，从而影响大孔树脂对多酚分子的吸附。因此，白簕叶总多酚上样液浓度选择1.0mg/mL比较合适。
(2)解吸附液浓度影响
由图6可以看出，当乙醇水溶液体积分数由10％增大到50％时，解吸后溶液中白簕叶总多酚浓度呈逐渐增加的趋势；而随着乙醇体积分数从50％增大到90％时，解吸后多酚浓度逐渐减小。由此可知，在一定范围内，多酚溶解度随乙醇体积分数增大而增大；而当乙醇体积分数过大时，可能会造成溶液中某些大分子如蛋白质等物质的溶解度降低而析出形成沉淀，阻塞树脂孔道，从而影响树脂中多酚分子向外扩散，因此，50％的乙醇水溶液可作为大孔树脂解吸液进行后续试验。
(3)多酚上样液pH值的影响
pH值能够影响白簕叶提取液中多酚和其他溶质分子的水解程度，进而使溶质分子和溶剂的相互作用力。由图7可知，在pH值小于3时，随着pH值升高，大孔树脂对白簕叶总多酚的吸附率逐渐上升；当上样液pH值大于3时，HPD100型树脂对白簕叶多酚的吸附率逐渐下降。可能原因是，由于多酚为弱酸性化合物，当溶液pH值较高时，即溶液酸性较弱，多酚分子发生水解反应，其中的酚羟基解离形成H+和相应的阴离子，削弱了与溶液中水分子的相互作用力(同时树脂孔道内水分子与多酚的氢键作用力减弱)，从而导致树脂对多酚分子的吸附力下降，进而影响吸附率。而在碱性条件下，大孔树脂易结成块状物，且能与多酚发生中和作用，形成相应的盐，并不利于多酚的吸附。因此在偏酸性溶液中，多酚能以分子形式存在，有利于吸附。
(4)解吸附液pH值的影响
由图8可知，在解吸液酸性为6.0的情况下，多酚的解吸后浓度最高；在强酸性条件下，树脂解吸后溶液中多酚浓度随酸性增加而降低；而在中性条件下，多酚解吸后浓度较pH为6.0时也稍有降低，可能是因为多酚类化合物的结构发生变化，从而引起多酚类化合物分子结构和性质改变，因此解吸液pH值选择6.0较适宜。
4.2.5动态吸附与解吸试验
(1)多酚上柱速度与吸附率的关系
由9可知，当白簕叶总多酚粗提液浓度一定时，上柱速度越大，白簕叶多酚在大孔树脂层的停留时间越短，还未扩散到树脂的孔道内就流出，导致树脂的吸附效果差。而流速在1.0mL/min、2.0mL/min时的吸附率相近，分别为80.12％和84.72％，相差不大。而且流速过慢会延长试验和生产周期，故选择2.0mL/min作为上样液流速。
(2)乙醇溶液洗脱速度对树脂解吸附多酚效果的影响
对于解吸液流速要求速度尽量缓慢，洗脱速度快会使解吸液在树脂层停留时间减慢，从而使解吸不充分，解吸效果差；降低解吸流速使乙醇溶液在柱床中停留时间增加，有利于乙醇分子向树脂内孔道移动，将吸附的多酚分子置换出来，但洗脱速度太慢则会造成洗脱时间延长，不利于生产。
由图10可知，解吸流速为2.0mL/min时解吸率最高，因此解吸流速选2.0mL/min为宜，且在吸附与解吸附时基本无需调节旋钮。
4.2.6动态洗脱曲线绘制
由图11可以看出，用pH值为6.0的50％的乙醇溶液以2mL/min的流速洗脱时，洗脱峰集中，拖尾不严重，解吸剂用量为40mL，解吸率为58.8％。同时将流出液合并，浓缩干燥的纯化多酚，取适量(剩余做HPLC测定)进行Folin法测定纯度，发现纯化前总多酚纯度为11.7％，纯化后多酚纯度为49.7％，纯化倍数为4.25倍。
4.3验证实验和放大实验
4.3.1验证实验
通过对白簕叶总多酚提取物进行重复实验，发现重复实验所得结果为：在纯化前白簕叶总多酚提取物样品纯度为11.5％，经HPD100大孔树脂纯化后测得多酚纯度为53.1％，纯化效果为4.6倍，与动态洗脱所得纯化多酚纯度基本一致。
4.3.2放大实验
通过将HPD100型树脂进行扩大30倍试验，结果发现纯化前白簕叶多酚样品纯度为12.5％，经大孔树脂纯化后测得样品纯度为54.5％，纯化效果为4.4倍，由此可见，HPD100型树脂对于白簕叶总多酚纯化并不受树脂质量的增加而有所下降，因此为其未来实行工厂化生产提供实验参考。
4.4纯化前后白簕叶抗氧化能力测定
4.4.1DPPH自由基清除试验
由图12可以看出，白簕叶多酚对DPPH自由基的清除率随多酚样品浓度的升高而升高，且纯化前后多酚对DPPH自由基的清除率存在较大差异，其中多酚浓度(x)与DPPH自由基清除率(y)之间存在线性关系，纯化前多酚回归直线方程为y(％)＝32.373x+3.312，R2＝0.9366，纯化前多酚的IC50＝1.44mg/mL。纯化后多酚回归直线方程为y(％)＝21.001x+39.237，R2＝0.7842，纯化后多酚的IC50＝0.51mg/mL。因此纯化前多酚与纯化后多酚相比，其抗氧化能力较弱，随着多酚浓度升高，其DPPH自由基清除率无限趋向100％甚至达到100％(如图13)。
4.4.2ABTS+自由基清除试验
由图14可以看出，纯化前多酚浓度(x)与ABTS+自由基清除率(y)的线性回归方程为y(％)＝13.528x+26.737，R2＝0.7192，当清除率达到50％时，其浓度为1.72mg/mL。纯化后多酚浓度(x)与ABTS+自由基清除率(y)的线性回归方程为y(％)＝12.83x+35.02，R2＝0.726。IC50＝1.17mg/mL，即纯化前多酚IC50较纯化后多酚IC50大。综合图14的DPPH自由基清除实验和图15的ABTS+自由基清除实验可以看出，纯化后多酚的抗氧化能力比纯化前多酚抗氧化能力强(纯化多酚达到富集)。而以VC、VE进行DPPH、ABTS+自由基清除实验为白簕叶总多酚抗氧化试验作为阳性对照参考(见图19、20)。
4.5高效液相色谱法(HPLC)测定纯化前后总多酚纯度
本实施例通过Folin-Ciocalteu法证明了纯化前后白簕叶总多酚得到了有效的富集，但其中主要多酚，如绿原酸(5-CQA)、隐绿原酸(4-CQA)、3，5-二咖啡酰奎尼酸(3,5-DCQA)、4，5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-DCQA)的具体含量变化情况并不清楚，通过高效液相色谱法(HPLC)就能够清晰的分析HPD100树脂对各主要组分的纯化情况。
通过HPLC测定(由于取样原因，纯化前多酚样品浓度应为1.87mg/mL)，可以从图16中看出，在混合标样中，从左往右依次是5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA，以此对照得出纯化前多酚(图17)各组分含量依次是W5-CQA＝12.35％、W4-CQA＝1.34％、W3,5-DCQA＝11.02％、W4,5-DCQA＝4.05％，总多酚含量为28.76％。纯化后多酚(图18)各组分含量依次是W5-CQA＝62.05％、W4-CQA＝3.86％、W3,5-DCQA＝18.76％、W4,5-DCQA＝5.50％，其总多酚含量为90.17％，因此HPD100树脂对白簕叶总多酚的纯化效率为3.14倍(具体结果见图21、图22和图23)。
结论
本试验研究了大孔树脂纯化五加属植物白簕叶中总多酚的工艺，通过实验研究可以确定HPD100型大孔树脂对白簕叶中多酚化合物的最佳纯化工艺：以pH为3.0，浓度为1.0mg/mL白簕叶多酚粗提液作为上样液，调节上样速率，以2mL/min的速度上柱，上柱量为30mL。然后先用适量蒸馏水冲洗，再用40mL pH为6.0的50％乙醇溶液对大孔树脂进行洗脱，而洗脱速度亦为2mL/min，可得纯度(紫外测定)为53.1％的白簕叶多酚化合物。对各工艺参数进行均扩大30倍再实验，获得纯度(紫外测定)为54.5％的白簕叶多酚化合物。综合纯化前后多酚纯度分析，纯化后较纯化前多酚纯度精制倍数达到了4.4倍。通过高效液相色谱法测定白簕叶多酚由纯化前的28.75％富集为纯化后的90.17％，纯度提升3.14倍。
通过扩大实验可知，柱层析对白簕叶中多酚类化合物的纯化效果明显，且能够进行工业化生产，但其纯化效率还可能与纯化内外环境温度、层析柱的径高比、层析柱中树脂颗粒间的紧密程度及白簕叶多酚提取物的性质有关联，因此只有在对各项条件的全方位考虑情况下才能够真正制定出高效高质量的生产工艺。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：先将大孔树脂进行预处理，然后置于蒸馏水中浸泡待用，所述的预处理是指：将大孔树脂以无水乙醇进行浸泡，待充分溶胀，置入层析柱中，控制使树脂层无气泡产生，取无水乙醇上柱洗脱，在洗脱液加等体积蒸馏水后洗脱液不变混后停止；再用蒸馏水洗脱树脂至其中乙醇含量小于10%；待蒸馏水流尽后，加入碱液浸泡一段时间后，用蒸馏水洗脱树脂至洗脱液呈中性，再加入酸溶液浸泡相同时间，用蒸馏水洗至中性，即可得处理好的大孔树脂，将树脂加蒸馏水浸泡于烧杯中备用。
2.如权利要求1所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的碱液为5% NaOH，其添加量为3倍大孔树脂量。
3.如权利要求1所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的酸溶液为5% HCl溶液，其添加量为3倍大孔树脂量。
4.如权利要求1所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂为HPD100、AB-8、D101、HPD400、HPD600中的任一种。
5.如权利要求1所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂用于纯化时，对应的白簕叶片总多酚粗取液浓度为0.5-10mg/mL，pH为1-6，流速1-3mL/min。
6.如权利要求5所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的粗提液的浓度为1-3mg/mL，pH为2-4，流速1-2mL/min。
7.如权利要求1所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂纯化吸附多酚后以乙醇水溶液作为脱附液，乙醇水溶液的体积浓度为10-90%，脱附液pH2-7，速度为1-3mL/min。
8.如权利要求7所述的一种用于白簕中总多酚纯化的大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的脱附液乙醇水溶液的体积浓度为10-50%，脱附液pH4-6，速度为1-2mL/min。
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