CN104693034A - 一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，包括以下步骤：(1)、取紫锥菊提取物，配制得到菊苣酸的含量1.3～5mg/mL的样品溶液，调节样品溶液的pH值至2～5，作为上样液；(2)、大孔树脂湿法装柱，上样液上样，上样流速为2～3Bv/h，吸附时间为3～5小时；(3)、先用0.5Bv～2Bv去离子水洗脱，再用10％～30％乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为1～3Bv/h；收集0.25Bv～2.25Bv的乙醇洗脱液，挥干洗脱液，得到菊苣酸产品。本发明方法操作步骤简单，不会用到有毒化学试剂，经过一次处理，菊苣酸的纯度从4％提高到85％，纯化倍数为21倍以上，并且回收率在77％左右。

Description

一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，本方法避免了使用大量有毒的有机溶剂，步骤简单、高效，安全，环保，成本低。

背景技术

紫锥菊(Echinacea purpurea)是原产美洲的一类菊科(Compositea)松果菊属多年草本野生花卉。该属植物共有8种及数个变种，已开发为药品的主要为紫锥菊Echinacea purpurea(L.)Moench、狭叶紫锥菊E.angustifolia DC.和淡白紫锥菊E.pallida(Nutt)Nutt等三种。其中紫锥菊(E.purpurea)是目前国际受到普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂，它的提取物及制剂销售额居美国医药市场前5名，受到国内外极大关注。紫锥菊的化学成分复杂多样，其主要成分是酚类、鞣制、挥发油、油脂、黄酮、皂苷、甾体、萜类、生物碱等成分。目前紫锥菊在我国北京、上海和长沙等地已成功引种。

紫锥菊在西方应用十分广泛，是闻名世界的“免疫植物”，具有突出的抗感染与免疫保护的作用，是迄今为止发现的极少的具有增强免疫力和抗炎双重作用的药物。早在17世纪北美洲的印第安人就开始用紫锥菊治疗疾病，包括昆虫和毒蛇的咬伤，湿疹，伤寒，肺结核等病。德国早在1989年就紫锥菊列入常用处方之中。1989年紫锥菊单一及复合制剂的种类就达到300多种，且有很多剂型大量用于临床，如用于治疗病毒或细菌引起的急性、慢性呼吸道感染，辅助治疗各种严重的细菌感染等。在90年代后期，美国的保健食品市场中，含有菊苣酸成分的食品是目前最为畅销的提高人体有机免疫力的产品之一。1995年美国健康食品畅销排名榜上紫锥菊名列榜首，紫锥菊制剂在全球范围内还有日益普及的趋势。但是，紫锥菊在我国的研究报道较少，明显落后于其他国家。

咖啡酸类衍生物是紫锥菊中的一类重要的活性物质，具有增强免疫力，抗炎，抗氧化等药理作用。紫锥菊中的咖啡酸类衍生物包括菊苣酸(L-cichoric acid)、咖啡酰基酒石酸(caftaricacid)、绿原酸(Chlorogenic Acid)、咖啡酸(caffeic acid)、紫锥菊苷等成分。其中，菊苣酸是紫锥菊中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强免疫功能、抗炎作用，并能抑制透明质酸酶，保护胶原蛋白Ⅲ免受自由基的影响。因此，在此类植物药及保健品中咖啡酸类衍生物是其质量控制的重要指标成分。美国药典中，对于紫锥菊中总酚酸的含量的测定，就是以菊苣酸、咖啡酰基酒石酸、绿原酸的总的含量测定的。欧洲药典中，对紫锥菊粉末的规定，要求菊苣酸的含量不低于4％，因此对紫锥菊中菊苣酸的纯化工艺研究，具有重要的意义。

在紫锥菊的有效成分提取纯化的工艺上，CN101148410A报道了通过乙醇提取，树脂吸附，萃取等工艺得到高纯度的菊苣酸；CN101367728A报道了以市售3-5％的紫锥菊提取物为原料，用非极性大孔吸附树脂层析，得到菊苣酸和咖啡酰基酒石酸；CN101766667A报道了一种紫锥菊粗提物的制备方法及其酚类成分的检测方法。上述三个发明公开的方法操作步骤复杂，涉及到萃取工艺，使用到有毒化学试剂，无法保证最后的产品没有有毒机化学试剂残留。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，本发明方法采用大孔树脂柱层析工艺，步骤简单、高效、避免了使用大量有毒的有机溶剂，安全、环保、成本低。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，包括以下步骤：

(1)、制备上样液：取紫锥菊提取物，配制得到菊苣酸的含量1.3～5mg/mL的样品溶液，调节样品溶液的pH值至2～5，作为上样液；

(2)、吸附：大孔树脂湿法装柱，上样液上样，上样流速为2～3Bv/h(柱体积/小时)，吸附时间为3～5小时，达到吸附平衡；

(3)、纯化：先用0.5Bv～2Bv去离子水洗脱，再用10％～30％乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为1～3Bv/h；收集0.25Bv～2.25Bv的乙醇洗脱液，挥干洗脱液，即得到菊苣酸产品。

步骤(1)中，所述的紫锥菊提取物为菊苣酸含量3％～5％(质量百分含量)的紫锥菊提取物的干燥粉末。

所述的上样液中菊苣酸的含量优选为1.3～2.6mg/mL，最优选为1.6mg/mL；所述的上样液的pH值优选为3～4.35，最优选为3。

所述的调节pH用的酸为1mol/L的盐酸。

制备上样液的具体方法为：称量菊苣酸含量3～5％的紫锥菊提取物8～35g，先用100mL的去离子水超声溶解30min，过滤除去不溶物，得到续滤液；续滤液定容到250mL，制备得到样品溶液，此样品溶液的菊苣酸含量在1.3～5mg/mL，然后调节pH到2～5，得到上样液。

步骤(2)中，所述的大孔树脂优选为HPD100大孔吸附树脂。

所述的上样液在温度25～35℃下上样；优选的，所述的上样液优选在温度25～30℃下上样。

所述的上样流速优选为2Bv/h；所述的吸附时间优选为3小时。

HPD100大孔吸附树脂的预处理：用95％的乙醇浸泡至充分浸泡溶胀，然后用清水洗至没有醇味，处理好的大孔树脂湿法装柱备用。

步骤(3)中，优选的纯化技术方案为：先用1Bv去离子水洗脱，再用30％乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为2Bv/h；收集0.5Bv～1.75Bv的乙醇洗脱液，挥干洗脱液，即得到菊苣酸产品。所述的菊苣酸产品中菊苣酸的纯度达到85％。

本发明的有益效果：

本发明纯化方法采用大孔树脂柱层析工艺，操作步骤简单，不会用到有毒化学试剂，保证没有有毒机化学试剂残留，经过一次处理，菊苣酸的纯度可以从4％提高到85％，纯化倍数为21倍以上，并且回收率在77％左右。本发明方法制得的菊苣酸产品中菊苣酸含量可以达到85％，咖啡酰基酒石酸的含量为2.0％，绿原酸的含量为0.3％，符合美国和欧洲药典的规定，完全可用作工业生产的原料药。

采用30％的乙醇作为洗脱溶剂，洗脱溶剂与吸附质之间的亲和力大于吸附质与吸附质之间的亲和力；洗脱溶剂低毒或没有毒性，有较低的沸点，便于回收利用，对环境没有污染。

附图说明

图1是紫锥菊提取物的HPLC图谱；峰1、峰2、峰3、峰4分别是咖啡酰基酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸。

图2是6类大孔树脂的吸附量与解析量。

图3是不同pH条件下HPD100大孔吸附树脂的吸附量。

图4是HPD100大孔吸附树脂对菊苣酸的动力学模型曲线。

图5是HPD100大孔吸附树脂不同条件下的等温吸附曲线。

图6是不同浓度的乙醇的洗脱效果。

图7是HPD100大孔吸附树脂对不同菊苣酸浓度的上样液的吸附量和吸附率。

图8是30％的乙醇洗脱曲线图。

图9是动态洗脱过程中菊苣酸的洗脱量和纯度随洗脱体积的变化情况图。

图10是经过纯化得到的菊苣酸的HPLC图谱；峰1和峰4分别是咖啡酰基酒石酸和菊苣酸。

具体实施方式

仪器与材料

岛津高效液相色谱仪(LC-20AT，日本)，紫外检测器(SPD-20A，日本)，震荡式摇床(常州华冠仪器有限公司)，RE52CS-1旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，真空抽滤装置(南京予华仪器设备有限公式)，离心机(苏州科瑞机械有限公司)，超声波清洗机(康洁仪器有限公司)，蠕动泵(兰格恒流泵有限公司)，移液枪，玻璃层析柱。

紫锥菊提取物(菊苣酸含量在3％～5％左右)于2013年7月购自湖南浏阳；菊苣酸标准品、咖啡酰基酒石酸标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司，HPLC≥98％。

大孔树脂AB-8、HPD826、HPD600、HPD100、DM130、D101购自河北沧州宝恩吸附材料科技有公司；试剂甲醇为色谱纯，乙醇、甲酸、盐酸、NaOH均为分析纯。

实施例1菊苣酸的检测

紫锥菊样品溶液的配制

取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，然后定容到合适的体积，配制成合适的浓度，初始pH为4.35，用作样品溶液。

菊苣酸的检测方法

Waters C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱；流动相：0.2％甲酸溶液(A)-甲醇(B)；流速：1.000mL/min；UV检测波长：330nm；运行时间：30min；进样量：20μL，柱温：30℃。液相条件见表1。

紫锥菊提取物的液相图谱见图1，提取物中菊苣酸的含量为4％，咖啡酰基酒石酸的含量为1.3％，绿原酸的含量为0.08％。

表1 HPLC的条件

标准曲线的绘制

精密称量4.04mg菊苣酸标准品(纯度98％)，用去离子水溶解，超声30min，定容于10mL容量瓶中，然后分别制备0.05、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8mg/mL的标准溶液，最后绘制标准曲线方程：Y＝77588782X-1727604，R值为0.999591，线性良好。

精密称量1.84mg咖啡酰基酒石酸标准品(纯度98％)，分别配制一系列等梯度浓度(0.036、0.072、0.108、0.144、0.150、0.186mg/mL)的标准溶液，最后绘制标准曲线方程：Y＝72762910X-89784，R值为0.999876，线性良好。

实施例2大孔吸附树脂的筛选

结合大孔树脂的物理化学性质，从极性、粒径、比表面积，平均孔径等方面，选取6类大孔树脂：AB-8、HPD826、HPD600、HPD100、DM130、D101，各类大孔树脂的物理参数，见表2：

表2 6类吸附树脂的物理参数

新购大孔吸附树脂用95％乙醇充分浸泡溶胀，然后用蒸馏水洗涤至流出液清亮，备用。

树脂再生采用以下方法：先用5％盐酸溶液浸泡10个小时，用水洗至中性；再用等体积的5％氢氧化钠溶液浸泡10个小时，用水洗至中性；最后用95％乙醇浸泡10个小时，再用水洗至无醇味即可。

静态吸附与解吸附实验

取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，配制成菊苣酸浓度为1.3mg/mL的样品溶液，此时pH为4.35。量取6份20mL紫锥菊提取物的样品溶液，对6类大孔树脂进行静态吸附和解吸附实验：分别加入到事先称量好的各类大孔树脂中(树脂的质量相当于1.0g干树脂重量)，密封好，于摇床中振摇12h，在25℃条件下，静态吸附，在吸附的过程中，每隔10min，收集一次样品溶液，每次收集0.5mL，进行HPLC分析。12h后，先用20mL的去离子水洗脱，洗去水溶性杂质，然后用20mL的30％的乙醇解吸附，取解吸液，测定菊苣酸的含量。实验重复n＝3，最后按照下述公式计算：

吸附量(Adsorption capacity)：

$Q_e=\frac{(C_0-C_e)\×V_i}{W}---\left(2.1\right)$

公式(2.1)中，Q_e代表吸附达到平衡时的吸附量(mg/g)，C₀和C_e代表初始浓度和吸附平衡时的浓度(mg/mL)，V_i是吸附液的体积(mL)，W是该树脂相当于干树脂的质量(g)。

解吸附量(Desorption capacity)：

$Q_d=\frac{C_d{V}_d}{W}---\left(2.2\right)$

公式(2.2)中，Q_d代表解吸附的量(mg/g)，C_d解吸附后的浓度(mg/mL)，V_d是解析液的体积(mL)，W是该树脂相当于干树脂的质量(g)。

解析率(Desorption ratio)：

$D=\frac{C_d{V}_d}{(C_0-C_e)\×V_i}\×100\%---\left(2.3\right)$

公式(2.3)中，D代表解析率。

吸附量与解吸附量的结果见图2：从菊苣酸的分子的结构形态考虑，菊苣酸的具有完全对称的结构，并且具有弱极性的酚羟基和极性的羧基集团；基于这些因素考虑，极性、弱极性以及非极性的树脂对菊苣酸均具有吸附效果。但是树脂HPD600与HPD100的吸附量分别为19.6mg/g和18.5mg/g，高于其他树脂，可能是由于两者具有相似的平均孔径和比表面积。而HPD100(15.2mg/g)比HPD600(9.6mg/g)具有更高的解吸附量，HPD100的解吸率可以达到81.8％，而HPD600只有48.9％。从树脂的类型可以看出，HPD600为极性，HPD100为弱极性，可能是由于极性的原因，导致HPD600的解吸附比较困难。综合吸附量、解吸附量以及极性等因素，最终选择了HPD100大孔吸附树脂。

实施例3上样液pH值对大孔树脂吸附量的考察

上样液的pH是影响大孔吸附树脂吸附的一个很重要的因素，pH可以影响菊苣酸是处于离子状态还是分子状态，从而改变其极性，进而对树脂的吸附量产生影响。本实验考察pH对HPD100大孔吸附树脂吸附量的影响，筛选出最优的pH。

上样液的配置同实施例2：取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，配制成菊苣酸浓度为1.3mg/mL的样品溶液，测得其pH为4.35，用1mol/L的盐酸溶液和10％的氢氧化钠溶液，调节样品溶液的pH，获得pH分别为1、2、3、4、5、6、7和4.35的上样液，然后参照实施例2中静态吸附与解吸附实验，测定不同pH条件下的吸附量。实验重复n＝2。

实验结果见图3，可以看出，pH值对HPD100大孔树脂的吸附影响还是比较显著的：当样品溶液的pH>5.0时，样品溶液逐渐接近碱性，吸附量显著减小；当样品溶液的pH≤5.0时，吸附量没有显著的差异，在pH值为2～5时，大孔树脂对菊苣酸的吸附量基本能够达到20mg/g，在pH值为3时，大孔树脂对菊苣酸的吸附达到最大值为22.94mg/g，不调节pH的情况下(pH值在4.35)，吸附量为20.16mg/g。分析原因：当pH≤5.0时，菊苣酸处于分子状态，与吸附剂之间依然靠分子的范德华力吸附；当pH>5.0时，菊苣酸倾向于电离，形成离子，与吸附剂之间的范德华力减弱，从而导致吸附量减少。因此，上样液的pH可以调节到3左右，避免pH超过5.0，可以选择pH在2～5之间使吸附量基本能够达到20mg/g，进一步可以将上样液的pH调节到3～4.35之间使吸附量大于20mg/g，最好将pH调节到3使菊苣酸的吸附量达到最大值。

实施例4吸附动力学测试

进行吸附动力学实验，运用吸附动力学模型，描述吸附的过程。

称量处理好的HPD100大孔吸附树脂(相当于1.0g干树脂)和紫锥菊提取物的样品溶液(配制方法同实施例2，菊苣酸的含量在1.3mg/mL，调节pH为3，20mL)，一起加入到锥形瓶中，于摇床(120rpm)中，25℃条件下，进行静态吸附实验，在吸附的过程中，每隔10min，收集一次样品溶液，每次收集0.5mL，进行HPLC分析，直到吸附平衡结束。并计算每个时间点吸附量的大小。

相关的模型公式有拟一级动力学方程，拟二级动力学方程和颗粒内扩散Kannan方程。

拟一级动力学方程：

$\frac{d{Q}_e}{\mathrm{dt}}=K_1(Q_e-Q_t)---\left(4.1\right)$

其表达式为：log(Q_e-Q_t)＝logQ_e-K₁t/2.303     (4.2)

公式(4.1)、(4.2)中，Q_e为选定大孔树脂吸附平衡时的吸附量(mg/g)；Q_t为各个时间点的吸附量(mg/g)，K₁为一级吸附常数，t为吸附时间。

拟二级动力学方程：

$\frac{d{Q}_e}{\mathrm{dt}}=K_2{(Q_e-Q_t)}^2---\left(4.3\right)$

其表达式为： $\frac{t}{Q_t}=\frac{1}{K_m{Q_e}^2}+\frac{t}{Q_e}---\left(4.4\right)$

公式(4.3)、(4.4)中，Q_e为选定大孔树脂吸附平衡时的吸附量(m_g/_g)；Q_t为各个时间点的吸附量(mg/g)，K_m为二级吸附常数，t为吸附时间。

颗粒内扩散的Kannan方程表达式为：

Q_t＝K_pt^O.5+C                (4.5)

公式(4.5)中，Q_t为各个时间点的吸附量(mg/g)；K_p为颗粒内扩散速率常数(mg×min^{- 0.5}×mL^-1)，t为吸附时间；C(mg/g)为模型常数，反应边界层的厚度。

HPD100大孔吸附树脂对菊苣酸的动力学模型曲线，在25℃条件下进行，得到的实验结果见图4，在吸附的前2小时以内，吸附量迅速的增加；2小时到5小时，吸附量缓慢增加，在吸附达到3小时后达到吸附的平衡阶段。

模型处理结果见表3：

表3 模型结果

Kannan方程的处理结果：

Q_t＝0.5893t^0.5+4.0125  (0＜t＜6Omin)  r＝0.979

Q_t＝0.3286t^0.5+5.9799  (60min＜t＜120min)  r＝0.997

通过实验数据可以看出，拟二级动力学方程(r＝0.999)能更好的描述HPD100大孔吸附树脂的吸附动力学行为，在0＜t＜60min以及60min＜t＜120min内Kannan方程有很好地线性，表明颗粒内部扩散为吸附速率的控制步骤，但是直线不经过原点，表明吸附速率受液膜扩散和颗粒扩散的共同影响，其中颗粒内扩散是控制步骤。

实施例5吸附等温曲线

吸附等温曲线，是指在一定温度下，溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时，溶质分子在两相中浓度之间的关系曲线。等温吸附曲线可以宏观的总括吸附现象方面中吸附量、吸附强度、温度对吸附的影响情况。

取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，配制成菊苣酸浓度为0.21、0.35、0.58、0.96、1.60、2.60mg/mL的一系列样品溶液，并调节pH为3，备用。

通过等温吸附曲线进一步了解HPD100大孔吸附树脂的吸附原理。在不同温度(25℃、30℃、35℃)和不同的初始浓度(0.21、0.35、0.58、0.96、1.60、2.60mg/mL)的条件下，进行静态吸附实验(静态吸附实验的具体操作同实施例2)，测定相应温度和初始浓度时的吸附量，绘制吸附等温曲线。用Langmuir模型和Freundlich等温吸附模型，来描述不同温度和不同初始浓度条件下HPD100大孔吸附树脂的吸附行为。

模型的公式

Langmuir吸附等温式：

$\frac{C_e}{q_e}=\frac{C_e}{q_m}+\frac{1}{b*q_m}---\left(5.1\right)$

公式(5.1)中，C_e为吸附质的平衡浓度，mg/mL；q_e为吸附剂的平衡吸附量，mg/g；q_m为最大吸附量，mg/g；b为Langmuir常数，mL/mg。该公式的前提条件是吸附剂表面均匀并且为单分子层，被吸附的分子之间没有相互作用力。公式(5.1)可变为公式(5.2)，如下：

$\frac{1}{q_e}=\frac{1}{q_m}+\frac{1}{b*q_m{C}_e}---\left(5.2\right)$

Freundlich吸附等温式：

$q_e=K_F{C}_e^{1/n}---\left(5.3\right)$

公式(5.3)中，q_e为吸附剂的平衡吸附量，mg/g；K_F为代表吸附能力的Freundlich常数，(mg/g)(mL/mg)^1/n；为表示吸附强度的Freundlich常数。该公式应用于非均匀的吸附剂的多层吸附。公式(5.3)可变为公式(5.4)，如下：

$\ln q_e=\ln K_F+\frac{1}{n}\ln C_e---\left(5.4\right)$

实验数据经线性回归得到，模型结果见表4：

表4 等温吸附模型结果

整理实验数据绘制不同条件下的等温吸附曲线，见图5。通过等温吸附模型跟吸附等温曲线可以看出，HPD100大孔吸附树脂对菊苣酸的吸附更加符合Langmuir模型，属于单分子层的吸附；树脂的吸附量，随着样品溶液初始浓度的增加而增加，当初始浓度达到1.6mg/mL左右时，树脂的吸附量不再增加，吸附达到饱和状态；在样品溶液的初始浓度相同的条件下，吸附的温度越低，树脂的吸附量越高，随着温度的增加，HPD100大孔吸附树脂的吸附量逐渐减少，也说明了该吸附过程为放热的过程，温度越低越有利于吸附的进行。因此，确定上样液在温度25～35℃下上样，进一步的可以将上样温度控制在25～30℃。

实施例6动态吸附和解吸附

洗脱溶剂的选择

选用玻璃柱(1.5cm×50cm)，湿法装柱填充HPD100大孔吸附树脂，柱床高10cm，上样液为菊苣酸浓度1.3mg/mL、pH＝3的样品溶液，以2Bv/h的流速上样，吸附3h。然后先用1Bv的去离子水洗脱，再分别用3Bv的10％、30％、50％、70％的乙醇作为洗脱溶剂依次洗脱，分别收集相应洗脱液，用HPLC检测洗脱液中菊苣酸的浓度，实验重复2次。定义A％为各个洗脱液中菊苣酸的表观纯度，即HPLC中菊苣酸的峰面积占总峰面积的百分比，以A％作为纯度的参考，根据菊苣酸的洗脱率，选择洗脱溶剂。

通过图6可以看出，菊苣酸的洗脱量随着洗脱液中乙醇浓度的增加先增加再下降，当洗脱溶剂为30％的乙醇时，洗脱溶剂的洗脱能力和洗脱纯度，高于其他浓度的乙醇，同时表观纯度A％也在30％乙醇洗脱时达到最大，为86％。因此30％的乙醇可以作为大孔树脂柱层析过程的洗脱溶剂。

上样液中菊苣酸浓度的确定

参照实施例5等温吸附曲线实验中的结果，对上样溶液的浓度进行优化，以样品溶液中被吸附的菊苣酸的吸附量和吸附率(被HPD100树脂吸附的菊苣酸占样品溶液中的百分比)作为考察指标，选择合适的上样浓度。

取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，分别制备pH＝3、不同浓度的样品溶液(0.58，0.96，1.6，2.6mg/mL，20mL)，然后均按照相同的流速(2Bv/h)上样至预处理好的HPD100大孔吸附树脂柱(1.5cm×10cm)，吸附3h。实验结果如图7所示：树脂的吸附量随着上样液中菊苣酸的浓度不断增加而增加，当上样液浓度超过1.6mg/mL时，增加明显减缓，该结果与实施例5的吸附等温曲线结果一致；树脂的吸附率随着上样液中菊苣酸浓度的不断增加，缓慢增加，并维持在75％以上，当上样液浓度超过1.6mg/mL时，吸附率降至60％以下。分析原因，当上样溶液浓度超过1.6mg/mL时，树脂的吸附达到饱和状态，此时层析柱出现泄漏，导致树脂的吸附量减缓，吸附率下降，因此，上样液的浓度选择1.6mg/mL左右比较适宜。

洗脱流速的确定

取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，配制成菊苣酸浓度为1.60mg/mL的样品溶液，调节样品溶液pH＝3，分别取三份样品溶液作为上样溶液，每份20mL。

选用3根玻璃柱(1.5cm×50cm)，湿法装柱填充HPD100大孔吸附树脂，柱床高10cm，分别将三份上样溶液以2Bv/h的流速上样，吸附3h；然后分别按照1Bv/h、2Bv/h、3Bv/h的洗脱流速，先用1Bv去离子水，再用5Bv 30％的乙醇作为洗脱溶剂进行洗脱，以洗脱液中菊苣酸的回收率(洗脱液中菊苣酸的总量占上样溶液中菊苣酸的总量，％)为考察指标，选择最佳的洗脱流速。实验结果见表5：相同体积的洗脱溶剂，在进行柱层析过程中，洗脱流速越慢，洗脱液中菊苣酸的回收率越高。考虑到实际工艺中，流速过慢，耗时越长，影响生产的周期，优先选择2Bv/h作为柱层析过程中的洗脱速度。

表5 不同洗脱流速对回收率的影响

动态洗脱曲线

选用玻璃柱(1.5cm×50cm)，湿法装柱填充HPD100大孔吸附树脂，柱床高10cm，上样液(菊苣酸浓度为1.60mg/mL，pH＝3，20mL，大约1.1倍于柱体积)以2Bv/h的流速上样，吸附3h；然后先用1Bv的去离子水洗脱，再用30％的乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为2Bv/h，洗脱液按照每5mL收集一次，并用HPLC分析，绘制动态洗脱曲线，如图8所示：首先用1Bv的去离子水洗脱，此时除去了一部分极性较大的杂质，菊苣酸并没有被洗脱出来；然后再用30％的乙醇溶液洗脱，洗脱液中菊苣酸的浓度随着洗脱体积的不断增加而增加，在1.25Bv乙醇洗脱剂时，洗脱液中菊苣酸的浓度出现峰值(3.05mg/mL)，之后菊苣酸的浓度随着洗脱体积的增加逐渐减少，在3Bv乙醇洗脱剂时，洗脱液中菊苣酸的浓度低于0.2mg/mL。菊苣酸主要集中在0.5Bv-3Bv的30％乙醇洗脱液中。进一步证明可以选择3Bv的30％的乙醇溶液作为菊苣酸柱层析的洗脱溶剂。

收集洗脱液的确定

上样液(菊苣酸浓度为1.60mg/mL，pH＝3，20mL，大约1.1倍于柱体积)以2Bv/h的流速上样，吸附3h；然后先用1Bv的去离子水洗脱，再用30％的乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为2Bv/h，洗脱液按照每5mL收集一次，挥干洗脱液，用HPLC分析，分别测定每份洗脱液中菊苣酸的浓度和挥干洗脱液后得到的菊苣酸的纯度。

其中，菊苣酸的洗脱量(EA)通过公式(6.1)积分函数求得：

$\mathrm{EA}=v{C}_0\left({\∫}_0^t\frac{c}{c_0}\mathrm{dt}\right)---\left(6.1\right)$

公式(6.1)中，C₀和C分别表示上样液和洗脱液中菊苣酸的浓度(mg/mL)，t表示洗脱时间(min)；ν表示洗脱流速(mL/min)。

得到菊苣酸的洗脱量和菊苣酸的纯度随着洗脱体积的变化曲线图，如图9，可以看出，洗脱液中菊苣酸的洗脱量随着洗脱体积的变化情况：洗脱体积为1Bv时，即用1Bv的去离子水洗脱时菊苣酸并没有被洗脱出来，只是除去了一部分极性较大的杂质；采用30％的乙醇溶液洗脱，从0.25Bv的30％乙醇开始，菊苣酸的洗脱量迅速增加，说明洗脱液中菊苣酸的浓度逐渐达到峰值，随着洗脱体积的进一步增加，菊苣酸的洗脱量逐增加变缓，说明洗脱液中菊苣酸的浓度逐渐减少；在3Bv乙醇洗脱剂时，菊苣酸的洗脱量逐渐趋于平衡，说明洗脱液中菊苣酸的浓度已经很低了。

挥干洗脱液得到的菊苣酸的纯度随着洗脱体积的增加先升高再下降：用1Bv的去离子水洗脱时菊苣酸并没有被洗脱出来；在0.25Bv-2.25Bv的30％乙醇洗脱液中，挥干洗脱液后测得菊苣酸的纯度达到80％；在0.5Bv-1.75Bv的30％乙醇洗脱液中，测得菊苣酸纯度达到85％；在2.0Bv的30％乙醇洗脱液中，测得菊苣酸纯度达到峰值(90％左右)。

结合菊苣酸的洗脱量和纯度，可以看出菊苣酸主要集中在0.25Bv-2.25Bv的30％乙醇洗脱液中，特别是集中在0.5Bv-1.75Bv的30％乙醇洗脱液中，因此选择收集0.5Bv-1.75Bv的30％乙醇洗脱液，挥干洗脱液后作为菊苣酸产品。

实施例7

按照实施例1-6最优的工艺参数，对紫锥菊中菊苣酸进行柱层析纯化。

(1)、制备上样液：取紫锥菊提取物的粉末，用一定量去离子水溶解，超声30min，过滤，得到续滤液，续滤液在容量瓶中定容，配制成菊苣酸浓度为1.60mg/mL的样品溶液，调节样品溶液pH＝3，得到上样液；

(2)、吸附：选用玻璃柱(1.5cm×50cm)，湿法装柱填充HPD100大孔吸附树脂，柱床高10cm；控制温度在25～30℃，取上样液20mL(上样液体积大约1.1倍于柱体积)以2Bv/h的流速上样，吸附3h；

(3)、纯化：先用1Bv的去离子水洗脱，再用30％的乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为2Bv/h，收集0.5Bv-1.75Bv的30％乙醇洗脱液，挥干洗脱液，真空干燥后，得到菊苣酸纯化产物。

按照实施例1的方法制备样品溶液，分析菊苣酸纯化产物的含量和纯度，结果见图10：纯化产物中菊苣酸的含量为85％，咖啡酰基酒石酸的含量为2.0％，绿原酸的含量为0.3％，经过一次纯化处理，菊苣酸的浓度从4％提高到85％，纯化倍数为21倍。

根据公式(7.1)计算菊苣酸的回收率(W％)在77％左右。

$W\%=\frac{m_1}{m_0}\×100\%---\left(7.1\right)$

公式(7.1)中，m₁为纯化后样品中菊苣酸的质量(mg)，m₀纯化前样品中菊苣酸的质量(mg)。

Claims (9)

1.一种紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、制备上样液：取紫锥菊提取物，配制得到菊苣酸的含量1.3～5mg/mL的样品溶液，调节样品溶液的pH值至2～5，作为上样液；

(2)、吸附：大孔树脂湿法装柱，上样液上样，上样流速为2～3Bv/h(柱体积/小时)，吸附时间为3～5小时，达到吸附平衡；

(3)、纯化：先用0.5Bv～2Bv去离子水洗脱，再用10％～30％乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为1～3Bv/h；收集0.25Bv～2.25Bv的乙醇洗脱液，挥干洗脱液，即得到菊苣酸产品。

2.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(1)中，所述的紫锥菊提取物为菊苣酸含量3％～5％的紫锥菊提取物的干燥粉末。

3.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(1)中，所述的上样液中菊苣酸的含量为1.3～2.6mg/mL；所述的上样液的pH值为3～4.35。

4.根据权利要求3所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于所述的上样液中菊苣酸的含量为1.6mg/mL；所述的上样液的pH值为3。

5.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(2)中，所述的大孔树脂为HPD100大孔吸附树脂。

6.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(2)中，所述的上样液在温度25～35℃下上样。

7.根据权利要求6所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(2)中，所述的上样液在温度25～30℃下上样。

8.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(2)中，所述的上样流速为2Bv/h；所述的吸附时间为3小时。

9.根据权利要求1所述的紫锥菊中菊苣酸的纯化方法，其特征在于步骤(3)中，先用1Bv去离子水洗脱，再用30％乙醇作为洗脱溶剂洗脱，洗脱速度为2Bv/h；收集0.5Bv～1.75Bv的乙醇洗脱液，挥干洗脱液，即得到菊苣酸产品。