CN114705776B - 纯化银杏黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学纯化技术领域，涉及一种纯化银杏黄酮的方法，基于多维液相色谱装置，包括第一泵系统，第二泵系统，色谱柱阵列，捕集柱阵列，馏分收集器，废液池，检测器，混合器，以及二位十通阀，二位十通阀具有依次导通第一泵系统、色谱柱阵列、检测器、混合器、捕集柱阵列、馏分收集器和废液池的A位置，和依次导通第一泵系统、捕集柱阵列、色谱柱阵列、检测器、混合器、馏分收集器和废液池的B位置。还提供了一种纯化银杏黄酮的方法，将银杏叶提取液上样到第一色谱柱，并将目标馏分富集到捕集柱阵列中进行第一维色谱分离；洗脱捕集柱阵列中的目标馏分依次上样至第二色谱柱进行二维纯化，并在收集第二维目标馏分洗脱液，干燥，得到产品。

Description

纯化银杏黄酮的方法
技术领域
本发明属于化学纯化技术领域，涉及一种液相色谱方法，尤其是涉及一种纯化银杏黄酮的方法。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，主要含有黄酮类和萜内脂类化合物。银杏黄酮类化合物能够扩张血管，增加冠脉及脑血管流量，降低血粘度，改善脑循环，是治疗心血管疾病的有效药物。
银杏黄酮根据其结构可分为3类：单黄酮类主要为槲皮素，山奈酚，异鼠李素等；双黄酮类主要有银杏双黄酮，异银杏双黄酮，金松双黄酮等；儿茶素类主要有儿茶素，表儿茶素，没食子酸，表没食子酸等。
国内市场银杏制剂多以片剂，胶囊和口服液为主，技术含量偏低。而国际市场对银杏叶浸膏的总需求约500-700吨，虽国内银杏叶产量每年递增，但在国际市场的竞争力不足。
目前工业纯化工艺多采用大孔树脂柱层析法纯化银杏叶提取物，其纯度约为24％左右(韩学哲，王东双，安晓东，等.银杏黄酮提取和精制工艺的研究[J].化学工程师，2011，25(4)：3.)，精细纯化也以单黄酮类化合物为主，缺乏一种能够同时精细纯化银杏单黄酮和银杏双黄酮的装置及方法。
发明内容
本申请的目的是针对上述问题，提供了一种纯化银杏黄酮的方法；
本发明创造性地提出了一种纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置，包括：
用于输送流动相的第一泵系统；
用于输送稀释水溶液的第二泵系统；
色谱柱阵列，包括并联的第一色谱柱和第二色谱柱，以及用于切换第一色谱柱和第二色谱柱其一为导通路径的色谱柱切换装置；
捕集柱阵列，包括并联的若干捕集柱和至少一个旁路，以及用于切换若干捕集柱和旁路其一为导通路径的捕集柱切换装置；
用于收集目标组分的馏分收集器；
连接馏分收集器的废液池；
连接所述色谱柱阵列的检测器；
连接检测器和第二泵系统的混合器；
以及二位十通阀，具有依次导通第一泵系统、色谱柱阵列、检测器、混合器、捕集柱阵列、馏分收集器和废液池的A位置，和依次导通第一泵系统、捕集柱阵列、色谱柱阵列、检测器、混合器、馏分收集器和废液池的B位置。
在上述的一种纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置中，所述第一色谱柱为C18色谱柱，所述第二色谱柱为氰基色谱柱。
在上述的一种纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置中，所述捕集柱阵列包括并联的至少五个捕集柱和一个旁路；
其中，所述五个捕集柱，分别为第一捕集柱、第二捕集柱、第三捕集柱、第四捕集柱和第五捕集柱，所述第一捕集柱、第二捕集柱、第三捕集柱和第四捕集柱为C18色谱柱，第五捕集柱为C8色谱柱。
第一色谱柱、第二色谱柱以及捕集柱可以是玻璃柱或不锈钢柱，直径为20-800mm，其中的填料粒径为10-200μm，运行压力为1-10MPa。
在上述的一种纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置中，所述二位十通阀处于A位置时，所述色谱柱阵列中有且仅有第一色谱柱所在路径导通；所述二位十通阀处于B位置时，所述色谱柱阵列中有且仅有第二色谱柱所在路径导通。
基于上述任意一种多维液相色谱装置，本发明还提供了一种纯化银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
1)第一维制备液相色谱纯化
将银杏叶提取液上样到第一色谱柱，以甲醇-磷酸水为流动相在二位十通阀A位置对第一色谱柱进行洗脱；
2)目标组分获取
待检测器检测到第一色谱柱上洗脱出的目标馏分时，将目标馏分富集到捕集柱阵列中进行第一维色谱分离；
3)第二维制备液相色谱纯化
以甲醇-乙酸水为流动相，在二位十通阀B位置，洗脱捕集柱阵列中的目标馏分依次上样至第二色谱柱进行二维纯化，并在第二色谱柱洗脱状态下，当检测器检测到对应目标馏分时，用馏分收集器收集得到第二维目标馏分洗脱液；
4)将第二维目标馏分洗脱液干燥，得到产品。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，所述甲醇-磷酸水中甲醇与磷酸水的重量比为2:1～1:2，其中磷酸含量占甲醇-磷酸水总重量的0.1％-1％，目标馏分的洗脱体积为第一色谱柱柱体积的1～15倍。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，第一色谱柱的上样量为装填填料量的千分之一至百分之一。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，所述捕集柱捕获目标馏分体积为捕集柱柱体积的3～20倍。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，所述甲醇-乙酸水中甲醇与乙酸水的重量比为9:1～1:1，其中乙醇含量占甲醇-乙酸水总重量的0.1％-1％，目标馏分的洗脱体积为第二色谱柱柱体积的1～10倍。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，第二维制备液相色谱纯化过程中，甲醇-乙酸水的比重随目标馏分的切换梯级递减。
在上述的一种纯化银杏黄酮的方法中，第一维制备液相色谱纯化过程中，检测器检测不同的目标馏分信号后，捕集柱阵列中，通过切换捕集柱切换装置，依次使用至少五个捕集柱捕获不同的目标馏分；
其中，第一捕集柱捕获第一馏分含槲皮素，第二捕集柱捕获第二馏分含山奈酚，第三捕集柱捕获第三馏分含异鼠李素，第四捕集柱捕获第四馏分含银杏双黄酮及异银杏双黄酮，第五捕集柱捕获第五馏分含金松双黄酮；
第二维制备液相色谱纯化过程中，检测器检测不同的目标馏分信号后，捕集柱阵列中，通过切换捕集柱切换装置，依次洗脱至少五个捕集柱上不同的目标馏分到第二色谱柱中。
与现有技术相比，本申请的优点在于：
本发明能够同时精细纯化银杏单黄酮和银杏双黄酮，纯化产品纯度达到98％，克服了银杏黄酮提取和精制工艺上的缺陷，大大提升了在银杏制剂市场上的竞争力。
本发明通过二维纯化的方式获得多种银杏黄酮的提纯，能够达到较高的收率，并且效率高，方便操作。
附图说明
图1是本申请提供的一种工作位置的多维液相色谱装置原理图。
图2是本申请提供的另一种工作位置的多维液相色谱装置原理图。
图3是本申请提供的银杏黄酮一维纯化色谱图。
图4是本申请提供的槲皮素二维分离色谱图。
图5是本申请提供的山奈酚二维分离色谱图。
图6是本申请提供的异鼠李素二维分离色谱图。
图7是本申请提供的银杏双黄酮和异银杏双黄酮二维分离分离色谱图。
图8是本申请提供的金松双黄酮二维分离色谱图。
图9是本申请提供的槲皮素分析谱图。
图10是本申请提供的山奈酚分析谱图。
图11是本申请提供的异鼠李素分析谱图。
图12是本申请提供的银杏双黄酮分析谱图。
图13是本申请提供的异银杏双黄酮分析谱图。
图14是本申请提供的金松双黄酮分析谱图。
图中：第一泵系统1、第二泵系统2、第一色谱柱3、第二色谱柱4、捕集柱5、旁路50、第一捕集柱51、第二捕集柱52、第三捕集柱53、第四捕集柱54、第五捕集柱55、第六捕集柱56、第七捕集柱57、第八捕集柱58、第九捕集柱59、馏分收集器6、废液池7、检测器8、混合器9、二位十通阀10、第一色谱柱切换阀11、第二色谱柱切换阀12、第一捕集柱切换阀13、第二捕集柱切换阀14。
具体实施方式
通过以下具体实施例进一步阐述；
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其它不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
如图1和图2所示，一种纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置，包括第一泵系统1、第二泵系统2、第一色谱柱切换阀11、色谱柱阵列、第二色谱柱切换阀12、第一捕集柱切换阀13、捕集柱阵列、第二捕集柱切换阀14、馏分收集器6、废液池7、检测器8、混合器9和二位十通阀10。
其中，色谱柱阵列包括并联的第一色谱柱3和第二色谱柱4，第一色谱柱3为C18色谱柱，规格30*250mm；第二色谱柱4为氰基色谱柱，规格30*250mm。
色谱柱阵列的两端分别设置第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12，该第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12分别具有1-3号工作位，1号工作位能够分别切换至与2、3号工作位连接，2、3号工作位分别对应连接第一色谱柱3和第二色谱柱4的路径。
捕集柱阵列包括并联的第一捕集柱51、第二捕集柱52、第三捕集柱53、第四捕集柱54、第五捕集柱55、第六捕集柱56、第七捕集柱57、第八捕集柱58、第九捕集柱59和一个旁路50，第一捕集柱51至第四捕集柱54为C18色谱柱，规格20*20mm；第五捕集柱55至第九捕集柱59为C8色谱柱，规格20*20mm。
捕集柱阵列的两端分别设置第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14，该第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14分别具有1-11号工作位，1号工作位能够分别切换至与2-11号工作位连接，2-11号工作位分别对应连接第一捕集柱51至第九捕集柱59以及旁路50。
检测器8连接第二色谱柱切换阀12，且第二泵系统2与检测器8共同连接混合器9。
二位十通阀10具有1-10号工作位，其中，1号工作位连接第一泵系统1，2号工作位连接第一捕集柱切换阀13，3号工作位与8号工作位连接，4号工作位连接混合器9，5号工作位连接第二捕集柱切换阀14，6号工作位连接第一色谱柱切换阀11，7号工作位与10号工作位连接，9号工作位连接馏分收集器6。
馏分收集器6的出口端连接废液池7。
如图1所示，二位十通阀10在A位置时，1号工作位与10号工作位连接，2号工作位与3号工作位连接，4号工作位与5号工作位连接，6号工作位与7号工作位连接，8号工作位与9号工作位连接，使得第一泵系统1、色谱柱阵列、检测器8、混合器9、捕集柱阵列、馏分收集器6和废液池7依次导通。
如图2所示，二位十通阀10在B位置时，1号工作位与2号工作位连接，3号工作位与4号工作位连接，5号工作位与6号工作位连接，7号工作位与8号工作位连接，9号工作位与10号工作位连接，使得第一泵系统1、捕集柱阵列、色谱柱阵列、检测器8、混合器9、馏分收集器6和废液池7依次导通。
二位十通阀10处于如图1所示的A位置时，第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12中的1号工作位均连接2号工作位，即，色谱柱阵列中有且仅有第一色谱柱3所在路径导通。
二位十通阀10处于如图2所示的B位置时，第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12中的1号工作位均连接3号工作位，即，色谱柱阵列中有且仅有第二色谱柱4所在路径导通。
基于上述多维液相色谱装置进行纯化银杏黄酮，步骤如下：
S1称取粉碎后的300目以下银杏叶粉末10g，加入120mL80％乙醇-水溶液，60℃加热，回流3次，每次2小时，经过滤除渣，再用50μm滤膜过滤，滤液减压回收除去部分乙醇溶剂后，得到银杏叶提取液；
S2
S2-1在二位十通阀10A位置，第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12中的1号工作位均连接2号工作位，以甲醇-0.1％磷酸水为流动相，甲醇:0.1％磷酸水重量比为50:50，流速为40mL/min，检测器8的检测波长为330nm，将银杏叶提取液上样到第一色谱柱3。
第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位均连接11号工作位，即旁路50导通，对第一色谱柱3进行前杂洗脱。第一泵系统1输送甲醇-0.1％磷酸水流动相经第一色谱柱3后，流经检测器8、混合器9、旁路50后通过二位十通阀10，经馏分收集器6进入废液池7，保持至前杂洗脱完毕。
S2-2二位十通阀10保持A位置，至检测器8测得目标馏分时，第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位切换至与2号工作位连接，即第一捕集柱51导通。第一泵系统1输送甲醇-0.1％磷酸水流动相经第一色谱柱3后，流经检测器8，与第二泵系统2输送的稀释水溶液，本实施例中采用纯水，用以使有机相比例降低，有利于捕集柱5捕集，流速为10ml/min,在混合器9中混合后流入第一捕集柱51中，第一色谱柱3处于洗脱状态，第一捕集柱51处于富集状态。
S2-3当检测器8测得该目标馏分富集完毕，将第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位切换至与11号工作位连接，即旁路50导通，对第一色谱柱3进行后杂洗脱，后杂流入废液池。
S2-4重复上述步骤S2-1～S2-3，其中S2-2中依次切换第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位与3-10号工作位连接，从而依次使用第二捕集柱52至第九捕集柱59进行不同目标馏分的捕集，第一捕集柱51捕获第一馏分含槲皮素，其在第一色谱柱3洗脱体积为5.1BV-6.5BV；第二捕集柱52捕获第二馏分含山奈酚，其在第一色谱柱3洗脱体积为6.5BV-6.9BV；第三捕集柱53捕获第三馏分含异鼠李素，其在第一色谱柱3洗脱体积为7.4BV-8.1BV；第四捕集柱54捕获第四馏分含银杏黄酮及银杏黄酮，其在第一色谱柱3洗脱体积8.2BV-10.8BV；第五捕集柱55捕获第五馏分含金松双黄酮，其在第一色谱柱3洗脱体积12.0BV-13.2BV。
完成第一维色谱分离，纯化色谱图如图3所示。
S3
S3-1二位十通阀10切换至B位置，第一色谱柱切换阀11和第二色谱柱切换阀12中的1号工作位均连接3号工作位，以甲醇-0.2％乙酸水为流动相，流速为40mL/min，检测器8的检测波长为330nm。
第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位均连接11号工作位，即旁路50导通，第一泵系统1输送甲醇-0.2％乙酸水流动相经旁路50流入第二色谱柱4，使第二色谱柱4处于平衡状态。
S3-2二位十通阀10保持B位置，切换第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位连接2号工作位，使第一泵系统1输送甲醇-0.2％乙酸水流动相经第一捕集柱51，将第一捕集柱51上捕集的目标馏分洗脱下来，经过二位十通阀10上样到第二色谱柱4后，经检测器8、混合器9、馏分收集器6后进入废液池7。
S3-3在第二色谱柱4处于洗脱状态下，当检测器8检测到目标馏分时，用馏分收集器6收集目标馏分。
S3-4重复上述步骤S3-1～S3-3，其中S3-2中依次切换第一捕集柱切换阀13和第二捕集柱切换阀14的1号工作位与3-10号工作位连接，从而依次对第二捕集柱52至第九捕集柱59上不同目标馏分的洗脱和再生。
其中，槲皮素洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为90:10，山奈酚洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为87:13，异鼠李素洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为85:15，银杏双黄酮洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为63:37，异银杏双黄酮洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为60:40，金松双黄酮洗脱流动相甲醇:0.2％乙酸水重量比为50:50。
完成第二维色谱分离，收集得到第二维目标馏分洗脱液(如图4-14所示)。
S4将第二维目标馏分洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度为99％的槲皮素，纯度为98％的山奈酚，纯度为99％的异鼠李素，纯度为99％的银杏双黄酮，纯度为99％的异银杏双黄酮，纯度为98％的金松双黄酮(如下表所示)。
本发明能够同时精细纯化银杏单黄酮和银杏双黄酮，纯化产品纯度达到98％以上，可以达到较高的纯度和收率。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了第一泵系统1、第二泵系统2、第一色谱柱3、第二色谱柱4、捕集柱5、旁路50、第一捕集柱51、第二捕集柱52、第三捕集柱53、第四捕集柱54、第五捕集柱55、第六捕集柱56、第七捕集柱57、第八捕集柱58、第九捕集柱59、馏分收集器6、废液池7、检测器8、混合器9、二位十通阀10等术语。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (6)

1.一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于，该方法基于纯化银杏黄酮的多维液相色谱装置，包括：
第一泵系统(1)；
第二泵系统(2)；
色谱柱阵列，包括并联的第一色谱柱(3)和第二色谱柱(4)，以及用于切换第一色谱柱(3)和第二色谱柱(4)其一为导通路径的色谱柱切换装置；
捕集柱阵列，包括并联的若干捕集柱(5)和至少一个旁路(50)，以及用于切换若干捕集柱(5)和旁路(50)其一为导通路径的捕集柱切换装置；
用于收集目标组分的馏分收集器(6)；
连接馏分收集器(6)的废液池(7)；
连接所述色谱柱阵列的检测器(8)；
连接检测器(8)和第二泵系统(2)的混合器(9)；
以及
二位十通阀(10)，具有依次导通第一泵系统(1)、色谱柱阵列、检测器(8)、混合器(9)、捕集柱阵列、馏分收集器(6)和废液池(7)的A位置，和依次导通第一泵系统(1)、捕集柱阵列、色谱柱阵列、检测器(8)、混合器(9)、馏分收集器(6)和废液池(7)的B位置；
所述二位十通阀(10)处于A位置时，所述色谱柱阵列中有且仅有第一色谱柱(3)所在路径导通；所述二位十通阀(10)处于B位置时，所述色谱柱阵列中有且仅有第二色谱柱(4)所在路径导通；
纯化银杏黄酮的方法包括以下步骤：
1)第一维制备液相色谱纯化
将银杏叶提取液上样到第一色谱柱(3)，以甲醇-磷酸水为流动相在二位十通阀(10)A位置对第一色谱柱(3)进行洗脱；
2)目标组分获取
待检测器(8)检测到第一色谱柱(3)上洗脱出的目标馏分时，将目标馏分富集到捕集柱阵列中进行第一维色谱分离；
3)第二维制备液相色谱纯化
以甲醇-乙酸水为流动相，在二位十通阀(10)B位置，洗脱捕集柱阵列中的目标馏分依次上样至第二色谱柱(4)进行二维纯化，并在第二色谱柱(4)洗脱状态下，当检测器(8)检测到对应目标馏分时，用馏分收集器(6)收集得到第二维目标馏分洗脱液；
4)将第二维目标馏分洗脱液干燥，得到产品。
2.如权利要求1所述的一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于：所述甲醇-磷酸水的重量比为2:1～1:2，其中磷酸含量占甲醇-磷酸水总重量的0.1％-1％，目标馏分的洗脱体积为第一色谱柱(3)柱体积的1～15倍。
3.如权利要求1所述的一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于：所述捕集柱(5)捕获目标馏分体积为捕集柱(5)柱体积的3～20倍。
4.如权利要求1所述的一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于：所述甲醇-乙酸水的重量比为9:1～1:1，其中乙醇含量占甲醇-乙酸水总重量的0.1％-1％，目标馏分的洗脱体积为第二色谱柱(4)柱体积的1～10倍。
5.如权利要求4所述的一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于：第二维制备液相色谱纯化过程中，甲醇-乙酸水的比重随目标馏分的切换梯级递减。
6.如权利要求1所述的一种纯化银杏黄酮的方法，其特征在于：所述捕集柱阵列包括并联的至少五个捕集柱(5)和一个旁路(50)；其中，所述至少五个捕集柱(5)包括第一捕集柱(51)、第二捕集柱(52)、第三捕集柱(53)、第四捕集柱(54)和第五捕集柱(55)，第一捕集柱(51)、第二捕集柱(52)、第三捕集柱(53)和第四捕集柱(54)为C18色谱柱，第五捕集柱(55)为C8色谱柱；
第一维制备液相色谱纯化过程中，检测器(8)检测不同的目标馏分信号后，捕集柱阵列中，通过切换捕集柱切换装置，依次使用至少五个捕集柱(5)捕获不同的目标馏分；
其中，至少五个捕集柱(5)依次包括第一捕集柱(51)、第二捕集柱(52)、第三捕集柱(53)、第四捕集柱(54)和第五捕集柱(55)；
第一捕集柱(51)捕获第一馏分含槲皮素，第二捕集柱(52)捕获第二馏分含山奈酚，第三捕集柱(53)捕获第三馏分含异鼠李素，第四捕集柱(54)捕获第四馏分含银杏双黄酮及异银杏双黄酮，第五捕集柱(55)捕获第五馏分含金松双黄酮；
第二维制备液相色谱纯化过程中，检测器(8)检测不同的目标馏分信号后，捕集柱阵列中，通过切换捕集柱切换装置，依次洗脱至少五个捕集柱(5)上不同的目标馏分到第二色谱柱(4)中。
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