CN110646524B - 一种黄曲霉毒素m族专用净化柱及应用 - Google Patents

一种黄曲霉毒素m族专用净化柱及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于乳及乳制品质量安全检测领域，具体公开了黄曲霉毒素M族专用净化柱及应用，包括柱管，所述柱管内从柱管出液端至柱管进液端依次设有下筛板、填料和上筛板，所述填料为石墨化碳和纳米四氧化三铁的混合物。本发明还公开了上述专用净化柱在净化及检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M族的应用。本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱，制作方法简便、成本低廉，应用于乳及乳制品的检测，可简化操作，缩短检测时间；它还能够特异性吸附AFM1和AFM2，吸附效果极好，经其净化后，进样的杂质大大减少，具有极强的实际推广意义。

Description

一种黄曲霉毒素M族专用净化柱及应用
技术领域
本发明属于乳及乳制品质量安全检测领域，特别涉及一种黄曲霉毒素M族专用净化柱及应用。
背景技术
黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)是奶牛摄入污染了黄曲霉毒素B1(AFB1)的饲料后在体内羟基化生成的产物，常分泌于乳汁中，性质稳定，经巴氏杀菌或高温灭菌后几乎不被破坏。AFM1能够抑制肝脏细胞中RNA的合成，阻止和影响蛋白质、脂肪、线粒体、酶等的合成与代谢，导致突变、癌症及肝细胞坏死，2002年国际癌症研究机构将其列为Ⅰ类致癌物。世界许多国家和地区严格规定了AFM1的限量标准，其中中国、美国规定乳及乳制品中AFM1的残留限量均为0.5μg/kg。
近年来，研究发现黄曲霉毒素B2(AFB2)经常伴随AFB1污染奶牛饲料，并通过羟基化生成另一种致癌性代谢产物——黄曲霉毒素M2(AFM2)。迄今，国内外对AFM2的相关检测方法和风险评估报道较少。随着人们生活水平的提高，乳及乳制品需求量的增大，黄曲霉毒素M族(包含AFM1和AFM2)在乳及乳制品中的污染将引发越来越多的关注。考虑到AFM2潜在的风险，我国新修订的标准GB 5009.24-2016规定了检测AFM1、AFM2的方法，对原来仅检测AFM1的方法进行了更新。
目前，AFM1检测比较常用的方法是高效液相色谱-荧光法，其前处理过程通常采用免疫亲和柱净化样品。但是，免疫亲和柱法操作步骤繁琐，技术要求相对较高；而且，针对AFM1设计的免疫亲和柱，对AFM2的吸附效果往往不理想，导致AFM2的回收率不高；另外，就成本而言，AFM1免疫亲和柱单支价格在100元左右，而且其有效期较短，无形之中增加了检测成本。
因此，寻找具有特异性吸附效果的吸附剂，设计一种操作简单、价格低廉、保存方便的黄曲霉毒素M族专用净化柱，以实现AFM1、AFM2的同步有效净化并应用于乳及乳制品的检测，在实际生产中具有广阔的市场推广前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于乳及乳制品中黄曲霉毒素M族检测的专用净化柱，该专用净化柱对黄曲霉毒素M族(AFM1、AFM2)具有特异性吸附作用，不仅提高了吸附效果、简化了制备流程，还降低了生产成本。
本发明的目的还在于提供了上述专用净化柱在净化乳及乳制品中黄曲霉毒素M族的应用以及在检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M族含量的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于乳及乳制品中黄曲霉毒素M族检测的专用净化柱(命名为AFM-P柱)，包括柱管，所述柱管内从柱管出液端至柱管进液端依次设有下筛板、填料和上筛板，所述填料为石墨化碳(PestiCarb)和纳米四氧化三铁(Fe3O4)的混合物。
本发明利用PestiCarb和纳米Fe3O4混合物作为净化柱填料，其中的PestiCarb对黄曲霉毒素M族具有较好的吸附效果，纳米Fe3O4是一种磁性纳米材料，能够较好的吸附乳及乳制品中的潜在微量元素，且不易被洗脱下来。添加Fe3O4不仅不影响PestiCarb的吸附能力，而且利用Fe3O4的不可逆竞争吸附，可减少其他杂质的干扰，使制得的AFM-P柱对乳及乳制品中的黄曲霉毒素M族具有很好的特异性吸附作用。
所述黄曲霉毒素M族为黄曲霉毒素M1(AFM1)或/和黄曲霉毒素M2(AFM2)。
所述石墨化碳的粒径为120～400目，所述纳米四氧化三铁的粒径为10～30nm。
所述的纳米四氧化三铁与石墨化碳的重量比为1：2～4。优选地，所述的纳米四氧化三铁与石墨化碳的重量比为1：3。
所述上筛板和下筛板为聚乙烯筛板，其孔径为10μm。
采用上述优选方案的AFM-P柱能进一步提高对黄曲霉毒素M族的吸附效果，柱容量能满足检测需求。
上述专用净化柱的制备方法为：在柱管出液端安装所述的下筛板，将石墨化碳和纳米四氧化三铁混合，从柱管进液端装填入柱管内，再将上筛板安装入柱管内，其中，上筛板、下筛板与柱管过盈配合安装，压紧即得。
本发明还公开了上述的专用净化柱在净化乳及乳制品中黄曲霉毒素M族的应用。
所述净化的方法包括以下步骤：
(1)将乳及乳制品先经过预处理得到提取液，再将提取液过专用净化柱；
(2)用淋洗溶剂对专用净化柱进行淋洗；再用洗脱溶剂对专用净化柱中的黄曲霉毒素M族(AFM1、AFM2)进行洗脱，得到净化后的乳及乳制品。
所述淋洗溶剂为乙腈、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液或50％甲醇水溶液。上样后直接洗脱，一些杂质也会随目标物洗脱下来，因此，在洗脱前对净化柱进行淋洗，尽量去除杂质，有助于保护仪器和色谱柱，减少检测干扰。
优选地，所述淋洗溶剂为50％乙腈水溶液。这是由于采用50％乙腈水溶液作为淋洗溶剂去除杂质效果较好，能够消除AFM1和AFM2之间的一个杂峰，而且淋洗后杂质峰面积显著减小。
所述洗脱溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯。
优选地，所述洗脱溶剂为二氯甲烷。这是由于二氯甲烷不仅对目标物的洗脱能力较强，洗脱回收率均高达80％以上，而且二氯甲烷的沸点较低、容易挥干、毒性较小，更适合实际的生产应用。
本发明还公开了上述专用净化柱在检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M族(AFM1、AFM2)含量的应用。
所述检测的方法包括如下步骤：
(1)向乳及乳制品样品中加入提取溶剂，振荡、超声处理后，加入NaCl，离心取上清液；再将上清液过专用净化柱，利用淋洗溶剂淋洗、洗脱溶剂洗脱，接洗脱液；
(2)洗脱液用氮气吹干，加入流动相复溶，振荡、超声处理后，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱法进行检测。
上述超声处理后加入NaCl。这是由于添加NaCl于提取溶剂中，能更好的实现乙腈相和水相的分层，使AFM1、AFM2能够富集于乙腈相中，有利于样品的净化。
步骤(1)中，优选地，将乳及乳制品样品置于离心管中，加入提取溶剂，涡旋振荡20～40s，超声处理5～15min后，加入NaCl，涡旋振荡20～40s，6000～8000rpm离心3～6min，取上清液。
所述提取溶剂为乙腈与水的体积比为10：3～5的乙腈水溶液，提取溶剂的温度为40～60℃。
本发明采用一步提取法，即直接用乙腈水溶液提取，简化了操作步骤，缩短了提取时间。同时，考虑到当环境温度较低时，提取溶剂的温度会影响样品的溶解，因此，选择40～60℃的乙腈水溶液提取，有利于目标物的完全溶出。
所述淋洗溶剂为乙腈、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液或50％甲醇水溶液，优选为50％乙腈水溶液。
所述洗脱溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。
步骤(2)中，洗脱液用40～60℃氮气吹干，加入流动相复溶，涡旋振荡20～40s，超声处理5～15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱的制作方法简单，便于大规模生产，还可以由检测人员自行装填，具有极强的实际推广意义；
(2)本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱成本低廉，使用成本仅为AFM1免疫亲和柱的十分之一、黄曲霉毒素SPE柱的六分之一，大大降低了净化和检测费用；另外，该专用净化柱的柱容量可达到300ng，比免疫亲和柱200ng的柱容量大；
(3)本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱操作简单，净化时无需活化，通过重力过柱，净化全程约20min，相关方法的整个前处理过程约1h，大大缩短了使用时间，比其他方法缩短1～2h。
(4)本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱能够特异性吸附AFM1和AFM2，吸附效果极好，经其净化后，进样的杂质大大减少，不仅有利于目标物的准确定量，同时还保护了色谱柱和仪器。
(5)本发明的黄曲霉毒素M族专用净化柱应用于乳及乳制品的检测中，方法的灵敏度、精密度、准确度均能达到国标法检测的要求。
附图说明
图1为不同吸附剂的AFM1吸附率的柱状比较图；
图2为AFM-P柱净化效果的HPLC图；
图3为黄曲霉毒素SPE柱净化效果的HPLC图；
图4为AFM1免疫亲和柱净化效果的HPLC图；
图5为不同种类和用量的洗脱溶剂洗脱时AFM1和AFM2回收率的柱状比较图；
图6为不同淋洗溶剂淋洗时AFM1和AFM2回收率的柱状比较图；
图7为AFM1、AFM2标准溶液的HPLC图；
图8为不淋洗得到的洗脱液的HPLC图；
图9为乙腈淋洗后的洗脱液的HPLC图；
图10为10％乙腈水溶液淋洗后的洗脱液的HPLC图；
图11为50％乙腈水溶液淋洗后的洗脱液的HPLC图；
图12为50％甲醇水溶液淋洗后的洗脱液的HPLC图；
图13为巧克力奶提取液净化前后的表观比较图，其中，a：净化前；b：净化后；
图14为利用AFM-P柱处理奶粉提取液前后的HPLC图，其中，a：净化前；b：净化后。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
一、实施例：
1、净化柱填料的筛选
选取19种常见吸附剂(C18、Alumina-B、Alumina-N、Florisil、PSA、PestiCarb、NH2、NANO、Silica、Alumina-A、Kieselguhr、Fe3O4、COOH、CN、Diol、PRS、SAX、SCX、PS)，分别装入底部装有筛板的固相萃取柱空管中，NANO为30mg，其余均为150mg，并在吸附剂上方装入筛板，适当压紧，制备成19种固相萃取柱。取6mL提取液上样，收集全部流出液，于50℃氮气吹干，加入0.6mL流动相复溶，涡旋振荡30s，超声10min，过0.22μm滤膜后进行液相检测。
测试的固相萃取柱几乎都表现出对杂质一定的吸附能力，但直通式过柱并未达到理想的净化效果，特别是同步检测时，很多流出液的色谱图中AFM2被杂质严重干扰，无法准确定量。故以AFM1吸附率作为特异性吸附剂筛选依据，图1为19种吸附剂的AFM1吸附率柱状图。
由图1可见，COOH和SCX对目标物虽有一定的吸附能力，但吸附率均低于80％，而PestiCarb能够完全吸附上样液中的AFM1。此外，本发明发现添加Fe3O4不仅不影响PestiCarb的吸附能力，还可以减少其他杂质的干扰，因此，将PestiCarb与Fe3O4混合作为固相萃取填料。
实施例1：AFM-P柱的原料与制备
(1)原料：
柱管：容量为3mL，内径为1cm、长度为5cm；柱管内填料的填充量为200mg；
筛板：孔径为10μm的聚乙烯筛板；
填料：粒径为120～400目的石墨化碳(PestiCarb)及粒径为20nm的纳米四氧化三铁(Fe3O4)；
(2)制备：
在柱管出液端安装一片下筛板，再将150mg石墨化碳和50mg纳米四氧化三铁混合，从柱管进液端装填入柱管内，再将上筛板安装入柱管内，其中，上筛板、下筛板与柱管过盈配合安装，压紧即得。
实施例2：AFM-P柱的原料与制备
(1)原料：与实施例1中一致；
(2)制备：在柱管出液端安装一片下筛板，再将160mg石墨化碳和40mg纳米四氧化三铁混合，从柱管进液端装填入柱管内，再将上筛板安装入柱管内，其中，上筛板、下筛板与柱管过盈配合安装，压紧即得。
实施例3：AFM-P柱的原料与制备
(1)原料：与实施例1中一致；
(2)制备：在柱管出液端安装一片下筛板，再将120mg石墨化碳和60mg纳米四氧化三铁混合，从柱管进液端装填入柱管内，再将上筛板安装入柱管内，其中，上筛板、下筛板与柱管过盈配合安装，压紧即得。
对比实施例1～3制得的净化柱，发现实施例1制得的净化柱净化效果最好，由此可知，将150mg PestiCarb与50mg Fe3O4混合，以此组合为固相萃取填料制得的AFM-P柱即可达到较好的吸附效果。
二、对比例：
将实施例1制得的AFM-P柱与市场上常见的AFM1免疫亲和柱以及黄曲霉毒素SPE柱的价格及性能进行比较，得到的结果见下表1。
表1 AFM相关净化柱的比较
Figure BDA0002182579640000081
Figure BDA0002182579640000091
由上表1可知，AFM-P柱价格仅为AFM1免疫亲和柱的十分之一、黄曲霉毒素SPE柱的六分之一。用于AFM1、AFM2同步净化时，AFM-P柱与黄曲霉毒素SPE柱回收率相当，均在75％以上；AFM1免疫亲和柱只能用于AFM1的净化，对AFM2回收率不理想。
AFM-P柱比其他两种柱子净化效率高，操作更简单。而且，使用黄曲霉毒素SPE柱时，相应的提取过程特别复杂，整个样品前处理(包括提取、净化、氮吹、复溶)约需3h才能完成；AFM1免疫亲和柱由于上样和洗脱需要控制流速，导致前处理过程也较长，通常需要2h；AFM-P柱对应的检测方法，提取和净化过程简单，洗脱溶剂二氯甲烷极易吹干，1h左右即可完成整个前处理过程。
不同AFM相关净化柱净化效果的液相色谱图如图2～4所示，由图可知，AFM-P柱的净化效果与AFM1免疫亲和柱相近，杂质较少，能够准确定量；黄曲霉毒素SPE柱净化后杂质较多，特别是对AFM2无法达到理想的净化效果。
三、应用例：
1、提取方式的选择
称取1.0g奶粉于50mL离心管中，加标，涡旋振荡1min，静置1h。加入4mL 50℃水，涡旋振荡30s，超声10min，加入10mL乙腈，涡旋振荡30s，超声10min。分别添加0.5g、1g、1.5gNaCl，涡旋振荡30s，7000rpm离心5min，取上清液6mL，净化后检测。
结果发现，NaCl的添加量对奶粉中AFM1、AFM2的提取率影响不大。与不加盐相比，加入0.5g、1g、1.5g NaCl的样品，离心后均出现分层现象。20℃时，NaCl的溶解度为36g。理论上，在100g水中最多溶解36g NaCl，则4mL纯水中需要1.44g NaCl才能达到饱和状态。但可能由于奶粉的存在，促进了盐析，优选为添加0.5g NaCl于提取溶剂中。
以14mL乙腈水溶液(乙腈:水＝10:4)作为提取溶剂一步提取，与4mL水、10mL乙腈两步提取进行比较，发现对目标物的提取率无显著性差异。
2、洗脱方式的选择
取二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水各2mL，对上样后的AFM-P柱分别进行洗脱。结果发现，乙腈、甲醇、水几乎不能够洗脱目标物，但能去除杂质；而二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯对目标物均有一定的洗脱能力，分别用2、4、6mL洗脱，得到的AFM1和AFM2回收率的柱状比较图如图5。
由图5可知，丙酮和乙酸乙酯的洗脱回收率稍低，二氯甲烷和三氯甲烷对目标物的洗脱能力相当且较强，用量6mL时，洗脱回收率均可达80％以上。
3、淋洗方式的选择
取甲醇、乙腈、10％甲醇水溶液、10％乙腈水溶液、50％甲醇水溶液、50％乙腈水溶液、乙腈-甲醇(1:1)各2mL，对上样后的AFM-P柱分别进行淋洗，然后用6mL二氯甲烷分别洗脱，得到的AFM1和AFM2回收率的柱状比较图如图6所示。
由图6可知，与不淋洗相比，经甲醇、10％甲醇水溶液、乙腈-甲醇(1:1)淋洗后，目标物回收率下降较多；而经乙腈、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液、50％甲醇水溶液淋洗对回收率的影响不大，因此可作为淋洗溶剂。
AFM1、AFM2标准溶液的色谱图如图7所示，不淋洗以及经乙腈、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液、50％甲醇水溶液淋洗后的洗脱液色谱图分别如图8～12所示，对比可知，淋洗溶剂优选为50％乙腈水溶液时，去除杂质效果较好，能够消除AFM1和AFM2之间的一个杂峰，而且淋洗后杂质峰面积显著减小。
应用例1：利用实施例1制得的AFM-P柱净化奶粉中AFM1、AFM2
(1)称取1.0g奶粉于50mL离心管中，准确加入14mL 50℃乙腈水溶液(乙腈:水＝10:4)，涡旋振荡30s，超声10min；再加入0.5g NaCl，涡旋振荡30s，7000rpm离心5min，取上清液为奶粉提取液；
(2)准确吸取6mL奶粉提取液，过AFM-P柱，先用2mL 50％乙腈水溶液进行淋洗，再用6mL二氯甲烷对AFM-P柱中的AFM1、AFM2进行洗脱，得到净化液。
另外，使用AFM-P柱净化奶粉提取液净化前后表观比较图如图13所示，其中，图13a为净化前表观图，图13b为净化后表观图，比较可知，经AFM-P柱净化后，巧克力奶的颜色几乎完全消失，体现了AFM-P柱去除色素等杂质的超强能力。
应用例2：利用实施例1制得的AFM-P柱检测乳及乳制品中AFM1、AFM2含量
(一)检测奶粉、奶酪等固体、半固体样品，具体步骤如下：
称取1.0g样品于50mL离心管中，准确加入14mL 50℃乙腈水溶液(乙腈:水＝10:4)，涡旋振荡30s，超声10min；再加入0.5g NaCl，涡旋振荡30s，7000rpm离心5min。准确吸取6mL上清液，过AFM-P柱，用2mL 50％乙腈水溶液淋洗，用6mL二氯甲烷洗脱，得到的洗脱液用50℃氮气吹干，加入0.6mL流动相复溶，涡旋振荡30s，超声10min，过0.22μm滤膜后利用高效液相色谱法进行检测。
(二)检测牛奶、奶油等液态样品，具体步骤如下：
称取4.0g样品于50mL离心管中，准确加入10mL乙腈，涡旋振荡30s，超声10min；再加入0.5g NaCl，涡旋振荡30s，7000rpm离心5min。准确吸取6mL上清液，过AFM-P柱，用2mL50％乙腈水溶液淋洗，用6mL二氯甲烷洗脱。洗脱液用50℃氮气吹干。加入0.6mL流动相复溶，涡旋振荡30s，超声10min，过0.22μm滤膜后利用高效液相色谱法进行检测。
上述高效液相色谱法是使用带有荧光检测器的高效液相色谱仪进行检测，条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；
流动相：A相为1％乙酸水溶液，B相为乙腈-甲醇(50+50)，等度洗脱，A:B＝7:3；
流速：1.0mL/min；进样量：50μL；
检测波长：激发波长360nm，发射波长430nm。
检测得到的HPLC图如图14所示，其中，图14a为原始样本的HPLC图，图14b为经过AFM-P柱处理后HPLC图，比较可知，AFM-P柱的净化效果非常显著。

Claims (5)

1.一种黄曲霉毒素M族专用净化柱在检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M族含量的应用，其特征在于，
所述黄曲霉毒素M族为AFM1、AFM2，
所述专用净化柱，包括柱管，所述柱管内从柱管出液端至柱管进液端依次设有下筛板、填料和上筛板，所述填料为石墨化碳和纳米四氧化三铁的混合物；柱管内填料的填充量为200mg；
所述石墨化碳的粒径为120～400目，所述纳米四氧化三铁的粒径为10～30nm；
所述纳米四氧化三铁与石墨化碳的重量比为1：2～4；
检测的方法包括如下步骤：
(1)向乳及乳制品中加入提取溶剂，振荡、超声处理后，加入NaCl，离心取上清液；再将上清液过黄曲霉毒素M族专用净化柱，利用淋洗溶剂淋洗、洗脱溶剂洗脱，接洗脱液；
(2)洗脱液用氮气吹干，加入流动相复溶，振荡、超声处理后，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱法进行检测；
所述提取溶剂为乙腈与水的体积比为10：3～5的乙腈水溶液，提取溶剂的温度为40～60℃；
所述淋洗溶剂为乙腈、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液或50％甲醇水溶液；
所述洗脱溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯；
所述高效液相色谱法是使用带有荧光检测器的高效液相色谱仪进行检测，条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，250×4.6mm，5μm；柱温：40℃；
流动相：A相为1％乙酸水溶液，B相为乙腈-甲醇，50+50；等度洗脱，A:B＝7:3；
流速：1.0mL/min；进样量：50μL；
检测波长：激发波长360nm，发射波长430nm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述淋洗溶剂为50％乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述洗脱溶剂为二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述将上清液过黄曲霉毒素M族专用净化柱具体为：准确吸取6mL上清液，过黄曲霉毒素M族专用净化柱。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将上清液过黄曲霉毒素M族专用净化柱后，用2mL 50％乙腈水溶液淋洗，用6mL二氯甲烷洗脱。
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