CN109828038A - 一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相萃取柱在他克莫司制剂软膏分析中的应用，在供试品制备过程中采用以二醇基硅烷键合硅胶为填料的固相萃取柱进行纯化，通过混悬、活化、上样、淋洗、洗脱等步骤对他克莫司软膏样品中的他克莫司及其相关物质进行有效分离，且节省有机溶剂、用时较短、专属性好，不存在辅料干扰他克莫司杂质检测，杂质回收率也符合要求，特别适用于从他克莫司软膏的复杂基质中有效分离他克莫司及其相关物质。
Description
技术领域
本发明涉及药品分析领域，特别涉及一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，是1985年从链霉菌属(streptomycestsukubaensis)中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。由日本藤泽公司(现在的安斯泰来制药有限公司)研究开发，作为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较环孢素(CsA)强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肝、肾、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。
固相萃取柱(英文Solid Phase Extraction Column，简称SPE column，或SolidPhase extraction Cartridges，简称SPE cartridges)是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置。主要应用于各种食品、农畜产品、环境样品以及生物样品中目标化合物的样品前处理。SPE技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。SPE是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。
他克莫司软膏的基质组成主要是石蜡、液状石蜡、白凡士林、蜂蜡等复杂混合物，采用常规的溶剂提取或萃取等方法无法将他克莫司及其相关物质有效分离出来，而对杂质的控制是药品研发领域一个非常重要的环节，直接关系到药品的稳定性、有效性及安全性，因此，开发一种有效的他克莫司软膏样品处理方法来控制药品质量显得尤为重要。本专利提供一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，用于纯化他克司莫司软膏中的杂质，具有重复好、专属性好等优点，为制剂质量控制提供了保证。
发明内容
本发明的目的在于公开一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，提供一种操作简便、重复性良好、专属性好的他克莫司软膏杂质纯化方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种他克莫司软膏评价方法，其特征在于包含以下步骤：
1)离心管和梨形瓶的预处理：用甲醇润洗离心管和梨形瓶，烘干备用；
2)样品的称量、混悬、萃取：称取他克莫司软膏置离心管中，加入正己烷：乙酸乙酯混合溶液或混合对照品溶液，剧烈振荡至混悬完全，离心，取上清液作为作为待净化液；
3)固相萃取柱的活化：先用乙腈润洗，再用正己烷：乙酸乙酯混合溶液冲洗；
4)上样：将步骤2)所得的净化液全部转移入固相萃取柱；
5)淋洗：用正己烷：乙酸乙酯混合溶液淋洗固相萃取柱；
6)洗脱：用乙酸乙酯、乙腈洗脱固相萃取柱，用梨形瓶收集洗脱液；
7)将洗脱液利用旋转蒸发仪除去溶剂，加入正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液，涡旋使溶解，作为有关物质分析供试品溶液。
8)色谱条件：用羟丙基硅烷键合硅胶为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈为流动相，设置流速、柱温、检测波长、进样体积。
所述离心管和梨形瓶的预处理：用甲醇润洗离心管和梨形瓶2次，每次5ml，烘干备用；
所述样品的称量、混悬、萃取：称取样品0.5～2.0g，置离心管中，加入正己烷：乙酸乙酯(15∶1～9∶1)混合溶液，其中样品：混合溶液＝1g：3～10ml，剧烈振荡至混悬完全后，以3000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液作为待净化液；
所述混合对照品溶液：每1ml含他克莫司1mg、他克莫司杂质IX10μg、他克莫司杂质XV(OD-1)25μg、他克莫司杂质XI10μg，溶剂为正己烷-乙酸乙酯(10∶1)；
所述固相萃取柱的活化：固相萃取柱先用乙腈3～8ml润洗，再用正己烷：乙酸乙酯(15∶1～9∶1)混合溶液冲洗两次，每次3～8ml；
所述上样：将步骤2)所得的净化液全部转移入固相萃取柱，注意不要使沉淀悬浮；
所述淋洗：用正己烷：乙酸乙酯混合溶液(15∶1～9∶1)淋洗固相萃取柱4～8次，每次3～8ml，待每一次加入的淋洗液冲洗完全后，再进行下一次淋洗；
所述洗脱：先用乙酸乙酯3～8ml洗脱固相萃取柱，再用乙腈3～8ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；将洗脱液利用旋转蒸发仪除去溶剂(水浴温度控制在35～40℃)，加入正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)混合溶液0.5～2ml，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液。
所述色谱条件：用羟丙基硅烷键合硅胶为填充剂(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
所述固相萃取柱中的填料为正相硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶、二醇基硅烷键合硅胶为填料。
所述正相硅胶固相萃取柱为Waters Sep-Pak 6cc/500mg、CNWBOND 6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg。
所述十八烷基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Waters Sep-Pak C18 6cc/500mg、CNWBOND C18 6cc/500mg、Supelco C18 6cc/500mg。
所述二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Agilent Bond Elute 2OH 6cc/500mg、Waters Sep-Pak 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic 6cc/500mg、Welchrom 6cc/500mg、CNWBOND 6cc/500mg、Merck 6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg。
所述Waters Sep-Pak Diol固相萃取柱规格为1cc/100mg、3cc/200mg、3cc/500mg、6cc/500mg、6cc/1000mg、12cc/1000mg
本发明的有益效果是：
通过本发明的技术方案，他克莫司软膏的杂质控制更加精准，药品的安全性可以得到有效控制。
附图说明
图1他克莫司空白制剂供试品溶液HPLC图谱(Waters Sep-Pak Diol 6cc/500mg)
图2他克莫司制剂供试品溶液HPLC图谱(Waters Sep-Pak Diol 6cc/500mg)
图2中，1为他克莫司未知杂质A，2为他克莫司杂质IX，3为他克莫司杂质XV(OD-1)，4为他克莫司杂质XI，5为他克莫司未知杂质B，6为他克莫司，7为他克莫司异构体II。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施使用的仪器为：Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪(含四元分析泵、温控自动进样器、柱温箱、DAD检测器)；试剂及其来源：色谱级甲醇、正己烷、乙酸酯、乙腈、正丁基氯购于默克公司，试剂用水为纯化水；试药及其来源：他克莫司空白制剂(不含他克莫司，广州迈达康医药科技有限公司)、他克莫司制剂(广州迈达康医药科技有限公司)。
所述他克莫司制剂的组成成分，以质量比计算，他克莫司含量是0.08％～0.12％，白凡士林含量是56.0％～60.0％，液状石蜡含量是28.0％～32.0％％，碳酸丙烯酯的含量为4.0％～6.0％，石蜡含量为2.0％～4.0％，蜂蜡含量为2.0％～4.0％。
所述他克莫司空白制剂的组成成分，以质量比计算，白凡士林含量是56.0％～60.0％，液状石蜡含量是28.0％～32.0％％，碳酸丙烯酯的含量为4.0％～6.0％，石蜡含量为2.0％～4.0％，蜂蜡含量为2.0％～4.0％。
实施例1
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂和他克莫司制剂样品约1.0g，各7份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液5ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Agilent BondElute 2OH 6cc/500mg、Waters Sep-Pak 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic 6cc/500mg、Welchrom 6cc/500mg、CNWBOND 6cc/500mg、Merck6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg各两支，分别先用乙腈5ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液冲洗两次，每次5ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱6次，每次5ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯5ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈5ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为40℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液1.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：利用二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Agilent Bond Elute 2OH 6cc/500mg、Waters Sep-Pak 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic 6cc/500mg、Welchrom 6cc/500mg、CNWBOND6cc/500mg、Merck6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg对他克莫司制剂样品进行纯化，在他克莫司空白制剂色谱图中，与他克莫司制剂杂质对应的峰位无干扰，专属性符合要求，所应用的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱适合本方法研究。
实施例2
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂约1.0g，8份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向离心管中加入混合对照品溶液1ml，再加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液4ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Agilent BondElute 2OH 6cc/500mg、Waters Sep-Pak 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic 6cc/500mg、Welchrom 6cc/500mg、CNWBOND 6cc/500mg、Merck6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg各两支，分别先用乙腈5ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液冲洗两次，每次5ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱6次，每次5ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯5ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈5ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为40℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液1.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：在他克莫司空白制剂样品制备过程中加入他克莫司(100％)、他克莫司杂质IX(1.0％，限度浓度)、他克莫司杂质XV(2.5％，限度浓度)、他克莫司杂质XI(1.0％，限度浓度)，利用实施例4中二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Agilent Bond Elute 2OH 6cc/500mg、Waters Sep-Pak 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic 6cc/500mg、Welchrom 6cc/500mg、CNWBOND6cc/500mg、Merck6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg进行回收率实验，在他克莫司空白制剂色谱图中，专属性符合要求；他克莫司回收率在98.0％-102.0％范围内，他克莫司杂质IX、他克莫司杂质XV和他克莫司杂质XI均在90.0％-110％范围内，均符合要求，实施例4所应用的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱适合本方法研究。回收率结果见表1。
表1 他克莫司及杂质回收率表
实施例3
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂约0.5g，6份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向4支离心管中加入混合对照品溶液0.5ml，再加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液2.5ml，分别向另2支离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液3ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol不同规格1cc/100mg、3cc/200mg各3支，分别先用乙腈3ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(9∶1)的混合溶液冲洗两次，每次3ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(9∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱4次，每次3ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯3ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈3ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为35℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液0.5ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：在他克莫司空白制剂样品制备过程中加入他克莫司(100％)、他克莫司杂质IX(1.0％，限度浓度)、他克莫司杂质XV(2.5％，限度浓度)、他克莫司杂质XI(1.0％，限度浓度)，利用实施例5中二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol 1cc/100mg和3cc/200mg进行回收率实验，用2种固相萃取柱处理的他克莫司空白制剂色谱图中，杂质无干扰，专属性符合要求；他克莫司回收率在98.0％-102.0％范围内，他克莫司杂质IX、他克莫司杂质XV和他克莫司杂质XI均在90.0％-110％范围内，均符合要求，实施例5中所应用的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱适合本方法研究。回收率结果见表2。
表2 他克莫司及杂质回收率表
实施例4
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂约1.0g，6份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向4支离心管中加入混合对照品溶液1ml，再加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液4ml，分别向另2支离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液5ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol不同规格3cc/500mg、6cc/500mg各3支，分别先用乙腈5ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液冲洗两次，每次5ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱6次，每次5ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯5ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈5ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为38℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液1.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：在他克莫司空白制剂样品制备过程中加入他克莫司(100％)、他克莫司杂质IX(1.0％，限度浓度)、他克莫司杂质XV(2.5％，限度浓度)、他克莫司杂质XI(1.0％，限度浓度)，利用二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol 3cc/500mg和6cc/500mg进行回收率实验，用2种固相萃取柱处理的他克莫司空白制剂色谱图中，杂质无干扰，专属性符合要求；他克莫司回收率在98.0％-102.0％范围内，他克莫司杂质IX、他克莫司杂质XV和他克莫司杂质XI均在90.0％-110％范围内，均符合要求，应用的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱适合本方法研究。回收率结果见表3。
表3 他克莫司及杂质回收率表
实施例5
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂约2.0g，6份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向4支离心管中加入混合对照品溶液2ml，再加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液8ml，分别向另2支离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液10ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol不同规格6cc/1000mg、12cc/1000mg各3支，分别先用乙腈8ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(15∶1)的混合溶液冲洗两次，每次8ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(15∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱8次，每次8ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯8ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈8ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为40℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液2.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：在他克莫司空白制剂样品制备过程中加入他克莫司(100％)、他克莫司杂质IX(1.0％，限度浓度)、他克莫司杂质XV(2.5％，限度浓度)、他克莫司杂质XI(1.0％，限度浓度)，利用二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak Diol 6cc/1000mg和12cc/1000mg进行回收率实验，用2种固相萃取柱处理的他克莫司空白制剂色谱图中，杂质无干扰，专属性符合要求；他克莫司回收率在98.0％-102.0％范围内，他克莫司杂质IX、他克莫司杂质XV和他克莫司杂质XI均在90.0％-110％范围内，均符合要求，所应用的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱适合本方法研究。回收率结果见表4。
表4 他克莫司及杂质回收率表
以上所述仅是本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这种改进和补充也应视为本发明的保护范围。
对比例1
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂和他克莫司制剂样品约1.0g，各3份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液5ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取正相硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak 6cc/500mg、CNWBOND6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg各两支，分别先用乙腈5ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液冲洗两次，每次5ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱6次，每次5ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯5ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈5ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为40℃；i)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液1.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：利用正相硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak 6cc/500mg、CNWBOND6cc/500mg、Supelco 6cc/500mg对他克莫司制剂样品进行纯化，在他克莫司空白制剂色谱图中，与他克莫司制剂杂质对应的峰位有干扰，专属性不符合要求，所应用的正相硅胶固相萃取柱不适合本方法研究。
对比例2
一种固相萃取柱在他克莫司制剂杂质分析中的应用，包括如下步骤：
a)用甲醇润洗离心管和梨形瓶两次，每次5ml，烘干备用；b)分别称取他克莫司空白制剂和他克莫司制剂样品约1.0g，各3份，置具塞玻璃离心管中；c)分别向离心管中加入正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液5ml，剧烈振荡至混悬完全；d)以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液作为待净化液；e)取十八烷基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-PakC186cc/500mg、CNWBOND C18 6cc/500mg、Supelco C18 6cc/500mg各两支，分别先用乙腈5ml润洗，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液冲洗两次，每次5ml；f)将待净化液小心转移至e)步骤活化的固相萃取柱中，转移时注意不要使沉淀悬浮；g)分别用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合溶液淋洗吸附待净化液的固相萃取柱6次，每次5ml，待每一次加入的淋洗液淋洗完全后，再进行下一次淋洗；h)分别先用乙酸乙酯5ml洗脱固相萃取柱，待洗脱完全后，再用乙腈5ml洗脱，用梨形瓶收集两次的洗脱液；i)分别将收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为40℃；j)分别精密量取正己烷-正丁基氯-乙腈(1∶1∶1)的混合溶液1.0ml，置蒸发后得到的残余物中，涡旋使残余物溶解，作为有关物质分析供试品溶液；
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6*250mm)为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果：利用十八烷基硅烷键合硅胶固相萃取柱Waters Sep-Pak C18 6cc/500mg、CNWBOND C18 6cc/500mg、Supelco C18 6cc/500mg对他克莫司制剂样品进行纯化，在他克莫司空白制剂色谱图中，与他克莫司制剂杂质对应的峰位有干扰，专属性不符合要求，所应用的十八烷基硅烷键合硅胶固相萃取柱不适合本方法研究。
Claims (5)
1.一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)离心管和梨形瓶的预处理：用甲醇润洗离心管和梨形瓶，烘干备用；
2)样品的称量、混悬、萃取：称取他克莫司软膏置离心管中，加入正己烷∶乙酸乙酯混合溶液或混合对照品溶液，剧烈振荡至混悬完全，离心，取上清液作为作为待净化液；
3)固相萃取柱的活化：先用乙腈润洗，再用正己烷∶乙酸乙酯混合溶液冲洗；
4)上样：将步骤2)所得的净化液全部转移入固相萃取柱；
5)淋洗：用正己烷∶乙酸乙酯混合溶液淋洗固相萃取柱；
6)洗脱：用乙酸乙酯、乙腈洗脱固相萃取柱，用梨形瓶收集洗脱液；
7)将洗脱液利用旋转蒸发仪除去溶剂，加入正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液，涡旋使溶解，作为有关物质分析供试品溶液。
8)色谱条件：用羟丙基硅烷键合硅胶为填充剂，两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
2.根据权利要求1任一项所述的一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，其特征在于：所述固相萃取柱中的填料为二醇基硅烷键合硅胶填料。
3.根据权利要求2所述的一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，其特征在于：所述的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Agilent Bond Elute 2OH Diol、WatersSep-Pak Diol、Simon Aldrich Classic Diol、Welchrom Diol、CNWBOND Diol、MerckDiol、Supelco Diol中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，其特征在于：所述的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Agilent Bond Elute 2OH Diol 6cc/500mg、Simon Aldrich Classic Diol 6cc/500mg、Welchrom Diol 6cc/500mg、CNWBONDDiol 6cc/500mg、Merck Diol 6cc/500mg、Supelco Diol 6cc/500mg。
5.根据权利要求3所述的一种固相萃取柱在他克莫司软膏杂质分析中的应用，其特征在于：所述的二醇基硅烷键合硅胶固相萃取柱为Waters Sep-Pak Diol 1cc/100mg、3cc/200mg、3cc/500mg、6cc/500mg、6cc/1000mg、12cc/1000mg。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114428133A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-03 | 江苏知原药业股份有限公司 | 一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质xv含量的方法 |
| WO2022252730A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 山东霆科药业有限公司 | 一种他克莫司软膏有关物质的检测方法 |
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2017
- 2017-11-23 CN CN201711233048.7A patent/CN109828038A/zh active Pending
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| WO2022252730A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 山东霆科药业有限公司 | 一种他克莫司软膏有关物质的检测方法 |
| CN114428133A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-03 | 江苏知原药业股份有限公司 | 一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质xv含量的方法 |
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Addressee: Liu Ying Document name: Deemed as a notice of withdrawal |
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Application publication date: 20190531 |
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