CN102008946A

CN102008946A - 替代模板法制备拉米夫定分子印迹固相萃取柱及其应用

Info

Publication number: CN102008946A
Application number: CN2010105138857A
Authority: CN
Inventors: 吐尔洪·买买提; 曾何华; 努尔买买提·库达巴尔地
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2011-04-13

Abstract

本发明涉及吸附材料的制备及其在药物分离、富集中的应用，是一种拉米夫定分子印迹聚合物和拉米夫定分子印迹固相萃取柱的制备及其应用。通过酯化合成得到拉米夫定酯化物。该分子印迹聚合物以拉米夫定酯化物为模板，以甲基丙烯酸为单体、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，氯仿为致孔剂，采用本体聚合法合成分子印迹聚合物，将分子印迹聚合物颗粒均匀填充于固相萃取柱内，得到拉米夫定分子印迹固相萃取柱。本发明实现了生物样品中拉米夫定的高效分离、富集与纯化，与以往普通溶剂萃取法、C18固相萃取法等相关技术相比，选择性高，并且拉米夫定分子印迹固相萃取柱可以重复使用，成本低，可望成为生物样品中拉米夫定前处理的必备手段。

Description

替代模板法制备拉米夫定分子印迹固相萃取柱及其应用

一、技术领域：

本发明涉及药物分析领域，具体地说是涉及一种拉米夫定分子印迹固相萃取(MISPE)柱及制备方法，并主要用于生物样品中拉米夫定的高选择性分离、富集和纯化。

二、背景技术：

拉米夫定(3TC)，化学名为(2R-顺式)-4氨基-1-(2-羟甲基1，3-氧硫杂交环戊-5基)1H-嘧啶-2酮。1995年被FDA批准用于治疗HIV感染，拉米夫定抗病毒作用强，且能提高机体免疫能力[叶金朝.抗免疫缺陷病毒药-拉米夫定.国外医药：合成药、生化药、制剂分册，1998，19(2)：83～84]。

由于生物样品中许多内源性物质的存在，使得样品净化成为必要步骤。目前，生物样品中的拉米夫定前处理手段较多，如溶剂萃取和固相萃取法，结合高效液相色谱法。溶剂萃取法需要大量的有机溶剂，耗时且存在严重的基体干扰，其它方法的仪器昂贵。固相萃取法(SPE)出现于20世纪70年代，至今已成为许多领域样品预处理的常用方法。传统的SPE吸附剂选择性不佳，在富集分析物过程中存在大量基体和干扰物质。因此，发展快速、高效、高选择性、环境友好的样品前处理技术非常重要[中国科学B辑：化学，2009，39(8)：733]。分子印迹聚合物(MIP)是为模板分子量身定做的高分子聚合物，具有预定性、实用性和识别性等特点[Chemistry of Materials，2008，20(3)：859；Anal.Chem.，2009，81(4)：1615]。由于模板选择的多样性，使得MIP能广泛应用于物质的分离与分析过程，它对于目标物质的高度选择性也是普通SPE填料所不能比拟的[分析化学，2007，35(9)：1319；Analytical Letters，2009，42(3)：600]。目前关于拉米夫定MISPE柱的制备未见报道。

三、发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种拉米夫定MISPE柱及制备方法和应用，以高效地选择性分离富集血清、血浆等生物样品提取液中的拉米夫定，结合光度法或高效液相色谱即可实现生物样品中拉米夫定的快速分析。为实现上述目的，本发明以拉米夫定为模板，衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以N，N-二甲基甲酰胺为致孔剂，偶氮二乙丁腈为引发剂，进行聚合制备出MIP后，填充在固相萃取柱内得拉米夫定MISPE柱。

仪器与试剂

UV-2450紫外可见分光光度计、LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Inertsil ODS-SP(5μm，4.6×250mm)C18色谱柱；HumanpowerIII超纯水处理器(韩国)；HC-2518微量高速离心机(安徽中科中佳科学仪器)；5S1020固相萃取仪(北京振翔工贸有限公司)。

乙腈、无水乙醇、乙醚、二氯甲烷、四氯化碳、正庚烷、甲醇、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、三水合醋酸钠均为市售分析纯。三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM，东京化成工业株式会社生产)，偶氮二乙丁腈(AIBN，化学纯，上海试剂厂)。齐多夫定(AZT)、拉米夫定、奈韦拉平(NEV)为原料药(杭州大阳化工有限公司生产)。

四、附图说明：

附图1为拉米夫定溶液在MIP与非印迹聚合物(NIP)上的吸附量随浓度变化曲线。

附图2为0.5mg/L拉米夫定溶液HPLC图：2a为拉米夫定标准品溶液；2b为拉米夫定血清提取液-未经过MISPE柱；2c为拉米夫定血清提取液-经过MISPE柱。

五、具体实施方式：

A)拉米夫定酯化物(3TC-Es)的合成：将吡啶2.4mL和拉米夫定1.0g置于反应瓶中，充分溶解后加入醋酸酐2mL，于室温下搅拌2小时后蒸出溶剂及未反应完的醋酸酐，将得到白色粗产物用氯仿溶解，用水萃取，收集氯仿层，水层继续用氯仿提取3次，合并氯仿溶液，蒸除氯仿，得到白色固体，将白色固体用乙醇重结晶，得到白色的絮状拉米夫定酯化产物；

B)将模板、功能单体、交联剂、按1mmol∶4mmol∶20mmol的配比和引发剂40mg、致孔剂氯仿16mL一起置于50mL圆底烧瓶中，充分溶解混匀，超声脱气5min，通氮气15min，于45℃恒温油浴锅中加热24h。

C)将步骤B)制备的聚合物磨碎成粉末，粉末过筛，收集粒径在38～75μm的聚合物，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1∶9，V/V)溶液洗至无拉米夫定检出，继续用甲醇洗去乙酸，最后真空干燥至恒重，得拉米夫定MIP颗粒。

D)称取100mg上述拉米夫定MIP颗粒，均匀填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上放置聚乙烯塞板，制得本发明的拉米夫定MISPE柱。

选取与3TC-Es具有不同结构类似程度的3TC、AZT以及NEV，考察它们在3TC-Es分子印迹及非印迹聚合物材料所装填的固相萃取柱上的保留和被分离情况。萃取柱对NEV基本没有保留能力，直接发生穿漏；AZT虽然在萃取柱上有一定吸附，但被吸附的部分在经过除杂和洗脱后就全部脱落。这说明两种物质都与固相萃取柱结合比较弱。实验表明，与模板分子结构类似程度最高的3TC全部被萃取柱保留。

表各化合物MISPE上的回收率(％)

E)取空白牛血清0.3mL样品，置具塞离心管中，精密加入1.0g/L拉米夫定的水溶液0.3mL，涡旋混匀1min，加入乙腈2.4mL混匀后，于4000r/min离心30min除去蛋白质，取1.5mL上清液于60℃下N₂吹干，将残留物用2mL上样溶剂定容，取1mL溶液上样至事先经活化后的固相萃取柱，用5％甲醇-乙腈1mL淋洗，5％盐酸-甲醇1mL洗脱MISPE柱两次，洗脱液于45℃用N₂吹干，用HPLC测定。HPLC测定条件：色谱柱：Inertsil ODS-SP C₁₈(4.6mmx250mm，5μm)；紫外检测波长为272nm，柱温为室温，流动相为甲醇∶水＝20∶80，流速为0.8mL/min，进样量为20μL。

Claims

1.一种拉米夫定分子印迹固相萃取(MISPE)柱，其特征是固相萃取柱中填充有拉米夫定分子印迹聚合物(MIP)颗粒。

2.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱，其特征在于上述拉米夫定MIP颗粒大小为38～75μm。

3.拉米夫定MISPE柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

B)将拉米夫定酯化物(0.3133g，1mmol)、甲基丙烯酸(0.3444g，4mmol)、40mg偶氮二异丁腈(AIBN)、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(6.5mL，20mmol)，16mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，充分溶解混匀，超声脱气5min，通氮气15min，密封。将圆底烧瓶放入45℃恒温水浴锅中加热24h得到白色块状聚合物。将块状聚合物用研钵磨碎，过筛收集得到粒径在38～75μm，含有拉米夫定的MIP颗粒；

C)将上述含有拉米夫定的MIP颗粒，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1∶9，V/V)溶液洗至无拉米夫定检出，继续用甲醇洗去乙酸，再经甲醇反复沉降，滤去甲醇，将获得的颗粒物真空干燥至恒重，即为拉米夫定MIP颗粒；

D)称取100mg上述拉米夫定MIP颗粒，均匀填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上放置塞板，制得拉米夫定MISPE柱。

4.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱，其特征在于将上述拉米夫定MIP颗粒填充在聚丙烯固相萃取柱内得拉米夫定MISPE柱。

5.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱用途，其特征在于利用该拉米夫定MISPE柱分离富集生物样品中的拉米夫定。

6.如权利要求5所述的拉米夫定MISPE柱的用途，其特征在于用该拉米夫定MISPE柱分离富集血清(或血浆)样品拉米夫定提取液，以正庚烷∶四氯化碳＝1∶1为上样溶剂、4％乙醇-四氯化碳为淋洗剂、甲醇为洗脱溶剂。

7.如权利要求6所述的拉米夫定MISPE柱应用于血清(或血浆)样品拉米夫定提取液，其特征在于上述血清样品拉米夫定提取液制备方法是取空白牛血清0.3mL样品，置具塞离心管中，精密加入1.0g/L拉米夫定的水溶液0.3mL，涡旋混匀1min，加入乙腈2.4mL混匀后，于4000r/min离心30min除去蛋白质，精密量取上清液1.0mL作为生物样品提取液。