CN105628844B

CN105628844B - 一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法

Info

Publication number: CN105628844B
Application number: CN201511026673.5A
Authority: CN
Inventors: 熊琳; 李维红; 郭志廷; 杨晓玲; 高雅琴
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: CN105628844A

Abstract

本发明公开一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，该方法包括如下步骤：（1）动物组织样品用乙酸乙酯提取，提取液蒸干；（2）将步骤（1）蒸干余下的残渣溶解，调节溶液至酸性后，加入净化剂聚N‑乙烯吡咯烷酮‑二乙烯苯磺酸钠进行吸附，分离，再用碱液对净化剂进行解吸，得到的解吸液挥干；（3）步骤（2）挥干得到的残渣用流动相溶解之后上高效液相色谱仪，进行色谱测定。本发明方法在测定动物组织中残留的苯并咪唑类药物时具有良好的准确度、灵敏度和重现性。与现有方法相比，本发明采用聚N‑乙烯吡咯烷酮‑二乙烯苯磺酸钠作为苯并咪唑类药物的净化剂，使净化操作更为简单便捷。

Description

一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法

技术领域

本发明涉及一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法。

背景技术

寄生虫病是养殖业中最常见的一类疾病，每年造成了巨大的经济上损失，其中一些寄生虫可以传播给人类，造成人体的感染。目前在肉产品中残留并对人具有较大危害的主要是苯并咪唑类驱虫药。人们食用苯并咪唑类药物残留量超标的肉品后,就会造成严重的不良影响，对人体造成直接的或通过环境和食物链的作用间接的产生急、慢性毒性作用，引起寄生虫耐药性增强,从长远角度来看还会影响到养殖业的发展和市场的正常秩序。现有的涉及肉品中的该类风险因子主要包含以下几种：奥芬达唑、芬苯达唑、阿苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、噻苯咪唑、丙氧苯咪唑等。因此为了保证广大民众的饮食安全，非常有必要建立起准确度高的肉品中苯并咪唑类药物残留的检测方法。

文献“高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留，林海丹等，食品科学，2011，第32卷02期，第231-236页”公开了一种同时测定动物组织中包括阿苯咪唑、奥芬达唑、芬苯达唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑等16种残留苯并咪唑类药物的方法，在该方法中，用乙酸乙酯提取动物组织样品中的残留苯并咪唑类药物后，由于动物组织样品成分复杂，需要先用正己烷脱除提取液中的类脂物，然后用MCX固相萃取柱净化，去除基质干扰后，再上机检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有高效液相色谱法测定动物组织中苯并咪唑类药物残留时需要经过复杂的脱脂和固相萃取净化处理的缺陷，提供了一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，本发明样品预处理更为简单。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，包括如下步骤：

(1)动物组织样品用乙酸乙酯提取，提取液蒸干；

(2)将步骤(1)蒸干余下的残渣溶解，调节溶液至酸性后，加入净化剂聚N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯磺酸钠进行吸附，分离，再用碱液对净化剂进行解吸，得到的解吸液挥干；

(3)步骤(2)挥干得到的残渣用流动相溶解之后上高效液相色谱仪，进行色谱测定。

进一步，所述苯并咪唑类药物为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑砜、羟基噻苯咪唑、噻苯达唑、奥苯达唑、2-氨基氟苯咪唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑。

进一步，步骤(1)提取时，加入碱和抗氧化剂。

更进一步，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述抗氧化剂为二叔丁基苯酚。

更进一步，所述碱的浓度为1-5g/L。

进一步，步骤(1)蒸干余下的残渣用乙腈溶解。

进一步，步骤(2)调节溶液至酸性后，氢离子浓度为1-1.5mol/L。

进一步，步骤(2)所述碱液为氨化乙腈。

进一步，所述氨化乙腈中氨的浓度为1-2mol/L。

进一步，步骤(3)的色谱条件：C₁₈柱，流动相为乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，其中流动相中乙腈的体积百分比随时间的变化如下：

0～15min，由20％线性变化至25％；

15～28min，由25％线性变化至30％；

28～38min，由30％线性变化至60％；

38min后，20％。

本发明方法在测定动物组织中残留的苯并咪唑类药物时具有良好的准确度、灵敏度和重现性。与现有高效液相色谱法测定动物组织中残留的苯并咪唑类药物样品前处理需要经过复杂的脱脂和固相萃取柱处理相比，本发明采用聚N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯磺酸钠作为苯并咪唑类药物的净化剂，使净化操作更为简单便捷。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是13种苯并咪唑类化合物的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、测定方法

1、样品前处理过程

准确称取5.0g的肉品样品，加入20mL的乙酸乙酯，0.15mL 50wt％氢氧化钠溶液和1mL 1wt％二叔丁基苯酚溶液。超声提取10min之后，以10000r/min的转速离心5min，用一次性滴管吸取上清液到茄型瓶中，提取两次，合并提取液，旋转蒸干。

上述蒸干后余下的残渣用1.5mL乙腈溶解，涡旋5min之后加入4.5mL 1.5mol/L盐酸溶液，涡旋均匀，震荡5min，将上述溶液转移到15ml离心管中，加入0.3g净化剂DVB-NVP-SO₃Na，震荡10min，完成之后以5000r/min的转速离心5min，倾倒出上层液，再向离心管中加入10mL 10％的氨化乙腈，涡旋均匀之后，震荡10min，以5000r/min的转速离心10min，上清液转移到另一离心管中，用氮气吹干。

上清液吹干后所得的残渣用0.5mL乙腈溶解，超声5min，再加1.5mL 0.025mol/L乙酸铵溶液，混合均匀，过0.22um复合滤膜，供高效液相色谱仪测定。

氨化乙腈的配制：将市售25-28wt％浓氨水和乙腈按照体积比为10:90混合得到。

2、色谱条件

Waters高效液相色谱仪带有二级阵列管检测器，采用waters公司Xbridge C18(5um*4.6um*250um)色谱分离柱，流动相为乙腈(A)-0.025mol/L的乙酸铵溶液(B)，采用梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为100μL，梯度洗脱程序如下：

0～15min，流动相中乙腈(A)的体积百分比由20％线性变化至25％；

15～28min，流动相中乙腈(A)的体积百分比由25％线性变化至30％；

28～38min，流动相中乙腈(A)的体积百分比由30％线性变化至60％；

38min后，流动相中乙腈(A)的体积百分比为20％。

使用以上色谱条件，所有的13种苯并咪唑类化合物(阿苯达唑亚砜、阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑砜、羟基噻苯咪唑、噻苯达唑、奥苯达唑、2-氨基氟苯咪唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑)都能够很好的分离，其他杂质峰较少，能够实现定性和定量判断，色谱图见图1。

采用单因实验，在其他条件不变的情况下，改变净化剂的用量，探究加标回收率和净化剂用量之间的关系，结果如表1所示：

表1净化剂的用量对目标苯并咪唑化合物净化效果的影响

当净化剂用量在0.4g、0.5g和0.6g时，和0.3g的用量相比之下，回收率没有明显的变化，从经济的角度出发，选择每5g样品加入净化剂0.3g。

采用单因实验，在其他条件不变的情况下，改变氨化乙腈的用量，探究加标回收率和氨化乙腈用量之间的关系，如表2所示。

表2氨化乙腈对回收率的影响

氨化乙腈用量在14mL、17mL和20mL时，和11mL的用量相比之下，回收率没有明显的变化，从经济的角度出发，选择每5g样品加入氨化乙腈11mL。

二、本发明方法的特征参数

1、回收率和相对标准偏差(RSD)

选定牛肉、羊肉、牛肝和羊肝4中肉品基质作为研究对象，来测定该方法在样品实际测定中的特征参数：回收率、相对标准偏差、最低检出限和最低定量限等。加标浓度分为高中低三个浓度，分别为：100μg/kg、50μg/kg和10μg/kg。测定了日内回收率和相对标准偏差RSD。牛肉和牛肝样品日间加标回收和日内加标回收数据如表3和表4。羊肉和羊肝样品日间加标回收和日内加标回收数据如表5和表6。

表3牛肉和牛肝样品日间加标回收和日内加标回收率

表4牛肉和牛肝样品日间加标回收和日内加标回收率

表5羊肉和羊肝样品日间加标回收和日内加标回收率

表6羊肉和羊肝样品日间加标回收和日内加标回收率

从表3-4中可以看出，该方法对牛肉中残留的13种苯并咪唑类药物的日间回收率为74.67-119.33％，相对标准偏差为RSD为1.04-22.81；日内回收率为82.06-94.87％，相对标准偏差为RSD为4.50-17.51。该方法对牛肝中残留的13种苯并咪唑类药物的日间回收率为72.0-113.33％，相对标准偏差为RSD为1.03-14.81；日内回收率为83.35-91.04％，相对标准偏差为RSD为5.27-9.46。

从表5-6中可以看出，该方法对羊肉中残留的13种苯并咪唑类药物的日间回收率为76.67-118.0％，相对标准偏差为RSD为2.93-20.42；日内回收率为81.78-89.11％，相对标准偏差为RSD为2.76-14.32。该方法对羊肝中残留的13种苯并咪唑类药物的日间回收率为74.67-88.40％，相对标准偏差为RSD为0.73-14.80；日内回收率为81.59-95.38％，相对标准偏差为RSD为5.27-11.65。

2、最低检出限(LOD)和最低定量限(LOQ)

按照最低检出限为3陪性噪比(S/N＝3),最低定量限为10陪性噪比(S/N＝3)来测定该方法对不同基质中13种苯并咪唑类药物残留的最低检出限和最低定量限。结果如表7所示。

表7该方法对不同基质样品的最低检出限(LOD)和最低定量限(LOQ)

该方法对牛肉基质中残留的13种苯并咪唑类药物的检测最低限为0.78-4.05μg/kg，最低定量限为2.59-18.18μg/kg；对牛肝基质的检测最低限为0.79-4.90μg/kg，最低定量限为2.65-16.34μg/kg；对羊肉基质的检测最低限为0.94-3.90μg/kg，最低定量限为3.14-14.43μg/kg；对羊肝基质的检测最低限为0.78-4.21μg/kg，最低定量限为2.61-14.04μg/kg。

由上述特征参数可以看出，本发明方法对牛肉、羊肉、牛肝和羊肝等肉品中残留的苯并咪唑类药物具有良好的测定效果，适合用于肉品中苯并咪唑类药物残留的测定。

本发明净化剂聚N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯磺酸钠(简称DVB-NVP-SO₃Na)的制备：

a\以甲苯和正十二烷作溶剂，在回流条件下，N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和二乙烯苯(DVB)在引发剂的作用下发生加聚反应，生成DVB-NVP聚合体(可参考“以N-乙烯基吡咯烷酮为功能单体的S-萘普生印迹聚合物材料的合成及性能研究，马娟娟等，功能高分子学报，2005，18(1)，p144-148”)。

b\将浓硫酸和DVB-NVP在回流条件下反应9h得到DVB-NVP-SO₃H。

c\将DVB-NVP-SO₃H加入到氢氧化钠溶液里面，加热搅拌之后，过滤就得到目标化合物。目标化合物化合物对带有正电性的基团具有良好的吸附性能。

目标化合物合成路线如下：

，

该化合物具有空间网状结构，波浪线代表以上苯环和吡咯环的重复结构。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，所述苯并咪唑类药物为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑砜、羟基噻苯咪唑、噻苯达唑、奥苯达唑、2-氨基氟苯咪唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑，步骤如下：

（1）动物组织样品用乙酸乙酯提取，提取液蒸干；

（2）将步骤（1）蒸干余下的残渣溶解，调节溶液至酸性后，加入净化剂聚N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯苯磺酸钠进行吸附，分离，再用碱液对净化剂进行解吸，得到的解吸液挥干；

（3）步骤（2）挥干得到的残渣用流动相溶解之后上高效液相色谱仪，进行色谱测定，色谱条件：C₁₈柱，流动相为乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，其中流动相中乙腈的体积百分比随时间的变化如下：

0～15min，由20%线性变化至25%；

15～28min，由25%线性变化至30%；

28～38min，由30%线性变化至60%；

38min后，20%；

步骤（1）提取时，加入碱和抗氧化剂；

步骤（1）蒸干余下的残渣用乙腈溶解；

步骤（2）调节溶液至酸性后，氢离子浓度为1-1.5mol/L；

步骤（2）所述碱液为氨化乙腈，所述氨化乙腈中氨的浓度为1-2mol/L。

2.根据权利要求1所述测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，其特征在于，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾，所述抗氧化剂为二叔丁基苯酚。

3.根据权利要求2所述测定动物组织中残留苯并咪唑类药物的方法，其特征在于，所述碱的浓度为1-5g/L。