CN108693259B - 一种动物组织和乳制品中1,2-二氨基苯类药物的检测方法 - Google Patents
一种动物组织和乳制品中1,2-二氨基苯类药物的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
鉴于1,2‑二氨基苯类驱虫药物有可能引起动物包括人类的致畸和胚胎毒性，本发明公开了一种快速准确测定动物组织和乳制品中19种1,2‑二氨基苯类药物残留量的检测方法，用以保障食品安全，尤其是老年人、孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康。本专利采用高效液相色谱‑串联四极杆质谱结合电喷雾正离子监测等技术，建立了动物组织和乳制品中19种1,2‑二氨基苯类药物的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确，能够为动物组织和乳制品中19种1,2‑二氨基苯类药物的监测工作提供技术支持，将有助于增强我国的检测技术，为保护消费者的身体健康、保障食品安全提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于食品中兽药残留的检测技术领域，具体涉及动物组织和乳制品中1,2-二氨基苯类药物的检测方法。
背景技术
1,2-二氨基苯类药物是一类高效、低毒的驱虫药，在化学结构上有一个共同特点就是有一个相同的中心结构：1,2-二氨基苯，即“苯并咪唑核”，该类药物被广泛应用于食用动物(猪、牛、羊、马等)养殖业中，常见的主要药物有苯亚砜咪唑、苯硫达唑、丙硫达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑和噻苯哒唑等。大部分1,2-二氨基苯类驱虫药在动物体内会迅速代谢，但甲苯达唑的代谢率较低，主要是以药物原形排出。1,2-二氨基苯结构相当稳定，1,2-二氨基苯类驱虫药在动物体内生物转化时其代谢反应均发生在药物的侧链，主要包括氧化、羰基还原、氨基甲酸酯结构水解等，如噻苯达唑用药后迅速代谢为5-羟基噻苯达唑，48小时内以原型排泄的不足1％。丙硫达唑在动物体内的代谢途径就包括了氧化反应代谢物丙硫达唑砜、丙硫达唑亚砜，丙硫达唑亚砜进一步代谢发生氨基甲酸酯结构水解生成丙硫达唑-2-氨基砜。有文献报道1,2-二氨基苯类驱虫药中的丁苯达唑、噻苯达唑酯、丙硫达唑、苯亚砜咪唑对妊娠早期绵羊的胎儿有致畸作用。也有资料报道一些1,2-二氨基苯驱虫药的代谢物如亚砜产物、羟化产物仍具有强的抗虫活性，甚至高于药物的原形，这些代谢物还有一定的胚胎毒性。此外大量研究或应用资料显示当高剂量使用或较长时间使用1,2-二氨基苯类药物时,在多种动物体内显示致畸和胚胎毒性,主要为骨胳畸形。鉴于1,2-二氨基苯类驱虫药物有可能引起动物包括人类的致畸和胚胎毒性，我国以及欧盟、美国、日本等国都将1,2-二氨基苯类药物列入限制使用的兽药药物中，并制订出各种1,2-二氨基苯类驱虫药物(包括其某些代谢物)在不同动物体内(包括肌肉、组织、奶等)的最高残留限量MRL。香港地区亦将1,2-二氨基苯类药物列入受限制使用药物名单中。
本专利与前人的研究方法的不同之处:前人的研究检测的药物大多只检测一种或其中几种1,2-二氨基苯类药物原药而没检测代谢物，或者只检测其中部分药物及其代谢物，涉及的1,2-二氨基苯类药物面不广,尚未见有19种1,2-二氨基苯类药物的检测；前人的研究多数只单纯检测动物组织或者奶、奶粉,鲜见包括动物肌肉、肝脏、肾脏、水产品、乳制品等中19种1,2-二氨基苯类药物的检测；前人的研究大多采用乙酸乙酯或乙腈-盐酸溶液为提取溶剂,未见采用水-乙腈-氯化钠为提取溶剂；前人的研究采用MCX固相萃取的净化方式,前处理过程中需要一到两次的溶剂浓缩步骤,耗时长,且容易造成被分析物损失,本专利采用液液萃取净化方式,仅用常规的乙腈饱和正己烷溶液进行净化,不但前处理时间短,不需另外购买固相萃取柱,成本更低；前人的研究多采用样品浓缩的方式进行检测，本专利采用稀释法，简化了前处理过程，避免了复杂前处理过程中目标物的损失，减弱了基质效应。
发明内容
鉴于现有兽药检测的技术问题，本发明提出一种将快速准确测定动物组织和乳制品中19种1,2-二氨基苯类药物残留量的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。
一种动物组织和乳制品中1,2-二氨基苯类药物的检测方法，具体步骤为：
标准溶液及标准曲线配制，样品基质采用水-乙腈-氯化钠为提取溶剂进行提取，再以乙腈饱和正己烷溶液进行液液萃取净化，经液相色谱分离，再采用电喷雾离子源串联质谱；所述的样品基质包括：动物组织、乳制品；对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定；测定试样和标准工作溶液时，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物；
空白试验的方法为：除不加试样外，均按上述操作步骤进行；
结果计算和表述方法为：用色谱数据处理机或按式1计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：
式中：
Xi——试样中被测组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——由标准曲线得到的样液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
c0——由标准曲线得到的空白试验中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m——最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)；
计算结果保留两位有效数字；
线性范围和定量限的确定：在上述实验条件下，取一系列不同浓度的1,2-二氨基苯类药物标准溶液，以1,2-二氨基苯类药物响应峰面积对1,2-二氨基苯类药物的浓度进行线性回归，结果表明，当1,2-二氨基苯类药物的浓度在0～10μg/L范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见表3；
本实验选择空白的动物组织和乳制品样品，当添加水平为10μg/kg时，信噪比大于10，表明其定量限可达到10μg/kg，当样品中的1,2-二氨基苯类药物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数；
方法的回收率和精密度：选用未含有1,2-二氨基苯类及其代谢物的羊肉、鸡肝、牛肾、鱼肉、灭菌羊奶和生鲜牛乳分别进行添加回收率和精密度实验，添加水平为10、100、200μg/kg，奶粉样品添加水平为80、160、800μg/kg，按前述方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率；回收率和精密度结果见表4-表5；三个添加水平的平均回收率在70.0％～110.0％之间，相对标准偏差为1.2％～9.9％；表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求；
所述的标准溶液及标准曲线配置过程为：
1,2-二氨基苯类标准储备液：准确称取适量19种1,2-二氨基苯类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
1,2-二氨基苯类混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液；
1,2-二氨基苯类混合标准中间液(1.0mg/L)：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为1.0mg/L标准中间液；
标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10μg/L系列标准溶液。
所述的肌肉、肝脏、肾脏、水产品的提取与净化方法为：称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样4g(精确至0.01g)于50mL离心管A中，加入10mL水在匀浆机上以14000r/min速度匀浆30s，取一50mL离心管B,加入15mL乙腈以洗涤匀浆刀10s,洗涤液转入离心管A中，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管C中；取一50mL离心管D,加入12mL乙腈以洗涤匀浆刀10s；洗涤液转入离心管A中，用玻棒捣碎残渣，超声10min,在水平振荡器上振荡30min，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管C中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述的鲜牛乳和灭菌羊奶的提取和净化方法为：称取试样4g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加入10mL水，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述的牛奶粉和羊奶粉的提取和净化方法为：称取试样0.5g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加入14mL温水(45℃)涡旋振荡至溶解样品完全，加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：30μL。
所述的质谱条件为：离子源：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；气帘气压力：173kpa；雾化气压力：449kpa；辅助加热气压力：517kpa；碰撞气压力：42；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；1,2-二氨基苯类药物及其代谢物的相关质谱参数见表1。
本发明具有如下有益效果：
(1)检测谱广：本专利涉及的药物主要包括：苯亚砜咪唑、苯硫达唑和非班太尔及它们的代谢物苯亚砜咪唑砜，氧苯哒唑，噻苯达唑及其代谢物5-羟基噻苯达唑，三氯苯哒唑及其代谢物三氯苯哒唑酮，丙硫哒唑及其代谢物丙硫达唑砜、丙硫达唑亚砜和丙硫达唑-2-氨基砜，氟苯达唑及其代谢物2-氨基氟苯达唑，甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、噻苯咪唑酯共19种1,2-二氨基苯类药物，未见涵盖上述药物的相关文献报道；
(2)检测基质齐全：本专利涉及的检测基质包括：动物肌肉、肝脏、肾脏、水产品、乳制品等，尚未见包含了这些基质的相关报道；
(3)本专利的提取溶剂净化效果更好：本专利的样品提取溶剂水-乙腈-氯化钠未见报道过，相比较与常用的乙腈和盐酸溶液，在沉淀蛋白的同时还去除了水溶性杂质，净化效果更好。
(4)与通常的固相萃取净化步骤繁琐相比较，本专利采用液液萃取法，利用乙腈饱和的正己烷进行净化除脂，简便快捷，前处理成本低。另外，本专利还采用稀释法，简化了前处理过程，避免了复杂前处理过程中目标物的损失，减弱了基质效应。本专利建立液相色谱-串联质谱法，以增强专利的适用性，易于专利的推广使用。
目前，国内外尚未有在动物组织和乳制品中19种1,2-二氨基苯类药物的研究及报道。因此，建立快速准确测定动物组织和乳制品中19种1,2-二氨基苯类药物残留量的检测方法，用以保障食品安全，尤其是老年人、孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康非常有必要。本专利采用高效液相色谱-串联四极杆质谱结合电喷雾正离子监测等技术，建立了动物组织和乳制品中19种1,2-二氨基苯类药物的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确，能够为动物组织和乳制品中19种1,2-二氨基苯类药物的监测工作提供技术支持，将有助于增强我国的检测技术，为保护消费者的身体健康、保障食品安全提供技术支持。
附图说明
图1为本发明所述的溶剂空白的总离子流图；
图2为本发明所述的羊肉空白的总离子流图；
图3为本发明所述的空白羊肉标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图4为本发明所述的鸡肝空白的总离子流图；
图5为本发明所述的空白鸡肝标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图6为本发明所述的牛肾空白的总离子流图；
图7为本发明所述的空白牛肾标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图8为本发明所述的鱼肉空白的总离子流图；
图9为本发明所述的空白鱼肉标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图10为本发明所述的灭菌羊奶空白的总离子流图；
图11为本发明所述的空白灭菌羊奶标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图12为本发明所述的生鲜牛乳空白的总离子流图；
图13为本发明所述的空白生鲜牛乳标准添加水平为10μg/kg的总离子流图；
图14为本发明所述的奶粉空白的总离子流图；
图15为本发明所述的空白奶粉标准添加水平为80μg/kg的总离子流图；
图16为本发明所述的鸡肝中丙硫达唑的萃取离子流图；
图17为本发明所述的鸡肝中丙硫达唑砜的萃取离子流图；
图18为本发明所述的鸡肝中丙硫达唑-2-氨基砜的萃取离子流图；
图19为本发明所述的鱼肉中甲苯咪唑的萃取离子流图。
具体实施方式
为了更清楚说明本发明的技术方案，下面将结合具体实施例和附图对本发明进行详细的说明，其中提到的附图仅仅适用下述实施例，对于本领域普通技术员，还可以根据本发明中提到的方法获得其他附图。但是本发明的保护范围并不限于下述实施例。
实施例1：建立方法
1材料与方法
1.1材料与试剂
1,2-二氨基苯类药物标准品：苯亚砜咪唑、苯硫达唑、非班太尔、苯亚砜咪唑砜、氧苯哒唑、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、三氯苯哒唑、三氯苯哒唑酮、丙硫达唑、丙硫达唑砜、丙硫达唑亚砜、丙硫达唑-2-氨基砜、氟苯达唑、2-氨基氟苯达唑、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、噻苯咪唑酯等19种1,2-二氨基苯类药物；乙腈、甲酸(色谱纯)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、正己烷、氯化钠(分析纯)；去离子水由Millipore公司超纯水机制得。
0.1％甲酸溶液：吸取1mL甲酸至1L的容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀备用。
1.2仪器与设备
UFLC LC-20A超高效液相色谱仪日本岛津公司；4000QTRAP三重四极杆串联质谱仪配电喷雾离子源美国AB Sciex公司；涡旋振荡器德国IKA公司；3-16K型高速离心机德国Sigma公司；匀浆机，配备直径19mm匀浆刀德国IKA公司；超声波振荡器博励行公司；水平振荡器海尔道夫。
1.3方法
1.3.1标准溶液配制
1,2-二氨基苯类标准储备液：准确称取适量19种1,2-二氨基苯类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液。
1,2-二氨基苯类混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液。
1,2-二氨基苯类混合标准中间液(1.0mg/L)：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为1.0mg/L标准中间液。
标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10μg/L系列标准溶液。
1.3.2样品处理与净化
动物组织(肌肉、肝脏、肾脏、水产品)的提取与净化
称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样4g(精确至0.01g)于50mL离心管A中，加入10mL水在匀浆机上以14000r/min速度匀浆30s，取一50mL离心管B,加入15mL乙腈以洗涤匀浆刀10s,洗涤液转入离心管A中，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管C中。取一50mL离心管D,加入12mL乙腈以洗涤匀浆刀10s。洗涤液转入离心管A中，用玻棒捣碎残渣，超声10min,在水平振荡器上振荡30min，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管C中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层。弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
液态奶(生鲜乳、灭菌奶)的提取与净化
称取试样4g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加入10mL水，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管B中。离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层。弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
奶粉(牛奶粉和羊奶粉)的提取与净化
称取试样0.5g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加入14mL温水(45℃)涡旋振荡至溶解样品完全，加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管B中。离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层。弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
1.3.3液相色谱条件
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：30μL。
1.3.4质谱条件
离子源：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；气帘气压力：173kpa；雾化气压力：449kpa；辅助加热气压力：517kpa；碰撞气压力：42；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；1,2-二氨基苯类药物及其代谢物的相关质谱参数见表1
表1 1,2-二氨基苯类药物质谱参数
注：带“*”的离子为定量离子。
1.3.5液相色谱-质谱/质谱测定和确证
按照1.3.3和1.3.4液相色谱测定条件对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物。
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度 | ＞50％ | ＞20％～50％ | ＞10％～20％ | ≤10％ |
| 允许的相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
1.3.6空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
1.3.7结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：。
式中：
Xi——试样中被测组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——由标准曲线得到的样液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
c0——由标准曲线得到的空白试验中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m——最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)。
计算结果保留两位有效数字。
2.1线性范围和定量限
在上述实验条件下，取一系列不同浓度的1,2-二氨基苯类药物标准溶液，以1,2-二氨基苯类药物响应峰面积对1,2-二氨基苯类药物的浓度进行线性回归，结果表明，当1,2-二氨基苯类药物的浓度在0～10μg/L范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见表3。
表3回归方程、相关系数
本实验选择空白的动物组织和乳制品样品，当添加水平为10μg/kg时，信噪比大于10，表明其定量限(LOQ)可达到10μg/kg，溶剂空白、空白样品及定量限总离子流图见图1-图15，当样品中的1,2-二氨基苯类药物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。
2.2方法的回收率和精密度
选用未含有1,2-二氨基苯类及其代谢物的羊肉、鸡肝、牛肾、鱼肉、灭菌羊奶和生鲜牛乳分别进行添加回收率和精密度实验，添加水平为10、100、200μg/kg，奶粉样品添加
水平为80、160、800μg/kg，按1.3节方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率。回收率和精密度结果见表4-表5。三个添加水平的平均回收率在70.0％～110.0％之间，相对标准偏差为1.2％～9.9％。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。
表4动物组织中1,2-二氨基苯类药物的加标回收率与精密度(n＝6)
表5乳制品中1,2-二氨基苯类药物的加标回收率与精密度(n＝6)
实施例2：实际样品的测定
按照实施例1所建立的方法对目前市场销售的18份羊肉、10份鸡肝、10份牛肾、10份鱼肉、15份灭菌羊奶、15份生鲜牛乳和15份奶粉样品进行了测定。从1份鸡肝检出丙硫达唑155μg/kg，丙硫达唑砜20μg/kg，丙硫达唑-2-氨基砜198μg/kg，见图16-图18。从1份鱼肉中检出了甲苯咪唑20μg/kg,见图19。其他样品均没有检出。综上所述：本专利建立了直接稀释高效液相色谱-串联质谱测定动物组织和乳制品中的1,2-二氨基苯类药物的方法。该方法操作简便，成本低，灵敏度高，抗干扰能力强，测定结果准确可靠，适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、水产品等动物组织和鲜乳、灭菌乳、奶粉等乳制品中1,2-二氨基苯类药物的测定。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种动物组织和乳制品中1,2-二氨基苯类药物的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
标准溶液及标准曲线配制，样品基质采用水-乙腈-氯化钠为提取溶剂进行提取，再以乙腈饱和正己烷溶液进行液液萃取净化，经液相色谱分离，再采用电喷雾离子源串联质谱进行测定；所述的样品基质包括：肌肉、肝脏、肾脏、水产品、鲜牛乳、灭菌羊奶、牛奶粉或羊奶粉；对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定；测定试样和标准工作溶液时，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差为：相对离子丰度＞50％，允许的相对偏差±20％；相对离子丰度＞20％～50％，允许的相对偏差±25％；相对离子丰度＞10％～20％，允许的相对偏差±30％；相对离子丰度≤10％，允许的相对偏差±50％，则可判断试样中存在对应的待测物；所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3，规格为4.6mm×100mm，3μm；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：30μL；所述的质谱条件为：离子源：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；气帘气压力：173kpa；雾化气压力：449kpa；辅助加热气压力：517kpa；碰撞气压力：42；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；
所述的1,2-二氨基苯类药物包括：苯亚砜咪唑，苯硫达唑，非班太尔，苯亚砜咪唑砜，丙硫达唑，丙硫达唑亚砜，丙硫达唑-2-氨基砜，噻苯达唑，5-羟基噻苯达唑，氟苯达唑，2-氨基氟苯达唑，甲苯达唑，氨基甲苯达唑，羟基甲苯达唑，三氯苯达唑，三氯苯达唑酮，氧苯达唑，噻苯咪唑酯；
所述1,2-二氨基苯类药物质谱参数为：苯亚砜咪唑的定量离子对和定性离子对分别为316/159和316/191；碰撞能量分别为：45V和29V；碰撞室出口电压分别为12V和10V；去簇电压为67V；碰撞室入口电压为9V；
苯硫达唑的定量离子对和定性离子对分别为300/268和300/159；碰撞能量分别为：29V和49V；碰撞室出口电压分别为10V和10V；去簇电压为62V；碰撞室入口电压为10V；
非班太尔的定量离子对和定性离子对分别为447/415和447/383；碰撞能量分别为：19V和27V；碰撞室出口电压分别为12V和11V；去簇电压为48V；碰撞室入口电压为10V；
苯亚砜咪唑砜的定量离子对和定性离子对分别为332/159和332/300；碰撞能量分别为：53V和31V；碰撞室出口电压分别为7V和7V；去簇电压为54V；碰撞室入口电压为10V；
丙硫达唑的定量离子对和定性离子对分别为266/234和266/191；碰撞能量分别为：27V和50V；碰撞室出口电压分别为5V和35V；去簇电压为53V和32V；碰撞室入口电压为9V和8.3V；
丙硫达唑亚砜的定量离子对和定性离子对分别为282/208和282/191；碰撞能量分别为：40V和55V；碰撞室出口电压分别为35V和35V；去簇电压为31V；碰撞室入口电压为6V；
丙硫达唑砜的定量离子对和定性离子对分别为298/159和298/224；碰撞能量分别为：50V和40V；碰撞室出口电压分别为8V和40V；去簇电压分别为40V和55V；碰撞室入口电压为10V和8V；
丙硫达唑-2-氨基砜的定量离子对和定性离子对分别为240/133和240/198；碰撞能量分别为：38V和28V；碰撞室出口电压分别为9V和10V；去簇电压为81V；碰撞室入口电压为10V；
噻苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为202/175和202/131；碰撞能量分别为：36V和47V；碰撞室出口电压分别为13V和6V；去簇电压为70V；碰撞室入口电压为7V；
5-羟基噻苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为218/191和218/147；碰撞能量分别为：40V和54V；碰撞室出口电压分别为10V和7V；去簇电压为104V；碰撞室入口电压为10V；
氟苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为314/123和314/282；碰撞能量分别为：50V和32V；碰撞室出口电压分别为5V和7V；去簇电压为65V；碰撞室入口电压为9V；
2-氨基氟苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为256/123和256/95；碰撞能量分别为：39V和56V；碰撞室出口电压分别为5V和7V；去簇电压为91V；碰撞室入口电压为10V；
甲苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为296/264和296/104；碰撞能量分别为：31V和46V；碰撞室出口电压分别为6V和8V；去簇电压为67V；碰撞室入口电压为8V；
氨基甲苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为238/105和238/133；碰撞能量分别为：35V和52V；碰撞室出口电压分别为8V和8V；去簇电压为82V；碰撞室入口电压为7V；
羟基甲苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为298/160和298/266；碰撞能量分别为：50V和317V；碰撞室出口电压分别为15V和15V；去簇电压为64V；碰撞室入口电压为9V；
三氯苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为359/344和359/274；碰撞能量分别为：38V和50V；碰撞室出口电压分别为8.7V和6V；去簇电压为99V；碰撞室入口电压为13V；
三氯苯达唑酮的定量离子对和定性离子对分别为331/168和329/168；碰撞能量分别为：39V和40V；碰撞室出口电压分别为14V和10V；去簇电压分别为73V和42V；碰撞室入口电压为9V；
氧苯达唑的定量离子对和定性离子对分别为250/218和250/176；碰撞能量分别为：26V和40V；碰撞室出口电压分别为5V和9V；去簇电压为60V；碰撞室入口电压为9V；
噻苯咪唑酯的定量离子对和定性离子对分别为303/261和303/217；碰撞能量分别为：37V和24V；碰撞室出口电压分别为11V和6V；去簇电压为68V；碰撞室入口电压为8V。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的标准溶液及标准曲线配置过程为：
1,2-二氨基苯类标准储备液：准确称取适量19种1,2-二氨基苯类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
1,2-二氨基苯类混合标准中间液，浓度为10mg/L：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液；
1,2-二氨基苯类混合标准中间液，浓度为1.0mg/L：分别吸取适量的1,2-二氨基苯类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为1.0mg/L标准中间液；
标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10μg/L系列标准溶液。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的肌肉、肝脏、肾脏、水产品的提取与净化方法为：称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样4g，精确至0.01g，于50mL离心管A中，加入10mL水在匀浆机上以14000r/min速度匀浆30s，取一50mL离心管B,加入15mL乙腈以洗涤匀浆刀10s,洗涤液转入离心管A中，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管C中；取一50mL离心管D,加入12mL乙腈以洗涤匀浆刀10s；洗涤液转入离心管A中，用玻棒捣碎残渣，超声10min,在水平振荡器上振荡30min，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管C中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-电喷雾离子源串联质谱测定。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的鲜牛乳和灭菌羊奶的提取和净化方法为：称取试样4g，精确至0.01g，至50mL的离心管A中，加入10mL水，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-电喷雾离子源串联质谱测定。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的牛奶粉和羊奶粉的提取和净化方法为：称取试样0.5g，精确至0.01g，至50mL的离心管A中，加入14mL45℃的温水，涡旋振荡至溶解样品完全，加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,加入7g氯化钠，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡30s，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-电喷雾离子源串联质谱测定。
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