CN102419352B - 一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法。所述测定方法包括如下步骤：对样品依次进行碱解；酸化，使样品中所有邻苯二甲酸酯类物质全部转化为邻苯二甲酸，然后采用乙酸乙酯萃取，蒸干、甲醇复溶，有机滤膜过滤，得到样品液；以高效液相色谱对样品液中邻苯二甲酸的含量进行测定；根据邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程，进行换算，即可计算样品中邻苯二甲酸酯类物质的总量。本发明测定邻苯二甲酸酯类物质总量的方法具有前处理方式简便、快速、灵敏度高的优点，有利于大批量样品的测定，适用食用油、方便面调味酱料及方便米线调味酱料等多种油类食品以及尿液等生物样本中邻苯二甲酸酯总量的测定。

Description

一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法

技术领域

本发明属于液相色谱分析技术领域，具体涉及一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，简称PAEs，别名酞酸酯)是一类重要的有机化合物质，由于可增加塑料的可塑性及强度，被广泛应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中。

在塑料中PAEs与聚烯烃类塑料分子之间由氢键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，随着时间、温度等条件的变化逐渐从塑料向食品中迁移，从而导致食品的污染，尤其是油脂类食品。邻苯二甲酸酯可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进进人体，经过体内代谢，其代谢产物包括邻苯二甲酸单酯、羟基化产物和氧化产物，在尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸基转移酶的催化作用下生成亲水的葡糖苷酸结合物而排出，代谢物总类繁多，已在人的尿液、乳汁、血液和精液等体液中检测出邻苯二甲酸酯，该类化合物已被确认为环境雌激素，对人的生殖系统有损害。目前已经有气相、液相、气-质联用、液-质联用等方法对邻苯二甲酸酯类化合物进行检测，这些方法由于灵敏度高、分离效果好以及定量分析紧密度高的优点而被广泛使用，但这些方法均是对某种或某几种邻苯二甲酸酯类进行检测，但因邻苯二甲酸酯是一类物质，包括的种类数量很多，国内外明确规定一些产品是不能含的，而且即使使用，种类也不一样，很难将邻苯二甲酸酯类化合物一一检测出来，而且代谢物成分复杂，因此建立一种方法可以检测邻苯二甲酸酯类物质总量不仅可以有效评估食品尤其是油类食品是否受到邻苯二甲酸酯增塑剂的污染，而且可以为邻苯二甲酸酯人体的内暴露评价提供技术支持，目前，国内外并没有相关的研究报道，因此，建立一种测定邻苯二甲酸酯类物质总量的方法将填补这一领域的空白。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测邻苯二甲酸酯类物质方法的不足，提供一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法。该方法将邻苯二甲酸酯类物质全部转化为邻苯二甲酸，通过检测邻苯二甲酸的量进而计算邻苯二甲酸酯总量，操作简单可靠。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，包括如下步骤：

(1)前处理：将样品制成溶液后在碱的存在下，进行碱解；碱解后以用酸进行酸化，往酸化后的溶液采用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干后以甲醇复溶，有机滤膜过滤，得到样品液；

(2)含量测定：以高效液相色谱对样品液中邻苯二甲酸的含量进行测定；

(3)标准曲线和线性回归方程：制备邻苯二甲酸标准溶液，并通过高效液相分析得到邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程，将步骤(2)所测定的含量按照标准曲线换算，即可计算样品中邻苯二甲酸酯类物质的总量。

作为一种优选方案，步骤(1)中，所述碱解为将样品溶于甲醇中，以氢氧化钾溶液为碱，在80～100℃下进行碱解。

作为一种最优选方案，步骤(1)中，所述碱解为将样品与甲醇混匀，加入氢氧化钾溶液，在85℃水浴加热2.5h，最后将甲醇蒸干，取出冷却至室温。

作为一种优选方案，步骤(1)中，所述酸化优选将体系的pH值调至1～2。

作为一种最优选方案，步骤(1)中，所述酸化优选为以体积比为1∶1的盐酸水溶液为酸，将体系的pH值调至1～2，漩涡震荡3分钟后，超声波震荡20分钟。

作为一种优选方案，步骤(1)中，所述乙酸乙酯萃取优选为先采用正己烷进行萃取，除去正己烷层，再往余液中加入乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯的萃取液。

作为一种更优选方案，所述有机溶液萃取更优选为往酸化后的溶液中，加入3倍体积的正己烷，漩涡震荡3分钟，静置，除去正己烷层，余液中加入3倍体积的乙酸乙酯，漩涡震荡3分钟，静置，分离出乙酸乙酯层，重复乙酸乙酯提取步骤2次，合并三次所得的乙酸乙酯萃取液，除去乙酸乙酯，得到邻苯二甲酸。正己烷的作用是可以除去水解后生成的脂肪酸以及一些弱极性和非极性的物质。

作为一种优选方案，步骤(2)中，高效液相色谱条件优选为：紫外检测器，检测波长为230nm；XB-C18型色谱柱；甲醇与25mmol/L磷酸氢二钾组成的缓冲溶液作为流动相；进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；柱温40℃，进样量10μL。

作为一种优选方案，所述样品优选为油类或富脂样品。

作为一种更优选方案，所述样品更优选为食用油、方便面调味酱料或黄油。

作为一种优选方案，当样品为油类或富脂样品时，步骤(2)的梯度洗脱优选为，0～15分钟，甲醇在缓冲溶液中的比例由30体积％上升为40体积％；15～20分钟，甲醇比例由40体积％上升为70体积％，保持5分钟。

作为一种优选方案，所述样品为尿液样品时，步骤(1)中，优选为先采用β-葡糖苷酸水解酶进行酶解和高温灭菌再进行碱解。

作为一种优选方案，当所述样品为尿液时，步骤(2)的梯度洗脱优选为，0～5分钟，甲醇在缓冲溶液中的比例由10体积％上升为25体积％；5～20分钟，甲醇比例由25体积％上升为30体积％，20～25分钟，甲醇比例由30体积％升至80体积％，25～30分钟，甲醇比例由80体积％降至10体积％。

步骤(3)中，标准曲线和线性回归方程按照如下步骤制备：

用邻苯二甲酸标准储备液配制成邻苯二甲酸浓度分别为0.05、0.1、1、10、25、50、100mg/L的标准溶液；

分别吸取各浓度的标准溶液10μL注入高效液相色谱进行分析，由相应浓度得到的高效液相色谱峰面积，得到邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程，并得到最低检测限。

现有的邻苯二甲酸类物质含量的检测，都是直接测定样品中某一特定种类的邻苯二甲酸酯的含量，由于样品中的邻苯二甲酸酯种类难以确定，往往需要同时制备多种常用的邻苯二甲酸酯的标准曲线，因此操作较麻烦，难以在短时间内判断样品是否受到邻苯二甲酸类物质的污染。本发明通过碱解再酸化的前处理，将样品中各种不同类型的邻苯二甲酸酯统一转化为邻苯二甲酸，因此，仅需要根据邻苯二甲酸的标准曲线即可换算出邻苯二甲酸酯类物质的总含量。可以快速地检测样品是否受到邻苯二甲酸酯类物质的污染。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述方法的前处理操作简单，无需对样品进行提取纯化等预处理，可以直接进行水解；

(2)灵敏度高，邻苯二甲酸在230nm有很强的吸收，检测限为0.02mg/L；

(3)取样少，液体样品取1ml即可，固体及半固体状态样品取样为2g；

(4)适用于大批量样品测定，由于可同时进行水解，提取等步骤，单个样品高效液相测定时间在20分钟以内，因此适用于大批量样品测定；

(5)稳定性好；24h内邻苯二甲酸的峰面积稳定，RSD＜2.8％；

(6)本方法应用于食品安全风险评估领域，一方面能够初步判定食品是否污染邻苯二甲酸酯以及污染程度，同时也可以作为人群邻苯二甲酸酯暴露量的估计分析，对企业还是监管部门均具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1是邻苯二甲酸标准品色谱图；

图2是邻苯二甲酸高效液相色谱图标准曲线；

图3是食用油样品处理后邻苯二甲酸高效液相色谱图；

图4是尿液样品处理后邻苯二甲酸高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何形式的限定。

实施例1油类样品中邻苯二甲酸类物质总量的测定

(1)用邻苯二甲酸标准储备液配制成邻苯二甲酸浓度分别为0.05、0.1、1、10、25、50、100mg/L的标准溶液。分别吸取各浓度的标准溶液10μL注入高效液相色谱进行分析，由相应浓度得到的高效液相色谱峰面积，得到邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程Y＝63331X+47465，R²＝0.9995，并得到最低检测限为0.02mg/L。

(2)将样品混匀后，称取2.0g，放于回流瓶中，加入10ml甲醇混匀，再加10mL浓度为2mol/L的KOH溶液，于85℃水浴回流加热2.5h，最后装置拆除，将甲醇在水浴中蒸干，取出冷却至室温。

(3)用1∶1盐酸将水解液pH调为1～2，漩涡震荡3min后，超声波震荡20min，转移至250ml分液漏斗中。

(4)在分液漏斗中加入3倍体积的正己烷，漩涡震荡3min，静置20min，弃去正己烷层，加入3倍体积的乙酸乙酯，漩涡震荡3min，静置20min，取乙酸乙酯层，剩余液体中再加入3倍体积的乙酸乙酯，重复上述操作，将三次萃取液合并，于旋转蒸发器中蒸发至尽干，旋转蒸发的水浴温度为40℃。

(5)用2mL色谱级甲醇复溶，超声5min使其更好溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，进行高效液相色谱分析。

(6)高效液相色谱条件

色谱柱：XB-C18(5μm，4.6×250mm)；流动相：甲醇和磷酸盐缓冲溶液(25mmol/L，pH＝2.5)；总流量：1ml/min；紫外吸收波长：230nm；梯度洗脱：0-15min，甲醇比例由30％升至40％，15-20min，甲醇比例由40％升至70％，保持5min；柱温：40℃；进样量：10μL。

(7)含量计算

以邻苯二甲酸的峰面积代入上述标准曲线中求出待测液中邻苯二甲酸的含量；通过邻苯二甲酸的摩尔量计算样品中邻苯二甲酸酯总摩尔量。

据下列公式计算出食用油中PAEs的总含量。

$X=\frac{C}{166.13m}\×V\×{10}^{-3}$

式中：X——食用油中PAEs的总含量，mol/g

      C——HPLC检测得到的邻苯二甲酸的浓度，μg/mL

      m——食用油的质量，g

      V——复溶用甲醇体积，mL

      166.13——邻苯二甲酸的相对分子质量，g/mol

采用上述方法，我们测定了6个油类样品中邻苯二甲酸酯总量，结果如表1所示：

表1

实施例2尿液中邻苯二甲酸类物质总量的测定

(1)用邻苯二甲酸标准储备液配制成邻苯二甲酸浓度分别为0.05、0.1、1、10、25、50、100mg/L的标准溶液。分别吸取各浓度的标准溶液10μL注入高效液相色谱仪进行分析，得到邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程Y＝63331X+47465，R²＝0.9995，并得到最低检测限为0.02mg/L。

(2)取尿液样品12000rpm/min离心20min取上清，取1ml，加入15μLβ-葡糖苷酸水解酶，37℃恒温震荡12h。

(3)酶解液于100℃沸水中灭活，冷却后，12000rpm/min离心20min取上清，放于回流瓶中，加入10ml甲醇混匀，再加15mL浓度为2mol/L的KOH溶液，于85℃水浴回流加热8h，最后装置拆除，将甲醇在水浴中蒸干，取出冷却至室温。

(4)用1∶1盐酸水溶液将水解液pH调为1～2，漩涡震荡3min后，超声波震荡20min，转移至250ml分液漏斗中。

(5)在分液漏斗中加入3倍体积的正己烷，漩涡震荡3min，静置20min，弃去正己烷层，加入3倍体积的乙酸乙酯，漩涡震荡3min，静置20min，取乙酸乙酯层，剩余液体中再加入3倍体积的乙酸乙酯，重复上述操作，将三次萃取液合并，于旋转蒸发器中蒸发至尽干，旋转蒸发的水浴温度为40℃。

(6)用2mL色谱级甲醇复溶，超声5min使其更好溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，进行高效液相色谱分析。

(7)高效液相色谱条件

色谱柱：XB-C18(5μm，4.6×250mm)；流动相：甲醇和磷酸盐缓冲溶液(25mmol/L，pH＝2.5)；总流量：1ml/min；紫外吸收波长：230nm；梯度洗脱：梯度洗脱：0-5min，甲醇比例由10％升至25％，5-20min，甲醇比例由25％升至30％，20-25min，甲醇比例由30％升至80％，25-30min，甲醇比例由80％降至10％；柱温：40℃；进样量：10μL。

(8)含量计算

以邻苯二甲酸的峰面积代入上述标准曲线中求出待测液中邻苯二甲酸的含量；通过邻苯二甲酸的摩尔量计算样品中邻苯二甲酸酯总摩尔量。

据下列公式计算出食用油中PAEs的总含量。

$X=\frac{C}{166.13m}\×V\×{10}^{-3}$

式中：X——食用油中PAEs的总含量，mol/g

      C——HPLC检测得到的邻苯二甲酸的浓度，μg/mL

      m——食用油的质量，g

      V——复溶用甲醇体积，mL

      166.13——邻苯二甲酸的相对分子质量，g/mol

采用上述方法，我们测定了2个尿液样品中邻苯二甲酸酯总量，结果如表2所示：

表2

Claims (6)

1.一种邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）前处理：将样品制成溶液后在碱的存在下，进行碱解；碱解后以用酸进行酸化，往酸化后的溶液采用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干后以甲醇复溶，有机滤膜过滤，得到样品液；

（2）含量测定：以高效液相色谱对样品液中邻苯二甲酸的含量进行测定；

（3）标准曲线和线性回归方程：制备邻苯二甲酸标准溶液，并通过高效液相分析得到邻苯二甲酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程，将步骤（2）所测定的含量按照标准曲线换算，即可计算样品中邻苯二甲酸酯类物质的总量；

其中，步骤（2）中，高效液相色谱条件为：紫外检测器，检测波长为230nm；XB-C18型色谱柱；甲醇与25mmol/L磷酸氢二钾组成的缓冲溶液作为流动相；进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；柱温40℃, 进样量10μL；

所述样品为油类或富脂样品时，步骤（2）中，梯度洗脱的条件为，0~15分钟，甲醇在缓冲溶液中的比例由30体积%上升为40体积%；15~20分钟，甲醇比例由40体积%上升为70体积%，保持5分钟；

所述样品为尿液样品时，步骤（2）中，梯度洗脱的条件为：0~5分钟，甲醇在缓冲溶液中的比例由10体积%上升为25体积%；5~20分钟，甲醇比例由25体积%上升为30体积%，20~25分钟，甲醇比例由30体积%升至80体积%，25~30分钟，甲醇比例由80体积%降至10体积%。

2.如权利要求1所述邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述碱解为将样品溶于甲醇中，以氢氧化钾溶液为碱，在80~100℃下进行碱解。

3.如权利要求1所述邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酸化为用酸将体系的pH值调至1~2。

4.如权利要求3所述邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，所述酸化为以体积比为1:1的盐酸水溶液为酸。

5.如权利要求1所述邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，所述乙酸乙酯萃取为先采用正己烷进行萃取，除去正己烷层，再往余液中加入乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯的萃取液。

6.如权利要求1所述邻苯二甲酸酯类物质总量的测定方法，其特征在于，所述样品为尿液样品时，步骤（1）中，先采用β-葡糖苷酸水解酶进行酶解和高温灭菌再进行碱解。

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