CN103808821B - 硝基呋喃类药物代谢物的衍生物及高效液相色谱荧光检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硝基呋喃类药物代谢物的衍生物及高效液相色谱荧光检测，方法其主要是由甲醇钠、甲醇、乙醇肼按一定用量配比，并通过新的合成方法合成了硝基呋喃类药物代谢物的衍生物，从而实现了对液相色谱荧光的检测。

Description

硝基呋喃类药物代谢物的衍生物及高效液相色谱荧光检测

技术领域

本发明涉及一种硝基呋喃类药物代谢物的制备，尤其涉及一种硝基呋喃代谢物AOZ的制备方法及其利用高效液相色谱荧光方法检测AOZ。

背景技术

硝基呋喃类抗生素（Nitrofurans）是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，该类抗生素对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有抑制作用，曾经广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，但是硝基呋喃类药物的副作用已引起人们的高度关注。例如呋喃唑酮对治疗肠炎和痢疾等效果非常显著，而且又比较经济实惠，所以，有些养殖企业把呋喃唑酮作为预防动物腹泻和霍乱等疾病的主要用品，长期使用，使得药物残留在被饲喂动物的肌肉组织与内脏组织中，人在食用这些动物性食品后也会出现类似于药物过敏的症状，重者会出现心动过速、血压升高、胸闷和烦燥等。孕妇在长时间食用这些肉食品后还有可能造成新生儿畸形的风险。由此可见，对呋喃唑酮进行监测是保障人类食品安全的重要组成部分，是保障人类身体健康与生命安全的重要措施。

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，而硝基呋喃类药物代谢迅速，致使在血浆水平中相应的母体化合物在几分钟至几小时内降解。但其代谢物会以结合态形式在体内残留较长时间，是硝基呋喃类药物的标记残留物。因此硝基呋喃抗生素代谢物可在动物喂食的残留污染食物中和动物肌肉中检测到。

发明内容

本发明的目的是提供一种硝基呋喃类药物代谢物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）的制备方法，并建立了AOZ动物源残留量的高效液相色谱荧光测定方法。本方法以2-羟基-1-萘醛为AOZ的荧光衍生试剂，实现对AOZ的定量分析，建立了AOZ的液相色谱-荧光检测方法，该方法灵敏度满足国际上动物源性食品和水产品中AOZ的残留要求，操作方便高效稳定，易于推广，适合工商部门、检验检疫机构及相关产品养殖加工企业对硝基呋喃代谢物AOZ的快速检测。

本发明正是出于上述目的，通过新的合成方法合成了硝基呋喃类药物代谢物AOZ，并采用高灵敏度、高选择性的荧光衍生试剂柱前衍生、高效液相色谱分离检测AOZ，建立了AOZ的液相色谱-荧光检测方法。本发明通过2-羟基-1-萘甲醛作为衍生试剂进行衍生化，其与AOZ结合后产生较强的荧光。用乙酸乙酯萃取，以乙腈硼酸盐缓冲液为流动相，梯度洗脱，将该代谢产物完全分离并进行测定，建立了一种新型硝基呋喃类抗生素代谢物AOZ的检测方法。

本发明所述的硝基呋喃代谢物AOZ与衍生试剂2-羟基-1-萘甲醛反应后，光谱性质研究表明生成了较强的荧光化合物，从而实现了对AOZ的液相色谱-荧光检测。

本发明组合物是由下列用量的原料组成

甲醇钠0.1128g甲醇0.23ml乙醇肼1.35ml

碳酸二甲酯2.53ml2-羟基-1-萘甲醛0.344g乙醇25ml。

附图说明：

图1为工作曲线座标示意图。

移取AOZ标准溶液，添加到10ml甲醇0.45mol/L盐酸混合液7+3，体积比中，使其浓度分别为0.5ng/mL，2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线。

具体实施方式

本发明的制备方法步骤如下

1、称取甲醇钠0.1128g，量取甲醇0.23ml，乙醇肼1.35ml，加入50ml三口烧瓶中，充分搅拌20min，使甲醇钠充分溶解，烧瓶内为无色透明溶液；

2、加入碳酸二甲酯2.53ml，70℃保温1h，缓慢搅拌升温至75℃，敞口回流蒸出甲醇，回流2h至甲醇蒸馏完毕，结束反应，得到AOZ的合成液；

3、称量0.344g（20mmoL）2-羟基-1-萘甲醛，用25mL乙醇溶解，将此溶液滴加到AOZ合成液中，滴加时要注意速度，约3s一滴，边搅拌边滴加，滤液逐渐变浑浊，溶液为淡黄色，70℃回流2小时，三口烧瓶内上层为淡黄色液体，下层为白色沉淀，趁热过滤后，将淡黄色滤液结晶得到淡黄色晶体，水洗3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，最后用无水乙醇重结晶，干燥称重，即得代谢物，质量为0.2815g。

¹HNMR（400MHz，d ₆ -DMSO）δ:12.08(s，1H)，8.67(s，1H))，8.58(d，J=4.4Hz，1H)，7.89(q，J=5.7Hz，2H)，7.55-7.59(m，1H)，7.40(t，J=4.3Hz，1H)，.22(d，J=4.5Hz，1H)，4.59(t，J=4.3Hz，2H)，4.14(t，J=4.2Hz，2H)；ESI-MSm/z257.38[M+H]⁺；元素分析实测值C₁₅H₁₂N₂O₃：C，65.72;H，4.69;N，10.94.理论值：C，65.62;H，4.72;N，10.93;O，18.73。

液相色谱荧光的检测方法

1、配制溶液

称取动物源性和水产品样品5.00g，加入10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比）充分水解，再加入200μL2-羟基-1-萘甲醛甲醇溶液（25mmol/L）于50℃水浴衍生2h，用乙酸乙酯萃取，萃取液在40℃下用N₂吹干后，用1mL的乙腈水溶液(乙腈∶水=8∶2/v:v)重新溶解，该溶液采用高效液相色谱荧光仪测定，外标法定量。

2、试样制备

从原始样品取出有代表性样品500g，用捣碎机捣碎混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，将试样置于-18℃冷冻避光保存。在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。

3、样品处理

3.1水解和衍生化

称取约5.00g试样（精确至0.0lg）于50mL塑料离心管中，加入10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比），充分搅拌后，超声40min使其充分水解，加入0.20g氯化钾，充分搅拌后，再超声30min，然后以7200r/min离心40min，倾倒上清液于10mL玻璃试管中，再加入200μL2-羟基-1-萘甲醛的甲醇溶液(25mmol/L)，振荡摇匀后超声10min，置50℃恒温水浴锅中反应2h。

3.2提取和净化

将衍生化后的溶液，冷却至室温，在60℃下用氮气吹至1mL，加入4mL纯净水，再加入5mL乙酸乙酯，振荡提取5min后，以1000r/min离心5min，收集乙酸乙酯层，残留物用5mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。收集液在40℃下用N₂吹干，将浓缩物用1mL的乙腈水溶液(乙腈∶水=8∶2/v:v)重新溶解，用0.45μm有机滤膜过滤后，转移入进样瓶待进样。

4、测定

液相色谱条件：

色谱柱：YMC-PackPolymerC₁₈，250×4.6mml.D.S-6μm；

柱温：40℃；

流速:0.7mL/min；

进样量：20μL；

荧光检测条件：灵敏度(EUFS):500；增益(Gain):10；通道1:激发波长(Ex):395nm发射波长(Em):463nm；通道2：激发波长(Ex):260nm发射波长(Em):463nm；流动相及洗脱条件见表1。

表1流动相及梯度洗脱条件

5、工作曲线

移取适量AOZ标准溶液，添加到10mL甲醇-0.45mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比）中，使其浓度分别为0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线，或采用与待测物相近浓度的标样进行单点测定。

表2标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围

6、加标回收率实验

以阴性控制样品为测试样品，按照实验方法进行提取、净化和测定，在1.0、5.0和10.0μg/kg三个浓度水平上进行加标回收试验，对应工作曲线法计算每个样品的浓度，并计算回收率，试验结果列于表3。

表3加标猪肉样品的回收率结果

7、精密度实验

表4硝基呋喃类代谢物AOZ添加水平为80μg/Kg时的峰面积和RSD(n=6)

Claims (1)

1.一种硝基呋喃类药物代谢物的衍生物的制备方法，其特征在于：它包括下列步骤：

（1）称取甲醇钠0.1128g，量取甲醇0.23ml，乙醇肼1.35ml，加入50ml三口烧瓶中，充分搅拌20min，使甲醇钠充分溶解，烧瓶内为无色透明溶液；

（2）加入碳酸二甲酯2.53ml，70℃保温1h，缓慢搅拌升温至75℃，敞口回流蒸出甲醇，回流2h至甲醇蒸馏完毕，结束反应，得到AOZ的合成液；

（3）称量0.344g20mmoL2-羟基-1-萘甲醛，用25mL乙醇溶解，将此溶液滴加到AOZ合成液中，滴加时要注意速度，约3s一滴，边搅拌边滴加，滤液逐渐变浑浊，溶液为淡黄色，70℃回流2小时，三口烧瓶内上层为淡黄色液体，下层为白色沉淀，趁热过滤后，将淡黄色滤液结晶得到淡黄色晶体，水洗3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，最后用无水乙醇重结晶，干燥称重，即得代谢物，质量为0.2815g；

¹HNMR（400MHz，d ₆ -DMSO）δ:12.08(s，1H)，8.67(s，1H))，8.58(d，J=4.4Hz，1H)，7.89(q，J=5.7Hz，2H)，7.55-7.59(m，1H)，7.40(t，J=4.3Hz，1H)，.22(d，J=4.5Hz，1H)，4.59(t，J=4.3Hz，2H)，4.14(t，J=4.2Hz，2H)；ESI-MSm/z257.38[M+H]⁺；元素分析实测值C₁₅H₁₂N₂O₃：C，65.72;H，4.69;N，10.94.理论值：C，65.62;H，4.72;N，10.93;O，18.73。