CN104165940B - 一种食用油中酞酸酯总量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种食用油中酞酸酯总量的检测方法。该方法包括：在催化剂存在及碱性条件下，将食用油中的酞酸酯水解为邻苯二甲酸，得到水解液；在pH为1～2的条件下，利用净化液去除水解液中的亲脂性干扰物，得到净化样品；对净化样品中的邻苯二甲酸进行萃取，得到萃取液；利用碱液与甲醇或乙醇混合溶液反萃取萃取液中的邻苯二甲酸，得到待检测样品；利用高效液相色谱检测待检测样品中的邻苯二甲酸含量，将其含量换算成酞酸酯含量。本发明方法中的样品前处理技术大大缩短了实验时间，尤其是水解时间，减少了有机溶剂的使用，而且简化了实验操作和步骤，降低了实验成本，并具有较高的灵敏度。

Description

一种食用油中酞酸酯总量的检测方法

技术领域

本发明涉及食品中有害物质的检测方法，具体涉及食用油中酞酸酯总量的检测方法。

背景技术

酞酸酯(PAEs)因其能增加塑料材质的弹性、延展性和耐用性而被广泛用于塑料制品中，全球年产量数百万吨。在塑料制品中有20～40％(w/w)PAEs是以非化学键结合到聚合物链上的，因而很容易迁移到周围环境中。PAEs是一类环境雌激素，可在生物体内富集，对人和动物有一定的内分泌干扰作用和致癌性。因其对人体健康和环境存在潜在威胁，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)等已被不同国家和地区列为优先控制的污染物。由于PAEs有较高的辛醇水分配系数(logKow>4)，而食用油又通常盛放在塑料器皿中，因而PAEs容易迁移到食用油中。因此，建立快速准确检测食用油中PAEs的分析方法对监控食用油品质有重要意义。

在工业生产中，为了使塑料获得更优的性能，往往在塑料中添加一种或多种PAEs。目前，常采用固相萃取法(SPE)(Y.Liuetal.,2013,J.Agric.FoodChem.,61,1160-1164)、固相微萃取法(SPME)(J.J.Riosetal.,2010,Talanta,80,2076-2080)和凝胶渗透色谱法(GPC)(B.Cavaliereetal.,2008,J.Chromatogr.A,1205,137-143)来萃取PAEs。这些方法普遍操作繁琐且费用昂贵，同时，PAEs分析常伴随来自试剂、材料和实验装置引起的二次污染。基于此，在更准确地分析每种PAEs之前，通过测量PAEs总量来初步评估样品中PAEs污染程度对样品进行筛选很有必要。

张明明等(张明明等，2012，中国油脂，37，46-50)曾成功测定了食用油中PAEs总量，该方法将PAEs水解成邻苯二甲酸(PA)，用正己烷净化，再用乙酸乙酯萃取PA，旋转蒸发浓缩后用甲醇溶解，最后采用HPLC-UV检测。该方法皂化时间2.5h，但所考察的分析物中最长碳链是邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP),并没有包括邻苯二甲酸二癸酯(DDP)。

2011年，Ostrovsky等建立了GC法测定脂肪食品中PAEs总量的分析方法，该方法用甲醇-氯仿混合液提取脂肪样品，盐析法分相除去甲醇，蒸干氯仿后，在样品中加碱溶液将PAEs水解成PA，再将PA衍生成邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，用GC检测，整个过程中最难水解的邻苯二甲酸二癸酯(DDP)完全水解需大约20h(I.etal.,2011,FoodChem.,124,392-395)。以上这些方法主要存在两个问题：一是将PAEs水解成PA的时间过长，需要20h左右；二是将PA衍生成邻苯二甲酸二甲酯的过程繁琐，不易操作。关于水解时间长的问题，可能是因为食用油中的PAEs与处于水相中的碱不能很好接触导致的。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种食用油中的PAEs总量的检测方法，以解决现有的检测方法存在的操作步骤繁琐、检测时间长的问题。

为此，本发明提供的食用油中酞酸酯总量的检测方法包括：

在催化剂存在及碱性条件下，将食用油中的酞酸酯水解为邻苯二甲酸，得到水解液；

检测水解液中邻苯二甲酸含量，根据邻苯二甲酸含量推算酞酸酯含量。

优选的，水解温度为80～95℃。

进一步，所述检测水解液中邻苯二甲酸含量包括：

净化处理：在pH为1～2的条件下，利用净化液去除水解液中的亲脂性干扰物，得到净化样品；

萃取：利用萃取剂对净化样品中的邻苯二甲酸进行萃取，得到萃取液；

反萃取：利用碱液与甲醇或乙醇混合溶液反萃取萃取液中的邻苯二甲酸，得到待检测样品；

检测：利用高效液相色谱检测待检测样品中的邻苯二甲酸含量，将其含量换算成酞酸酯含量。

优选的，所述催化剂为相转移催化剂(PTC)四丁基氯化铵(TBAC)。

优选的，所述净化液为正己烷、环己烷或正己烷和环己烷的混合液。

优选的，所述萃取液为磷酸三丁酯。

优选的，所述净化样品中添加有分散剂，所述分散剂为乙醇或甲醇。

优选的，所述反萃取萃取液为甲醇和氢氧化钠溶液、乙醇和氢氧化钠溶液、甲醇和氢氧化钾溶液、乙醇和氢氧化钾溶液。

优选的，所述净化样品中添加有10％～20％(w/v)的盐。

优选的，检测过程中，物质的用量关系为：

食用油样品：1g；

催化剂：28～56mg；

碱性条件：4MKOH溶液10～20mL；

净化液：15～30mL；

萃取剂：600～800μL；

碱液：浓度为0.1～0.5M的碱液80～150μL；

甲醇或乙醇：100～300μL；

水解时间为10～15min。

现有文献报道的测定食用油中酞酸酯总量的方法包括四个步骤：(1)氯仿-甲醇混合溶剂提取样品中的酞酸酯(约1h)，除去提取液中的甲醇后减压蒸干氯仿；(2)加入醇碱溶液，80℃水解20h，酞酸酯水解成邻苯二甲酸；(3)己烷净化；(4)邻苯二甲酸衍生转化为邻苯二甲酸二甲酯(需30min)后用氯仿提取，气相色谱分析检测。本发明中，测定食用油中酞酸酯总量步骤包括：食用油中直接加入醇碱以及相转移催化剂四丁基氯化铵，一定温度下水解，酞酸酯转化为邻苯二甲酸；净化；分散液液微萃取衔接反萃取法提取邻苯二甲酸，高效液相色谱-二极管阵列检测器检测。最优条件下，该方法的线性范围(以邻苯二甲酸表示)为0.08～2μgg^-1(r>0.997)，检测限(LOD,S/N＝3)为0.11nmolg^-1，日内及日间重现性(RSD％)分别为3.9％和7.1％，加标回收率为82～99％。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的方法用TBAC作为催化剂加快PAEs水解为PA，用分子络合-DLLME-反萃取法萃取PA，并用HPLC检测。

(2)本发明方法中的样品前处理技术大大缩短了实验时间，尤其是水解时间，减少了有机溶剂的使用，而且简化了实验操作和步骤，降低了实验成本，并具有较高的灵敏度。

(3)本发明的方法可用于多种食用油或其他样品基质如植物油、动物油脂中PAEs总量的测定。

附图说明

图1为催化剂(TBAC)用量(A)和水解时间(B)对PAEs水解产率的影响；

图2为萃取剂种类(A)、乙醇百分比(B)和TBP体积(C)对PA的萃取率的影响；

图3为NaOH浓度(A)、甲醇体积(B)和0.5MNaOH体积(C)对反萃取PA的萃取率的影响；

图4为实施例中不同食用油样品中酞酸酯总量测定HPLC色谱图。

具体实施方式

相转移催化剂可以与水相中的离子结合，并利用自身对有机溶剂的亲和性，将水相中的反应物转移到有机相中。常见用于合成反应中加快非均相有机反应的反应速率。目前还没有研究将其应用到分析化学中，因此，本申请用相转移催化剂来缩短水解时间，加快反应速率。

不同于将PA衍生成某一种PAE来检测的方式，发明人将水解得到的PA萃取富集后，直接用高效液相色谱检测，这样就避免了衍生的过程，使操作简化。但PA作为一种大极性的分析物不易被萃取，而且建立有效地萃取大极性分析物的方法一直是分析化学中的难题。本申请用分子络合与分散液液微萃取(DLLME)技术结合的方法来萃取PA，不同于以往萃取剂与分析物以疏水相互作用力结合，分子络合是萃取剂与分析物间以氢键作用力结合，这种方式可以提高萃取效率。考虑到萃取剂相可能与高效液相色谱的流动相不太兼容，发明人在进样分析前再增加一步反萃取，目的是将分析物转移到水相中并进一步提高了该方法的富集倍数。

因此，本申请基于四丁基氯化铵(TBAC)催化碱水解PAEs后，用分子络合物-DLLME-反萃取法提取PA并结合HPLC-DAD分析检测，建立一种快速、简单、低溶剂消耗的测定食用油中PAEs总量的分析方法。PAEs的水解、亲脂性干扰物(亲脂性干扰物主要是指一些小分子脂肪酸和脂肪醇)的净化和PA的提取是本方法的关键。通过优化影响PAEs水解、DLLME和反萃取的因素，来获取最优的实验条件。

关于水解条件，发明人作过以下相关研究：

水解应确保所有的PAEs全部转化成PA。

Albro等用1MKOH溶液在90±5℃水解90min，DEHP转化了60％(P.W.Albroetal.,1984,Anal.Chem.,56,247-250)，等用2MNaOH-甲醇(1:1)在80℃下水解含油脂食品中的PAEs，发现DDP完全水解需要大约20h(I.etal.,2011,FoodChem.,124,392-395)。

在本申请中，为了在短时间内获取满意的水解产率，TBAC被用来加快油样基质中的PAEs水解。鉴于短烷基链的PAEs较长烷基链的更容易水解(I.etal.,2011,FoodChem.,124,392-395)，发明人选用长链的DDP(邻苯二甲酸二癸酯)为PAEs的代表来优化水解条件。用于优化水解条件的DDP标准溶液(400μgmL^-1)及测定加标回收率和制作工作曲线的DEP(邻苯二甲酸二乙酯)、DBP(邻苯二甲酸二丁酯)、DEHP(邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯)和DDP混标(1.0mgmL^-1)，用己烷配制，4℃下保存。

研究条件：样品，1g葵花油加标20μgDDP；80℃水解；调水解液pH为1～2，10mL正己烷分两次净化，稀释水解液直接HPLC分析；(A)水解时间，10min；水解溶液含10mL4MKOH和1mL乙醇；(B)水解溶液为10mL4MKOH、1mL乙醇和56mgTBAC。如图1(A)所示，考察了TBAC用量对葵花油中DDP水解产率的影响。保持其他水解条件不变，TBAC的用量分别为0、14、28、56mg，不加TBAC时，水解产率小于40％；加入少量TBAC时，水解产率迅速增大；TBAC用量达到28mg时，水解产率达到90％以上；继续增加，水解产率增加缓慢，TBAC用量为56mg时，水解产率达到最大值。因此，水解时TBAC最优用量选56mg。在油水两相中水解PAEs时，若不加相转移催化剂，疏水性基团主要集中在油相而亲水性基团主要分布在水相中，因此处于两相中的反应物不易发生反应。当加入TBAC后，Bu₄N⁺能与亲核的OH^-形成离子对而促进OH^-转移至油相中促使PAEs水解，显著地提高了PAEs的水解速率。水解时间考察范围为5～70min，从图1(B)可以看出，当水解时间达到10min以上时，水解产率趋于稳定。

关于DLLME条件优化，发明人作过以下研究：

在碱水解过程中，油样中其他脂类成分也被水解，因此水解液中有严重的基质干扰，这就需要在DLLME前进行净化处理。

由于亲脂性物质易溶于非极性溶剂，故选用正己烷(或/和环己烷)为净化提取液，同时用HCl调水解液pH为1～2，这样能提高净化效果并有利于DLLME中PA(pK_a＝2.89)的提取。HPLC结果表明，10mL正己烷重复净化两次可达满意的净化效果。

研究条件：9mL净化水解液加标1μgPA，pH1～2；离子强度，10％NaCl(m/v)；萃取时间，2min；离心时间，5000rpm离心3min。(A)萃取剂体积，800μL，水解液含5％乙醇；(B)萃取剂，800μLTBP；(C)萃取剂，800μLTBP,水解液含5％乙醇。

DLLME中，选用磷酸三丁酯(TBP)、碳酸二乙酯(DEC)、正辛醇、十二醇和[C₆MIM][PF₆]来考察萃取剂对萃取率的影响。如图2(A)所示，TBP的萃取率最高。萃取PA的作用力主要有氢键作用、疏水作用、π-π共轭作用等，而氢键作用力是最主要的。磷酸三丁酯、碳酸二乙酯、正辛醇、十二醇都能通过氧原子与PA的羧基氢原子形成氢键(X.Z.Huetal.,2010,J.Chromatogr.A,1217,7010-7016；J.Olejniczaketal.,2005,Anal.Chim.Acta,535,251-257；F.J.Lopez-Jimenezetal.,2008,J.Chromatogr.A,1195,25-33)；离子液体[C₆MIM][PF₆]，除了PA的羧基氢原子和PF^- ₆中F原子形成氢键外，离子液体的阳离子也能和PA中的苯环形成π-共轭作用(C.F.Poole,2004,J.Chromatogr.A,1037,49-82)。然而，TBP的强极性使氧原子周围有较高的电子云密度，因而其与PA形成氢键的能力要远高于其他萃取剂，所以，本发明优选TBP。

关于分散剂：

分散剂体积直接影响分析物在水溶液中的溶解度、乳浊体系的形成及萃取剂在水溶液中的分散度，从而影响萃取率。本申请中，水解过程含有约10％(v/v)的乙醇，因此用于DLLME的水解液中含有一定量的乙醇，这部分乙醇可充当分散剂。将800μLTBP和不同体积乙醇的混合液加到样品溶液中来考察乙醇含量对PA萃取率的影响。如图2(B)所示，增加乙醇含量萃取率显著下降。这一现象同传统DLLME中分散剂的作用不一致，可能原因是乙醇在样品溶液中起到两方面的作用：一方面起到分散作用，另一方面阻碍了TBP与PA间氢键的形成，而后者可能为主要作用。因此，不再额外添加有机溶剂，在DLLME前将酸化的水解液用水稀释到20mL来降低乙醇的含量。

TBP体积对萃取率的影响如图2(C)所示，当TBP体积从200增长到600μL时，萃取率显著升高，当TBP体积从600增长到1000μL时，萃取率不再变化。因此，后续实验选用萃取剂体积为600μL。

盐离子可以影响分析物在水中的溶解度。实验考察了NaCl浓度在0～35％(w/v)范围内变化时对萃取效率的影响。结果显示，NaCl浓度从0增加到15％时，PA萃取率也随之增加，进一步增加盐浓度时，萃取率无明显变化。但当盐浓度增加到20％以上时，会使第二步反萃取的回收率下降，因此，实验优选10～20％(w/v)NaCl，除了NaCl外，还可以用KCl、Na₂SO₄等来改变离子强度。

关于反萃取条件，发明人作过以下相关研究：

由于TBP粘度较高与RP-HPLC流动相兼容性不好，不能直接将TBP进液相分析。因此，在DLLME萃取后液相分析前需进一步处理来避免阻塞进样器并能改善峰形。反萃取被用来衔接DLLME和HPLC分析。

研究条件:600μLTBP沉积相，其他条件同图2；(A)150μLNaOH，300μL甲醇；(B)150μL0.5MNaOH；(C)0.5MNaOH，300μL甲醇。

在碱性条件下，PA以亲水的盐离子状态存在，因此可以用碱水溶液将PA从TBP富集相中反萃取出来。选用0.1～0.6MNaOH来考察NaOH浓度对萃取率的影响。如图3(A)所示，随着NaOH浓度的增加，萃取率增长缓慢，当NaOH浓度为0.5M时，萃取率不再增加。优选，0.5～0.6MNaOH为萃取剂。

由于TBP和PA之间以氢键结合，将PA从其中反萃取出来相当困难。因此考虑用0.5MNaOH含不同体积甲醇(或乙醇)来提高萃取率。

如图3(B)所示，当甲醇体积从0增加到300μL时，萃取率也逐渐升高，当甲醇体积超过300μL时，萃取率不再变化。甲醇在反萃取中的作用同乙醇在DLLME中的作用相似，既起到分散作用又能破坏TBP与PA之间的氢键。优选，甲醇体积为300～400μL。

NaOH溶液的体积考察范围为80～150μL，如图3(C)所示，在80～120μL范围内，随着NaOH溶液体积的增加，萃取率也相应提高，当NaOH溶液体积超过120μL，萃取率基本保持不变。优选，NaOH溶液体积为120～150μL。

以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例：

该实施例的检测样品为：大豆油、玉米油、葵花籽油和调和油，均购买于当地超市，室温下保存。

检测步骤：

(1)准确称取1g食用油于带盖的25mL玻璃瓶中，加200μL1M四丁基氯化铵(TBAC)，1mL乙醇，10mL4MKOH溶液；

(2)盖紧瓶盖后，80℃水浴下振摇加热10min；反应完后冷却至室温，加6.5mL6MHCl中和水解液，用超纯水定容至20mL，此时溶液pH约为1～2；

(3)加10mL正己烷，振摇5min，静置分层后，弃去正己烷层，重复该过程一次；

(4)取9mL下层水解液至10mL玻璃离心管中，加0.9gNaCl和600μLTBP，轻摇2min后，5000rpm离心3min，分层；

(5)取500μL上层TBP相至微型离心管中，加入120μL0.5MNaOH和300μL甲醇混合液，超声提取2min，5000rpm离心3min；

(6)用100μL微量进样器取下层水相并准确计量吸出体积(120±2μL)，酸化后供液相分析，得到PA的含量。

(7)试剂空白值测定：在上述方法中，不加入实际油样，其它步骤不变，检测空白值。

(8)在(6)中计算得到的PA含量减去试剂空白值，得到所测油样中PA含量，最后计算对应的PAEs总量。

色谱条件为：色谱柱：WatersXterraC₁₈色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.05M乙酸水溶液(30:70，v/v)；流速：1.0mL/min,检测波长：240nm；进样量：20μL；柱温：常温。

标准品溶液为：准确称取邻苯二甲酸(PA，99％)标准品10mg(精确到0.1mg)，用甲醇配成1.0mgmL^-1储备溶液，-20℃避光储存。

线性范围，检测限(LOD)和定量限(LOQ)选择一种加标葵花籽油样来获得。选取5个不同浓度的分析物标准品溶液所对应的色谱峰面积建立工作曲线，用于样品含量测定，范围为0.08～2μgg^-1。

LOD和LOQ通过基线噪音(S/N)标准偏差的3倍和10倍计算得到。日内、日间重现性和加标回收率选用1g油样加标200μL己烷溶解的DEP、DBP、DHEP和DDP混标(1μgmL^-1)来评估。

发明人评估了本发明方法的线性范围、重现性、检测限(LOD)和定量限(LOQ)。

工作曲线的线性范围为0.08～2μgg^-1，线性方程为y＝3353.8x-657.21(r>0.997)，日内和日间重现性用RSD表示分别为3.9％和7.1％，LOD(S/N＝3)和LOQ(S/N＝10)分别为0.11nmolg^-1和0.36nmolg^-1。

为了考察方法的实用性，发明人对当地的7种油样品的PAEs总量进行测定。加标回收率选用1g油样加标200μL己烷溶解的DEP、DBP、DHEP和DDP混标(1μgmL^-1)来评估，这四种物质分别代表不同极性的PAEs。测定结果见表1，相应的色谱图见图4。

用PA在不同波长下峰高的比值来验证PA峰的纯度(Y.Haroonetal.,1986,Clin.Chem.32,1925-1929)。

以PA的峰面积代入上述标准曲线中求出待测液中PA的含量，通过PA的摩尔量计算样品中PAEs的总摩尔量。

根据下列公式计算出食用油中PAEs的总含量。

$X=\frac{C}{166.13}\×{10}^3$

X---食用油中PAEs总含量，nmolg^-1

C---PA的含量，μgg^-1

166.13---邻苯二甲酸的相对分子质量，gmol^-1

7个油样中PAEs总量为2.71～6.25nmolg^-1。

样品加标回收率为82～99％，RSDs小于6.5％。该结果符合欧盟标准(EuropeanCommissiondecision2002/657/EC)，说明本发明的方法准确可靠。

表1食用油中PAEs总量和加标回收率

对比例：

该对比例采用文献1(etal.,2011,FoodChem.,124,392-395)中公开的样品前处理方法和本申请的样品前处理方法对相同的加标植物油样品进行测定，比较二种样品前处理对PAEs水解产率的影响，结果见表2。

表2文献1与本发明测定酞酸酯水解产率的结果比较

方法：1g葵花籽油中加入200μL400μgmL^-1DDP(己烷储备液)，4mL氯仿-甲醇(2:1)混合溶剂提取样品中的酞酸酯(机械振摇约1h)，取氯仿层2mL,加入1mLNaCl(5％)溶液除去甲醇，蒸干氯仿后加入1mL甲醇和1mLNaOH(2M)在80℃烘箱中放置20h，反应完后加HCl酸化，1m己烷净化后，样品用HPLC-DAD分析。

本发明的方法：1g葵花籽油中加人200μL400μgmL^-1DDP(己烷储备液)和200μL1M(56mg,四丁基氯化铵)、1mL乙醇和10mLKOH(4M)，80℃水浴下振摇10min，反应完后加HCl酸化，调节pH＜2。样品用HPLC-DAD分析。

空白值测定：在上述方法中，不加入DDP标准品，其它步骤不变，检测空白值。

PA峰纯度检验：比较样品和2μgmL^-1标准品在不同波长(220nm、240nm和260nm)下PA的峰高的比值来验证样品中PA峰的纯度。

等建立的测PAEs总量的方法和本研究中测PAEs总量的方法中都需要将PAEs进行水解，水解反应时间是关键所在。通过比较可看出，两者的水解产率和重现性均无显著差异，但本发明的方法大幅度缩短了水解时间，体现出本方法的明显优势。

Claims (8)

1.一种食用油中酞酸酯总量的检测方法，其特征在于，该方法包括：

在催化剂存在及碱性条件下，将食用油中的酞酸酯水解为邻苯二甲酸，得到水解液；

检测水解液中邻苯二甲酸含量，根据邻苯二甲酸含量推算酞酸酯含量；

所述检测水解液中邻苯二甲酸含量包括：

净化处理：在pH为1～2的条件下，利用净化液去除水解液中的亲脂性干扰物，得到净化样品；

萃取：利用磷酸三丁酯对净化样品中的邻苯二甲酸进行萃取，得到萃取液；

反萃取：利用碱液与甲醇或乙醇混合溶液反萃取萃取液中的邻苯二甲酸，得到待检测样品；

检测：利用高效液相色谱检测待检测样品中的邻苯二甲酸含量，将其含量换算成酞酸酯含量。

2.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯总量的检测方法，其特征在于，水解温度为80～95℃。

3.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，所述催化剂为相转移催化剂四丁基氯化铵。

4.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，所述净化液为正己烷、环己烷或正己烷和环己烷的混合液。

5.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，所述净化样品中添加有分散剂，所述分散剂为乙醇或甲醇。

6.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，所述反萃取萃取液为甲醇和氢氧化钠溶液、乙醇和氢氧化钠溶液、甲醇和氢氧化钾溶液、乙醇和氢氧化钾溶液。

7.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，所述净化样品中添加有10％～20％(w/v)的盐。

8.如权利要求1所述的食用油中酞酸酯含量的检测方法，其特征在于，检测过程中，物质的用量关系为：

食用油样品：1g；

催化剂：28～56mg；

碱性条件：4MKOH溶液10～20mL；

净化液：15～30mL；

萃取剂：600～800μL；

碱液：浓度为0.1～0.5M的碱液80～150μL；

甲醇或乙醇：100～300μL；

水解时间为10～15min。