SU1165984A1 - Способ определени производных бензимидазола в биологических объектах - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ОПРЕЛЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстракцию его органическим растворителем, очистку экстракта от коэкстрактивных веществ, упаривание экстракта, хроматографирование на пластинах Силуфол УФ-254 и идентификацию производных бензимндазола путем облучени  ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм, отличающийс   тем, что, с целью повышени  чувствительности и точности способа, в качестве органического растворител  в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществл ют на колонке с окисью алюмини  смесью эфира и ацетона в соотношении 2:11:2 с последующей элюцией производных бенэимидазола хлороформом. 2. Способ по п. 1,отличаю щ и и с   тем, что, с целью повышени  специфичности способа путем обеспечени  возможности дополнительного определени  фенбендазола в био (Л логических объектах, хроматограммы после облучени  ультрафиолетовым светем обрабатывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора треххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-рого раствора кали  гексацианоферрата III в Сд 50%-ном водном ацетоне в соотношеел нии 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110 С до по влени  п тен препарата голубой окраски. |i

Description

1

Изобретение относитс  к санитарии и фармакологии и может быть использовано дл  санитарно-гигиенической оценки продуктов животноводства после применени  метш1-Ы-(2-бен9имидазолил )карбамата (БМК) и фенбендазола в качестве лечебных препаратов и разработки рациональных методов терапии животных при гельминтознбпс заболевани х.

БМК структурной формулы

N

кн-со-осн.

659842

довани  и включает использование метанола - высокотоксичного вещества , дл  работы с которьм необходимо специальное разрешение. 5 Известен также способ определени  производных бензимидазола - 6ена:цила и БМК в ткан х животного происхоадени  спектрофотометрическим методом. Способ основан на извлече0 НИИ бенацила и БМК из проб хлороформом , отделении препаратов от мешающих примесей 10%-ным раствором серйой кислоты и последующем спектрофотометрировании проб при двух длинах волн - 281 и 295 нм. Чувствительность метода 0,5 мг/кг 2j.

Недостатками способа  вл ютс  низка  чувствительность определени  БМК, необходимость параллельного исследовани  контрольных проб (аналогичных тканей, не содержащих БМК) и недостаточна  очистка экстрактов . Наиболее близким по технической

5 сущности к изобретению  вл етс 

Хроматографический метод определени  остаточных количеств арилата (бенлата ) по БМК в растительных объектах, почве и воде. Способ основан на извд лечении БМК из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в сол нокисл5то среду, а Затем после подщелачивани , в этипацетат с последующим определением методом тонкослойной хроматографии в системе подвижных растворителей этилацетат-хлороформ-лед на  уксусна  кислота (50:50:10) на пластинах Силуфол УФ-254. Чувствительность способа 0,2 мг/кг (10 мкг в пробе) дл  oгypцoвJ 0,3 мг/кг (10 мкг в пробе ) дл   блок и 0,75 мг/кг (15 мкг в пробе) дл  поч1ы. Процент определени  составл ет 70-90 З J,

5 Недостатками известного способа  вл ютс  низка  чувствительность определени  (10-15 мкг препарата в пробе), невозможность его применени  дл  определени  фенбендазола 0 и БМК в ткан х животных из-за недостаточной очистки экстрактов и использовани  больших количеств этилацетата (350 мл на одну пробу).

Цель изобретени  - повьшгение 5 чувствительности, точности и специфичности способа.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что в качестве органического растворител  в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществл ют на колонке с окисью алюмини  смесью эфира и ацетона . в соотношении 2:1-1:2 с последующей элюцией производных бензимидазола хлороформом. Дл  обеспечени  возможности дополнительного определени  фенбен дазола хроматограммы после облзгче .ни  ультрафиолетовым светом обраба тывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора трёххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-ного раствора кали  тексацианоферрата III в 50%-ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-1Ю С до по влени  п тен препарата голубой окраски. При экстрагировании вы вл емых препаратов ; из биологических объектов одновременно извлекаетс  большое количество коэкстрактивных веществ (жиры, пигменты), которые мешают при конечном определении препаратов тонкослойной хроматографией . Дл  удалени  коэкстрактивных веществ провод т упаривание экстрактов , сухой остаток смывают небольшим количеством эфира , не допуска  конденсации воды, и внос т в хроматографическую коло ку. Колонку наполн ют последовател но безводным сернокислым натрием высотой 1 см, окисью алюмини  высо той 1,5 см и слоем безводного сернокислого натри  высотой 1 см. Дл  увеличени  скорости потока элюирукмцих растворов, через колонку при очистке экстракта в качестве адсор бента используют окись алюмини  с размером частиц 80-125 меш. Очистка экстрактов от примесей основана на том, что фенбендазол и БМК адсорбируютс  на окиси алк 4и и не элюируютс  определенным количеством смеси эфира и ацетона, кото ра  в то.же врем  хорошо злюирует коэкстрактивные вещества. При испол зовании колонки с указанными парам рами используют 10 мл смеси эфира и ацетона в соотношении 2:1-1,:2. П ле удалени  коэкстрактивных вещест препараты вымывают из колонки 25 30 мл хлороформа. Эфир-ацетоновый элюент отбрасывают, а хлороформный упаривают до объема 0,2-0,3 мл и 844 нанос т на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254. После развити  хроматограммы в системе подвижньж растворителей п тна препаратов вы вл ют в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Фенбендазол и БМК обнаруживают в виде сиреневых п тен на зеленом флуоресцирующем фоне. Кроме того, дл  определени  фенбендазола используют свежеприготовленную сме.сь 2,5%-ного раствора трёххлористого железа в 50%-ном водном-ацетоне и 0,25%-ного раствора кали  гексацианоферрата III в 50%ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5. После опрыскивани  пластин их выдерживают при 90-110 С до по влени  голубых п тен фенбендазола на желто-зеленом фоне. Pf фенбендазола в системе подвижных растворителей хлороформ-этанол (20-1) составл ет 0,35-0,45,- БЖ 0 ,45-0,55. Поэтому дл  достоверного дифференцировани  их между собой провод т дополнительное опрыскивание пластин смесью растворов трёххлористого железа и кали  гексациа- ноферрата III. При этом фенбендазол про вл етс  в виде голубых п тен на желто-зеленом фоне после нагревани  пластин, а БМК, в отличие от фенбендазола, данным реактивом не про вл етс . Оптимальные результаты при обнаружении п тен фенбендазола получают при опрыскивании.пластин смесью 2,5%-ного водно-ацетонового раствора трёххлористого железа и 0,25%-ного водно-ацетонового раствора кали  гексацианоферрата III в соотношении 3:1-1:5. Способ осуществл ют следук цим образом. Пример 1. Навеску 10 г м са , 5 г печени, 5 г жира, 10 г почек измельчают, помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 15-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате дл  встр хивани  в течение 1 ч. Затем хлороформный или эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку. К пробе повторно добавл ют 10-15 мл хлороформа или эфира, встр хивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции растворител . Объединенный экстракт упаривают на вод ной бане при 6080 С . Сухой остаток смывают эфиром двукратно порци ми по 2-3 мл и вно5 . с т в стекл нную колонку с внутрен ним диаметром 8-9 мм, содержащую 1,5-сантиметровый слой окиси алюми Ни  дл  хроматографии, заключенный между сло ми безводного сернокисло го натри  по 1 см. После прохождени  экстракта через колонку провод т удаление коэкстрактивных веществ . Пример 1а, Колонку промыв ют смесью эфира и ацетона в соотно шении 2:1 в количестве 10 мл. При обнаружении фенбендазола и БЖ в ультрафиолетовом свете на пластине обнаруживают крэкстрактив ные вещества, которые затрудн ют вы вление и количественную оценку препаратов. Пример 1б (оптимальный вариант). .Колбнку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл. При обнаружении препаратов в ультрафиолетовом свете сиреневые п тна фенбендазола и БМК четко вьщел ютс  на зеленом флюоресцирут кицем фоне пластины. Пример 1в. Колонку промывают смесью эфира и ацетона в соот ношении 1:2 в количестве 1О мл. При обнаружении препаратов.в ультрафиолетовом свете на пластине обнаруживают коэкстрактивные вещества , затрудн ющие идентификацию препаратов. Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки 25-30 мм хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку. Хлороформ ный элюент упаривают до объёма 0,2-0,3 мл и нанос т на хроматогра фическую пластину Силуфол УФ-254. Р дом с пробой на пластину нанос т известные количества фенбендазола и БЖ в хлороформе (стандарты). Пластину помещают в камеру со смесь подвижных растворителей хлороформэтанол (20:1). После прохождени  растворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм При этом фенбендазол и БЖ обнаруживают в виде темно-сиреневых п те на зеленом флуоресцирующем фоне пл тины. Количество препарата в пробе оп редел ют путем сравнени  интенсивн ти окраски и площади п тен пробы и 846 стандартных растворов, использу  следующую формулу: А S2 К зГр где X - общее количество фенбендазола и/или БЖ, мг/кг; А - количество фенбендазола и/или БЖ в стандартном растворе, нанесенном на пластину, мкг -, S, - площадь; п тна стандартного раствора фенбендазола и/или ВЖ, мм J S - площадь п тна фенбендазола и/или БЖ из исследуемой пробы, мм J К - коэффициент пересчета, учитывающий полноту определени  фенбендазола (1,264) и ШК (1,261), Р - масса исследуемой пробы, г. Пример 2. Навеску 10 г м са, 5 г печени, 5 г жира, 10 г почек измельчают,помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 115-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате дл  встр хивани  в течение 1 ч. Затем хлороформный или эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку . К пробе повторно добавл ют 1015 мл хлороформа или эфира, встр хивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции растворител , Объединенный экстракт упаривают на вод ной бане при 60-80°С. Сухой остаток смывают эфиром двукратно порци ми по 2-3 мл и нанос т на стекл нную колонку свнутренним диаметром 8-9 мм, содержащую 1,5сантиметровьй слой окиси алюмини  дл  хроматографии, заключенный между .СЛОЯМИ безводного сернокислого натри  по 1 см. После прохождени  экстракта через колонку провод т удаление коэкстрактивных веществ. Дл  этого колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл. Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки 25-30 мл хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку. Хлороформный экстракт упаривают до объема 0,2-0,3 мл и нанос т на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254 i Р дом с пробой на пластину нанос т известные количества фенбендазола и БЖ (стандарты). Пластину прмещают в камеру со смесью подвижных растворителей хлороформ Этанол (20:1). После прохождени  р ворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовы светом с длиной волны 254 им. При этом фенбендазол и БМК обнаруживаю в виде темно-сиреневых п тен на зеленом флуоресцирующем фоне пластины . Флуоресцирующие на пластине п тна фенбендазола и ВМК из стандарных растворов и исследуемой про бы обвод т по периметру простым карандашом, пластину опрыскивают свежеприготовленной смесью 2,5%-но раствора треххлористого железа в 5 ном водном ацетоне и 0,25%-ного раствора кали  гексацианоферрата I в 50%-ном водном ацетоне в ;соотно1п шении 3:1-1:5 и выдерживают при 90-110 с до по влени  .п тен фенбен дазола . : Пример 2а. Пластину опры кивают про вл н цим реактивом при соотношении компонентов 3:1. Фенбендаэол вы вл ют в виде бледно-голубого п тна на светлом желто-зеленом фоне. Пример 26 (оптимальный вариант). Пластину опрыскивают про вл ющим реактивом при соотношении компонентов 1:1. Фенбендазол вы вл ют в виде интенсивного голубого п тна на светлом желто-зеленом фоне. Пример 2в. Пластину опрыскивают про вл ющим реактивом при соотношении компонентов 1:5.

Объект иссле- Навеска, :довани  848 Фенбендазол вы вл ют в виде бледного голубого п тна на светлом желто-зеленом фоне. Количественную, оценку фенбандазола провод т, как указано. В таблице представлены результаты определени  количеств фенбендазола и БМК при добавлении их к исследуемым объектам. Чувствительность предлагаемого способа составл ет 0,5 мкг фенбендазола и 1 мкг БМК в нанесенной на -пластину пробе или дл  фенбеидазола в м се и почках 0,05 мг/кг, в печени и жире 0,1 мг/кг} дл  БЖ в м се и почках 0,1 мг/кг, в печени и жире 0,2 мг/кг. Процент определени  равен дл  фенбендазола 79,1.+2,2-, дл  БМК 79,3t1.1. Предлагаемый способ дает возможность осуществл ть контроль за чистотой продуктов животного происхождени  после применени  фенбендазола и БЖ с лечебной и профилактической целью. Он обладает высокой чувствительностью, точностью, специфичностью и позвол ет определ ть одновременно два препарата в орга- . нах и ткан х животных. Повышение чувствительности предлагаемого способа имеет з.начение при санитарной оценке продуктов животноводства, так как фенбендазол и БЖ на урови х ниже чувствительности известного способа сохран ютс  в биологических объектах длительное врем .

Claims (2)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстракцию его органическим растворителем, очистку экстракта от коэкстрактивных веществ, упаривание экстракта, хроматографирование на пластинах Силу- фол УФ-254 и идентификацию производных бензимидазола путем облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в качестве органического растворителя в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона в соотношении 2:11:2с последующей элюцией производных бензимидазола хлороформом.

2. Способ поп. 1, о т л и чающий с я тем, что, с целью повышения специфичности способа путем обеспечения возможности дополнитель- S ного определения фенбендазола в биологических объектах, хроматограммы после облучения ультрафиолетовым светом обрабатывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора треххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-рого раствора калия гексацианоферрата III в 50%-ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110^вС до появления пятен препарата голубой окраски.

SU ,1165984