SU726479A1 - Способ количественного определени зеараленона в ткан х животных - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к аналитической химии, а именно к способам количественного определени  микотоксина Ф-2-зеараленона лактона б-(10-оксй -б-йксо-транс-1-ундеценил) р -резорциновой кислоты в ткан х животных.

Известен способ определени  микотоксинов в кормах, заключагацийс .в обработке анализируемой пробы хлороформом с последующей обработкой хлороформного сло  гексаном и бензолом , дальнейшей очисткой на колонке, заполненной силикагелем, и хромато- графированием остатка в тонком слое силикагел  1.

Таким способом невозможно определить зеараленон.

: К предлагаемому способу наиболее близок способ количественного определени  зеараленона в ткан х животных, заключающийс  в обработке анализируемой пробы хлороформом, очистке полученного раствора на колонке, запелненной силикагелем, с последующим элюированием зеараленона смесью бензола и ацетона, концентрировании элюата с хроматографированием концент рата в тонком слое силикагел  2.

Недостатками такого способа вл ютс  низкие чувствительность (0, 5 . / мг/кг)и избирательность определени .

Целью изобретени   вл етс  повышение избирательности и чувствительности определени .

Цель достигаетс  способом количесвенного определени  зеараленона в ткан х животных, заключающимс  в обработке анализируемой пробы ацетоном очистке полученно1го раствора на колонке , заполненной окисью алюмини , с элюированием зеараленона смесью ацетона и воды, вз тых, в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, концентрировании элюата и хроматографировании концентрата в тонком слое силикагел  с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитро- , фенилдиазойий тётрафторборатом.

Отличием предлагаемого способа  вл етс  использование в качестве органического растворител  ацетона, 3 качестве адсорбента окиси алюмини  1раведение элюировани  смесью ацеточа и воды, вз тых: в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1 и, последующа  обработка тонкослойной хроматогграммы п-нитрофенилдиазоний тетрафторборатрм . Пример . Дл  определени  эеараленона 10- г гомогенизированного .образца (мышечна  ткань, печень,почки , кровь, патологический материал) внос т в колбу емкостью 250 мл. Зате в нее вливают 60 мл ацетона и встр хивают на игуттель-аппарате в течение 2 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу с притертой пробкой . Извлечение токсина повтор ют, использу  еще 60 мл ацетона. Объединенный экстракт перенос т в фарфоровую чашку 13 и выпаривают на кип п ей вод ной бане досуха. Получен ный остаток очищают от коэкстрактивных веществ на колонке окиси алюмини П степени активности дл  хроматографировани . Колонку дл  хроматографировани  готов т следующим образом. В нижнюю часть колонки помещают тампон ваты высотой 1 см, затем внос т 5 г окиси алюмини  и промывают колонку 20 мл ацетона квалификации о.с.ч.,х.ч. или после дистилл ции. Остаток в чашке после выпаривани  элюата.раствор ют в 20 мл ацетона и внос т в колонку. После того, как экстракт опуститс  до верхнего кра  столбика адсорбента, через колонку пропускают 150 мл чистого ацетона и затем 50 мл ацетона, содержащего 1% воды. Токсин элюируют 50 мл смеси ацетон-дистиллированна  вода (9 si по объему). Элюат собирают в чашку № 10 и выпаривают на вод ной бане досуха. Ост.Чток в чашке раствор ют в 30 мл ацетона и фильтруют через бумажный фильтр в чистую фарфоровую чашку 10. Фильтрат выпаривают на вод ной бане досуха. Полученный после выпаривани  раст ворител  остаток в чашке раствор ю в 1 мл бензола и полностью в 2-3 при ема нанос т на пластинку силуфола микропипеткой, использу  струю гор чего воздуха. Одновременно готов т свидетели т.е. нанос т на плйстинку 10; 20; 30; 50 и 100 мкл раствора зеараленона в бензоле, что соответсггвует 1;2;3;5 и 10 мкг зеараленона и выпаривают растворитель. Образцы нанос т на пластинку в/следующей последовательности: повторность, свидетели, 2 повторность. Размер п тен не должен превышать 0,5 см. Места нанесени  проб располагают на рассто нии 1,5-2 см от нижнего и боковых краев пластинки и друг от друга. В камеру дл  хроматографировани  внос т 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (в соотношении 1:3 по объему) и через 20 мин помещ ют пластинку в вертикальном положени после того как растворитель подниметс  на высоту 10-12 см, пластинку вынимают, отмечают фронт растворите л  и помещают в сушильный шкаф HS 3 мин при 105 С. Затем пластинку опрыскивают , свежеприготовленным 0,05%-ным раствором прочного красного Ж в 50%-ном этаноле и снова помещают в сушильный шкаф при этой же температугма на 5-7 мин. Зеараленон про вл етс  в виде  рко желтого п тна на белом фоне с R 0,47 + 0,01. Количество токсина в пробе определ ют, сравнива  интенсивность окраски и площадь п тен свидетел  и образца. В случае, если содержание микотоксина в пробе превышает 10 мкг, то получают хроматограмму стандартов большей концентрации (10-20 мкг). Концентрацию Ф-2 в образце рассчитывают по формуле: А У : - -, , где X - содер)1;аниё зеараленона в исследуемой пробе, мг/кг; А - количество токсина в навеске, мкг ; Р - вес пробы, г. Чувствительность определени  зеараленона в органах и ткан х животных при навеске 10 г составл ет 100 мкг/кг (0,1 мг/кг). Абсолютна  чувствительность обнаружени  стандартного вещества в тонком слое силикагел  (силуфола) составл ет 0,25 мкг. Степень извлечени  зеараленона зависит от соотношени  между массой образца и объемом органического раЪтворител , а также от времени экстракции . Если 10 г пробы встр хивать в течение 2 ч с 60 мл ацетона, то извлечение-Ф-2 составл ет 45-«:3%. Увеличение времени экстракций повышает выход токсина только на 5-7%. Двукратна  обработка проб ацетоном порци ми по 60 мл повышает извлечение зеараленона до 75-80%, а при дальнейшей экстракции выход токсина возрастает незначительно (до 82-85%). Причем аналогична  обработка проб хлороформом приводит к извлечению не более 60% токсина. Установл ено, что зеараленон прочно удерживаетс  на колонке окиси алюмини . Применение силикагел  было малоэффективным из-за мешающего вли ни  коэкстрактивных веществ и слабой адсорбции зеараленона. При этом значительную роль играет элюент. Так, при десорбции зеараленона смесью ацетона и .уксусной кислоты происходит разложение токсина и вьвквание большого количества мешающих анализу веществ, Элюирование ацетоном с добавкой пщроксида натри  также приводит к одновременной десорбции коэкстрактивных веществ. Наиболее приемлемым элюентом  вл етс  смесь ацетона и дистиллированной воды в соотношении 8,9-9, 05; 0,95-1,1, При меньшей содержании воды в ацетоне десорбции Ф-2 практически не происходит , или она очень слаба , а при высоком соотношении между ацетоном и водой на результаты анализа вли ют коэкстрактивные вещества. Масса адсо,рбен: а в колонке оказывает действие на адсорбцию токсина и других соединений. Испытаны колонки с 2, 3, 5, 7 и 10 г окиси алюмини . Наилучшие результаты по степени десорбции Ф-2 и удерживани  примесей получены с массой адсорбента, равной 5г. С целью избирательного определени зеараленона испытаны различные реакции с образованием окрашенных комплексов . Установлено, что Ф-2. про вл ет свойства фенола, вступа  в реак ции сочетани  с 4-аминоантипирицом, дназореактивами, реагирует с реактивом Фолина-Чокальтеу. Однако чувствительность обнаружени  Ф-2 посредст вом 4-аминоантипирина и реактива Фолина-Чокальтеу не превышает 3-5.мк Ф-2 наиболее четко про вл етс  диазо реактивом -п-нитрофенилдиазоний. тетрафторборатом. При этом на белом фоне пл,астинки наблюдают  рко желтые компактные, не обесцвечивающиес  при хранении хроматограг/ мы п тна вещества без мешающего вли ни  коэкстрактивных веществ. Интенсивность окраски п тен возрастает в интервале 0,25-20 мкг, а минимально определ емое количество микотоксина в тонком слое силикагел  оказываетс  равным : 0,25 мкг. Чувствительность обнаружени  зеараленона в ткан х животных достигает 100мкг/кг, что в 5 раз выше по сравнению с известным способом. При облучении хроматограмм, полученных по предлагаемому способу, УФ-светом (256 им) не наблюдают флуоресцирующих п тен, за исключением зон, соответствующих Ф-2, в то врем  как при. экспозиции к УФ-свету (256 нм) хроматограмм, полученных по известному способу, про вл етс  множество п тен, флуоресцирующих голубым , синим и зеленым цветом, а идентификаци  зеараленона становитс  невозможной . При этом свидетель-зеараленон после вторичного оёлучени  не флуоресцирует. Преимущества способа согласно изобретению по сравнению с известным приведеныв таблице.

Мышечна  ткань

0,05 кролика, 10 г

кролика,

0,05 0,10 0,50 1,00

кролика. Юг

0,05 0,10

0,50 1,00

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ количественного определени  зеараленона в ткан х животных путем обработки анализируемой пробы органическим растворителем, очистки

   Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

   .Не обнаруженНе обнаружен Не обнаружен

   То жеТо же О, 07

   - -0,40 0,35

   Следы 0,80 0,80

   Не обнаружен Не обнаружен То же 0,07 0,50 0,40

   0,80

   1,00

   полученного раствора на,колонке, заполненной адсорбентом, с последующим элюированием зеараленона, концентрированием элюата и хроматографированием концентрата в тонком слое, от7 :72647 ли чающийс  тем, что, с целью повышени  избирательности и чувстви: TenbMocfH определени ,.в качестве органического растворител  испольэуют ацетон, в качестве адсорбента- окйСь алймнни  и элюирование прово-, д т смесью ацетона и воды, вз тых в рб емнрм соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофенилдиазоНИИ тетрафторборатом.... 9 8 Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе V . 1. Авторское свидетельство СССР 389446, кл. G 01 N 31/08, 1973, опублик. 2, R. W. Eppley,Screeming method for F-2, aflatoxins and pchratoxin, j. Association office Analytical CKemists, vol 51, 1, p. 74, 1968 ( прототип) .