SU1196772A1 - Способ определени фоксима в секционном материале - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИМА В СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извлечени  его из пробы н-гексаном в присутствии безводного сульфита натри , экстракционного перераспределени  в системе н-гексан - диметилформамид с последующим хроматогра даческим анализом в тонком слое кремниевой кислоты, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности способа, хроматографи ческий анализ осуществл ют на пластинах Силуфол, импрегированных 60%-ным pacTBolDOfi диметилформамида в метаноле и н-гексане, насыщенном диметилформамидом,

Description

:о

СГд

Изобретение относитс  к химическому анализу секционного материала дл  обнаружени  в нем фосфороргацического инсектицида фоксима 0, этилтиофосфорил 0-(альфа-цианобензальдоксим при судебно-медицинской экспертизе острых отравлений. Цель изобретени  - повьшение чувствительности способа. Способ осуществл етс  следующим образом. Дл  изолировани  фоксима к 25 г средней пробы измельченного органа (печень, почки, желудок,, кишечник ) в колбе вместимостью 200-250 мл с притертой пробкой добавл ют 50 мл н-гексана, 25 г безводного сульфата натри  и оставл ют на I2 ч при периодическом перемешивании. Жидкость отфильтровывают в колбу отгонки расрастворител . Остаток в колбе внойь заливают 50 мл н-гексанаи извлекают при периодическом взбалтываний в те чение 2 Ч. Извлечение отфильтровы , вают и присоедин ют к основному. Операцию повтор ют. Растворитель отгон ют на ротационном вакуумном испарителе при 25-30С до объема 10-12 мл, С целью отделени  основной массы балластных веществ производ т экстра ционную и хроматографическую очисткУ и делительную воронку КЧ вместимостью 75-100 мл с помощью н-гексан перенос т сконцентрированное до 10-20 мл извлечение из биологическо го материала так, чтобы объем гекса новой фазы составил 25 мл, В делитель ную воронку наливают 25 мл диметил- формамида (ДМФА), насыщенного н-гек саном, и экстрагируют при энергично взбалтьшании 3 мин. Нижнюю фазу ДОФ перенос т в делительную воронку К вместимостью 75-100 мл, содержащую 25 мл н-гексана, насьщ енного ДМФА, В делительную воронку добавл ют 25 мл ДМФА, насьпценного н-гексаном. Содержимое делительных воронор №1 и З взбалтывают 3 мин. После разделени  слоев из делительной воронки №2 ДМФА перенос т в делительную воронку №3 .вместимостью 500 мл, содержащую 40 мл 12%-ного раствора хлорида натри , а из делительной воронки №1 в делительную воронку №2, В делител ную воронку №1 добавл ют 25 мл ДМФА 72 насыщенного н-гексаном. Содержимое воронок №1 и 2 взбалтывают 3 мин. Слой ДМФА из воронки перенос т в воронку №3, а из воронки №1 - в воронку №2, Гексановую фазу в воронке №1, содержащую экстрактивные вещества , отбрасывают. Взбалтывают содержимое делительной воронки № 3 3 мин, по разделении слоев ДМФА извлечение отдел ют и присоедин ют к экстракуту в воронке №3, Гексановую фазу в воронке №2, содержащую экстрактивные вещества,отбрасывают,Содержимое воронки №3 осторожно перемешивают, ; при этом отдел етс  слой н-гексана, Добавл ют 10 мл н-гексана и реэкстрактируют фоксим взбалтыванием в течение 3 мин. После разделени  слоев нижнюю водную фазу отдел ют в колбу вместимостью 50 МП, Гексановую фазу перенос т в делительную воронку №4 вместимостью 75-100 мл, содержащую 50 мл 12%-ного раствора хлорида натри , Раствор из колбы перенос т в дели-. тельную воронку №3, стенки промьшают 10-15 мл 12%-ногО раствора хлорида натри  и присоедин ют к раствору в делительной ворон1 е №3, Водную фазу экстрагируют еще двум  порци ми н-гексана по 10 мл, Гёксановые извлечени  перенос т в делительную воронку №4, взбалтывают с раствором хлорида натри . Верхнюю гексановую фазу отдел ют и перенос т в колбу вместимостью 50 мл с г безводного сульфата натри ,Делительную воронку .№4 промывают 5-8 мл и н-гексана, присоедин ют раствор к основному извлечению. Через 30 мин гексановое извлечение декантируют в колбу вместимостью 50 мл, довод т н-гексаном до метки, перемешивают, Хроматографическую очистку производ т следующим образом. 25 мл полученного гексанового раствора, соответствующие 12,5 г исследуемого органа, выпаривают при комнатной температуре до объема 0,5-1 мл, С помощью стекл нного капилл ра, использу  дл  смыва бензол, раствор перенос т в виде полосы длиной 6,5-7 см на стартовую линию хроматографической пластинки с закрепленным слоем кремневой кис- лоты Стекл нные пластины :см изготавливают способом поливки по прописи из расчета на 1 кремне3

вой водой кислоты (150 меш) 0,026 г, гипса (150 меш ) 0,0013 г, дистиллированной воды 0,06 мл. Пластинки сушат при комнатной температуре 12 ч. При перегрузке сорбента, что иногда наблюдаетс  при исследовании объектов с большим содержанием жира, дл  препаративной хроматографической очистки используют меньшую аликвоту исследуемого раствора, например соответствующую 6-8 г органов.

На стартовую линию той же пластин- ки на рассто нии не менее 2 см от кра  пластинки и 2,5-3 см от кра  . полосы исследуемого извлечени  нанос т в виде п тна диаметром -2 мм раствор фоксима в бензоле (метчик) в количестве 10-12 мкг в п тно. Через 10 мин хроматографируют в систе ме бензол. Фронт растворител  14-14,5 см, врем  хроматографировани  30-40 мин. При этом фоксим (Rf 0,47-0,60) отдел етс  от экстрак тивных веществ (Rf 0,70-0,95). Оргаг нический растворитель удал ют при комнатной температуре 15-20 мин. Часть хроматограммы, соответствующую полосе исследуемого раствора, защищают стекл нной пластинкой, а открытую часть с метчиком опрыскивают палладиевым реактивом. Через 15-20 мин обнаруживаетс  п тно мет-, чика.

Из защищенной части пластинки, соответствующей расположению метчика делают соскоб сорбента в виде пр моугольной полосы шириной 4 см ( по 2 см в обе стороны от центра про вленного метчика ). Соскоб перенос т в стекл нную хроматографическую колонку (внутренний диаметр 1,5 см), на дно которой предварительно помещают небольшой тампон ваты, и элюи- руют 50 мл смеси н-гексана - ацетон 1:1, добавл   порци ми по 5-8 мл и обмыва  стенки колонки. Элюат коли чественно перенос т в мерную колбу вместимостью 50 мл с помощью н-,гек- сана и объем раствора довод т до метки тем же растворителем. Аликвотыраствора исследуют.

Хроматографическое исследование провод т последовательно в двух системах 1 . на пластинках силикагел  КСК ,в системе бензол при про влении хромогенными реактивами на различные функциональные группы фоксима (реак

6772

ци ми, описанными ниже в пунктах а или б, в и г ) при сравнении Rf исследуемого вещества с Rf фоксимаметчика (внешний стандарт); исследование в системе бензол может быть проведено и на пластинках Силуфол в сочетании с хромогенными пробами, описанными в пунктах а (или б )и в; П. на пластинках Силуфол, им10 прегнированньгх 60%-ным раствором ДМФА в метаноле в системе н-гексан, насьш енным даФА, Обнаружение фокси- на осуществл ют пaллaдиeвы i реактивом (пункт в ). Разделение. провод т

15 при использовании внутреннего метчика-фоксима .

При исследовании реакци ми с палладиевым, бромфеноловым синим, 4-НБП реактивами и пробой на органи-,

20 чески св занный фосфор, возможно про вление п тен экстрактивных веществ , но они отличаютс  от фоксима по величине Rf.

Хроматографическое исследование

25 провод т следующим образом.

. Аликвоты элюата, эквивалент- ные 2 г органов (дл  обнаружени  палладиевым и. 4-НБП реактивами ) и 2,5 г органов (дл  реакции обнаруже30 ии  по фосфору и с бромфеноловым синим реактивом ), нанос т после предварительного удалени  избытка растворител  на стартовую линию хроматографических пластинок с тонким

а- слоем силикагел  КСК (стекл нные пластинки 13x18 см изготавливают спо-. собом поливки по прописи из расчета на 1 силикагел  КСК (150 меш) 0,013 г, гипса (150 меш ) 0,0007 г,

Q дистиллированной воды 0,03 мл; пластинки активируют при в течение 1ч в виде п тен диаметром 0,3-0,5 см. Дл  перенесений остатков используют бензол. Растворы нанос т

..на пластинку с помощью стекл нных капилл ров. На рассто нии не менее 2 см исследуемых п тен нанос т п тно метчика (раствор фоксима в бензоле 3-5 мкг в п тно ). Хроматограмму развивают в системе бензол. Фронт

50 растворител  14-14,5 см. Растворитель удал ют при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и провод т реакции обнаружени  Rf - фоксима 0,45-0,60.

а. Обнаружение палладиевым раствором: Хроматограмму опрыскивают реактивом (водный раствор 5%-ного содержащий 5 мл хлорида паллади , концентрированной сол ной кислоты в 100 мл раствора, перед употреблением реактив разбавл ют этанолом 1:12 ), П тна желто-коричневого, коричневого или бурого цвета (в зависимости от количества фоксима ) про вл ютс  через 15-20 мин, при относительно больших количествах вещества, а при близких к границе в течение 24 ч. б.Обнаружение бромфениловым синим реактивом: хроматограмму опрыскивают бромфениловым синим реактивом (смесь 2%-ного раствора нитрата серебра в воде и 0,4%-ного раствора бромфенилового синего в ацетоне 1: f,. нагревают при 50 G 10 мин ). По охлаждении опрыскивают 5%-ным раствором уксусной кислоты . По вл ютс  п тна синего цвета на желтом фоне. , в.Обнаружение 4-НБП 4- п-нитро бензил )пиридин : пластинку опрыскивают до увлажнени  2%-ным ацетоновым раствором 4-НБП, затем, избега  сильного увлажнени , 20%-ным раство ром карбоната аммони  разбавленным ацетоном 1:1, нагревают в сушильном шкафу при 20°С 10 мин, охлаждают, опрыскивают 10%-ным раствором гидроксида натри  в 50%-ном этаноле На белом фоне по вл ютс  фиолетовосиние п тна, постепенно обесцвечива щиес . Сразу же отмечают про вленные зоны. г.Обнаружение по фосфору: хрома тограмму (в камере дл  опрыскивани  под т гой )опрыскивают, избега  пол ного увлажнени , раствором хлорной и сол ной кислот в присутствии моли дената аммони  реактив №1 дл  обнару жени  по фосфору: к 1%-ному раствору молибдата аммони  в 0,1 М раство ре сол ной кислоты добавл ют 5% хлорной кислоты 57% и нагревают при 230-250°С в течение 60 мин (под т гой ) в супшльном шкафу. По охлаждении пластинку опрыскивают реактивом №2 5 г молибдата натри  (Na2MoO - ) раствор ют в 150 мл 2 н. сол йой кислоты и смешивают с 1г малахитового зеденого в 100 мл 2и. сол ной кислоты; через 1-2 ч ф.ильтруют через бумажный фильтр, храй т в темной скл нке). Через 5-10 мин отмечают п тна зеленого цвета на оранжевом фоне. 72 6 В описанной хроматографической системе аналогично фоксиму про вл етс  и имеет такое же значение величи .ны Rf байтекс, близкие значени  Rf дифос, трихлорметафос-3,трихлорметафос . Дл  исключени  их провод т дополнительную реакцию обнаружени  с 4- аминоантипирином. На хроматографическую пластинку нанос т аликвоту элюата, эквивалентную 2, г органа , а также п тно метчиков - байтекса и других фосфорорганических пестицидов (ФОП ) (3-5 мкг в п тно ) и хроматографируют в той же системе. Пластинку опрыскивают 6%-ным раствором гидроксида натри , нагревают при 120с в сушильном шкафу 30 мин. По охлаждении опрыскивают 1%-ным раствором 4-аминоантш1ирина гидрохлорида , затем 1,4%-ным раствором феррицианида кали . В присутствии байтекса, дифоса, трихлорметафоса -3 и трихлорметафоса образуютс  п тна розового цвета. При использовании пластинок Силуфол на стартовую линию нанос т аликвоты элюата, эквивалентные 0,5 г органа, метчик - раствор фоксима в бензоле (l-2 мкг в п тно ). Фронт растворител  10 см. Обнаружение фоксима провод т палладиевым (или бромфеноловым синим ) и 4-НБП реактивами, обнаружение байтекса, дифоса, трихлорметафоса-3 и трихлорметафоса - реакцией с 4 аминоантипирйном . Rf-фоксима 0,40-0,63. II. Дл  подтверждени  обнаружени  фоксима и дл  дифференциации фоксима от байтекса, а также от других ФОП (при их обнаружении )провод т исследование на пластинках Силуфол, импрегнированных 60%-ным раствором даФА в метаноле, использу  в качестве подвижной фазы н-гексан, насьш енньй ДМФА. В св зи с тем, что в данной хроматографической системе при исследовании может наблюдатьс  разброс в значени х Rf, особенно в присутствии следов экстрактивных веществ, используют внутренний стандарт (метчик )- фоксим. Оценку результатов анализ по величинам Rf производ т на основании сравнени  Rf-исследуемой пробы, в которую введен внутренний метчик - фоксим, и исследуемой пробы, к которой внутренний метчик не был добавлен.

7.

На пластинки Силуфол на рассто нии не менее 2,5 см от кра  и 2,5 см одна от другой нанос т в виде п тен диаметром не более 0,5 см аликвоты исследуемых извлечений, эквивалентHbie 0,5 г органа. Приведенные аликвоты элюата  вл ютс  оптимальными дл  граничных и приграничных концентраций фоксима - 230-400 мкг в 25 г органа, при больших концентраци х нанос т меньшие аликвоты раствора. При этом из элюата каждого органа исследуют две аликвоты, к одной из них добавл ют внутренний стандарт фоксим (в количестве 5-10 мкг в ис-, следуемую аликвоту), к другой не добавл ют, Фоксим-метчик добавл ют в виде раствора в н-гексане или ацетоне непосредственно к отобранной аликвоте элюата, перемешиваюТ| органический растворитель удал ют до 0,2-0,5 мл и остаток нанос т в виде п тна на пластинку (Силуфол 20x20 ). При обнаружении байтекса или других ФОП их также ввод т в анализируемую пробу в качестве внутренних метчиков ( мкг препарата в п тно ), Рассто ние наносимых п тен от кра  хроматографической пластинки должно быть не менее 3 см, рассто ние между п тнами не менее 2 см.

После нанесени  на пластинку исследуемых проб и по удалении растворител  (5-10 мин) пластинку погружают в раствор ДМФА в метаноле так, чтобы ее поверхность была смочена до уровн  на 0,5 см выше нанесенных на стартовую линию исследуемых растворов. Влажную часть пластинки осушивают, прикладыва  лист фильтровальной бумаги. Область пластинки с п тнами и ниже стартевой линии опрыскивают из пульвери- . затора до легкого увлажнени  раствЬром даФА в метаноле. Пластинку оставл ют на 10-12 мин под т гой, затем помещают в хроматографическую камеру, содержащую н-гексан, насыщенный ДМФА, Предварительное насыщение камеры парами растворител  осуществл ют в течение 1-1,5 ч. Перед внесением каждой новой хро967728

матографической пластинки камеру насьщают парами растворител  не Ь1енее 40.ыин. Фронт растворител  12-14 см. Органический растворитель удал ют под т гой в течение ,1,5-2 ч.После этого пластинку ис- следуют реакци ми, описанными в пунктах айв, Rf фоксима 0,58-0,73, Определ ют и сравнивают

10 величины Rf про вленных зон п тен исследуемых извлечений (без внесенных метчиков-стандартов и с внесенными внутренними метчиками При одновременном присутствии фoкcи

fj ма и других исследованных ФОП наблюдаетс  четкое отделение их от фоксина . Экстрактивные вещества (Rf О; 0,90-1,0 ) также отдел ютс  от фоксима, . Пример, Исследуют три пробы

2Q почек из трупа лица, погибшего от травматического повреждени , К полученным элюатам после хроматографи- ческой очистки, эквивалентеым 12,3 г навески, обозначенным №1 и №2, добавл ют в виде раствора в ацетоне (100 мкг фоксима, в пробу №2 кроме того 200 мкг байтекса; проба №3 - контрольна  (фоксим и байтекс не

. добавл ли ),

JQ На пластинку Силуфол нанос т в виде п тен на стартовую линию аликвоты полученных растворов (№1-3), эквивалентные 0,5 г органа. Параллельно к другим таким же апиквотам элюата проб №1-3 добавл ют внутренний метчик - фоксим (5 мкг в п тно ), Исследуют на пластинках Силуфол, импрегнированных 60%-ным раствором ДМФА в метаноле, в системе н-гексан, насьщенный ДМФА. Зоны разделенных

0 веществ опытов представлены в таблице

Из таблицы следует, что в пробе №1 обнаружен только фоксим (Rf

0,72-0,74, а в пробе №2 фоксим (Rf 0,71-0,73 и байтекс (Rf 0,470 ,50 ). Зоны с Rf О обусловлены . экстрактивными веществами, Rf фоксима и байтекса составл ет

0,23-0,24, что свидетельствует об . удовлетворительном разделении этих соединений в присутствии экстрактивных веществ тканей почек.

0,72

Не добавл ли0; 0,72

50;

0,А7; 0,71

Не добавл ли0; 0,47; 0,71 50;

Не добавл лиО

0,71 50;

0,7А 0,74 0,50;

0,73 0,50; 0,73

0,73

Claims (1)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИМА В СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извле- чения его из пробы н-гексаном в присутствии безводного сульфита натрия, экстракционного перераспределения в системе н—гексан — диметилформамид с последующим хроматографическим анализом в тонком слое кремниевой· кислоты, отличающийся' тем, что, с целью повышения чувствительности способа, хроматографический анализ осуществляют на пластинах Силуфол”, импрегированных 60%-ным pacTBo'pofi диметилформамида в метаноле и н-гексане, насыщенном р диме тилфо рмамидом. ® (/) CZ с ζ© сь м м го