RU2056044C1

RU2056044C1 - Способ количественного определения патулина в пищевых продуктах

Info

Publication number: RU2056044C1
Authority: RU
Inventors: А.И. Погосян; С.Ю. Гельфанд; С.Р. Цимбалаев
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности
Priority date: 1991-01-09
Filing date: 1991-01-09
Publication date: 1996-03-10

Abstract

Назначение: анализ продуктов переработки плодов и овощей на содержание микотоксина патулина для оценки их безвредности. Сущность: в отобранную пробу вводят концентрированную соляную кислоту с доведением pH до 1,0 - 1,5, осаждают мешающие вещества гексациано-(П)-ферратом калия и уксуснокислым цинком, фильтруют, экстрагируют патулин этилацетатом, очищают от оксиметилфурфурола экстракт на сорбенте "силасорб амин", элюируют патулин хлороформом с последующим количественным определением патулина с помощью ВЭЖХ. 3 табл.

Description

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при анализе пищевых продуктов на содержание микотоксина патулина.

Известен способ определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающий введение в образец аскорбиновой кислоты в концентрации 0,1-0,2% проведение диализа образца против 8-12% водного раствора хлористого натрия в течение не менее 3 часов, экстракцию патулина и диализата этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием последовательного элюирования толуолом и смесью гексан-этилацетат в соотношении 2:3-2:3,5, хрома- тографическое разделение с применением двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системах хлороформ-ацетон-муравьиная кислота и толуол-этилацетат-муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82: 14-16: 4-6 и 48-52:38-42:8-12, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина, фиксацию пластинки парафином и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим его количественным определением [1]
Недостатками указанного способа являются большая продолжительность анализа, связанная с необходимостью проведения диализа в течение не менее 3 ч. для многих образцов, подвергшихся длительной термической обработке, недостаточное отделение патулина от оксиметилфурфурола (ОМФ), присутствующего в этих образцах в концентрации, превышающей в несколько сот или тысяч раз концентрацию патулина и существенно затрудняющего обнаружение последнего.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающий добавление в пробу концентрированной соляной кислоты, растворов гексациано-(II)-феррата калия и уксуснокислого цинка, фильтрацию раствора от осадка на складчатом фильтре, добавление к фильтрату солянокислого гидроксиламина, экстракцию патулина из фильтрата этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием последовательного элюирования толуолом и смесью гексан-этилацетат в соотношении 2: 3-2:3,5, хроматографическое разделение с применением двумерной ТСХ в системах хлороформ-ацетон и толуол-этилацетат-муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82:18-22 и 48-52:38-42:8-12, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина, фиксацию пластинки парафином и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим его количественным определением [2]
Недостатками указанного способа являются большая продолжительность анализа, связанная с необходимостью проведения двумерной ТСХ, недостаточная воспроизводимость результатов, обусловленная возможностью дериватизации патулина гидроксиламином, и для ряда образцов недостаточный предел обнаружения патулина.

Цель изобретения сокращение времени проведения анализа, улучшение воспроизводимости результатов и снижение предела обнаружения патулина.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения патулина в пищевых продуктах, включающему отбор пробы, добавление в нее концентрированной соляной кислоты с доведением рН до 1,0-1,5, осаждение мешающих веществ гексациано-(II)-ферратом калия и уксуснокислым цинком, фильтрацию, экстракцию этилацетатом, очистку экстракта адсорбцией на силикагеле, элюирование толуолом и смесью гексан-этилацетат и хроматографическое определение патулина вместо получения производного ОМФ с гидроксиламином и последующего его отделения от патулина с целью сокращения времени проведения анализа, улучшения воспроизводимости результатов и снижения предела обнаружения на этапе хроматографического разделения проводят очистку экстракта от ОМФ на сорбенте "силасорб амин", при этом в качестве элюента используют хлороформ, а количественное определение осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Замена дериватизации ОМФ на его сорбцию из экстракта исключает возможность дериватизации патулина, повышая воспроизводимость результатов, снижает общее содержание веществ в экстракте, позволяя вводить в хроматограф большую аликвоту, не перегружая колонки, что обеспечивает снижение предела обнаружения. Использование ВЭЖХ вместо ТСХ существенно сокращает время анализа, снижает предел обнаружения и повышает точность метода за счет замены визуальной оценки патулина на инструментальную.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в исследуемую пробу добавляют концентрированную соляную кислоту в количестве, необходимом для доведения рН раствора до 1,0-1,5, растворы гексациано-(II)-феррата калия и уксуснокислого цинка. Пробу отфильтровывают от осадка на складчатом бумажном фильтре. Патулин из фильтрата трижды экстрагируют этилацетатом, экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют в отгонную колбу, куда добавляют силикагель, и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС досуха (до состояния, когда силикагель начинает свободно пересыпаться). Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, на нее наливают суспензию 2 г силикагеля Л зернением 100-160 мкм (ЧССР) в 20 см³ толуола. Толуолу дают стечь, не допуская просыхания колонки, добавляют еще 20 см³ толуола и высыпают в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом из отгонной колбы. Толуолу дают стечь и пропускают через колонку еще 100 см³ толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Отгонную колбу ополаскивают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (2:3) и выливают раствор в колонку, куда добавляют еще 100 см³ смеси гексан-этилацетат (2:3). Весь элюат собирают и упаривают в грушевидной колбе на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС досуха. В колбу вводят 4 см³ хлороформа, 50 мг сорбента "силасорб амин" и аккуратно перемешивают. Содержимое колбы переносят на ватный тампон, вставленный в горло стеклянной воронки. Остатки сорбента на стенках колбы смывают еще двумя порциями хлороформа по 3 см³ на ватный тампон. Сорбент дополнительно промывают 35 см³ хлороформа. Весь хлороформный элюат собирают в остродонную отгонную колбу, куда добавляют 50 мм³ раствора n-ацетоаминофенола в хлороформе, используемого в качестве внутреннего стандарта. Содержимое колбы упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС до объема, равного приблизительно 0,2 см³. Полученный раствор анализируют с использованием ВЭЖХ. Хроматографическое разделение проводят на аналитической колонке (250х4 мм), заполненной сорбентом "силасорб СФЕР 600" (5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь гексан-этилацетат-метанол в объемном соотношении 75:20:5, со скоростью протока 1,2 см³/мин, детектируя по поглощению при длине волны 275 нм.

Содержание патулина в пробе (С) в мкг/кг или нг/г вычисляют по формуле
C

где m₁ масса внутреннего стандарта, нг;
S₂ площадь пика патулина, усл.ед.

К относительный поправочный коэффициент, рассчитываемый по методу внутреннего стандарта;
S₁ площадь пика внутреннего стандарта, усл.ед.

m масса навески продукта, г;
V₁ общий объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней воды, см³;
V₂ объем фильтрата, отобранный на анализ, см³.

П р и м е р 1. Анализ яблочного сока (по предлагаемому способу).

Навеску сока массой 50 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³. В мерную колбу вносят 2 см³ концентрированной соляной кислоты, 15 см³ раствора гексациано-(II)-феррата калия с концентрацией 150 г/дм³ и 15 см³ раствора уксуснокислого цинка с концентрацией 300 г/дм³. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через плотный складчатый фильтр. Отфильтровывают 50 см³ раствора. Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 см³ этилацетата, переносят его в делительную воронку и затем 1-2 мин интенсивно перемешивают содержимое. Смеси дают отстояться, после полного разделения слоев водный слой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт переносят в плоскодонную колбу с притертой пробкой. Экстрагирование в аналогичных условиях свежими порциями этилацетата проводят еще 2 раза. Этилацетатные экстракты объединяют и сушат в колбе с притертой пробкой безводным сернокислым натрием (приблизительно 10 г) в течение 10-15 мин. Затем экстракт фильтруют через вату в отгонную колбу. Колбу с сернокислым натрием ополаскивают 15 см³ этилацетата, которые затем также отфильтровывают в отгонную колбу. В экстракт вводят 1 г силикагеля. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС. Концом упаривания считают момент, когда силикагель начинает свободно пересыпаться. Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, на нее наливают суспензию, содержащую 2 г силикагеля в 20 см3 толуола. Толуолу дают стечь, и, не допуская просыхания силикагеля, на него наливают еще 20 см³ толуола. На хроматографическую колонку, находящуюся под слоем толуола, насыпают силикагель с адсорбированным экстрактом из отгонкой колбы. Через колонку пропускают еще 100 см³ толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Отгонную колбу ополаскивают 5 см³ смеси гексан-этилацетат в соотношении 2:3 и выливают раствор в колонку, куда приливают еще 100 см³ смеси гексан-этилацетат (2: 3). Весь элюат собирают и упаривают в грушевидной колбе на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС досуха. В колбу вводят 4 см³ хлороформа, 50 мг сорбента "силасорб амин" и аккуратно перемешивают. Содержимое колбы переносят на ватный тампон, вставленный в горло стеклянной воронки. Остатки сорбента на стенках колбы смывают еще двумя порциями хлороформа по 3 см³ на ватный тампон. Сорбент дополнительно промывают 30 см³ хлороформа. Весь хлороформный элюат собирают в отгонную колбу, куда добавляют 50 мм³ раствора n-ацетаминофенола в хлороформе, используемого в качестве внутреннего стандарта. Полученный раствор анализируют с использованием ВЭЖХ. Хроматографическое разделение проводят на аналитической колонке (250х4 мм), заполненный сорбентом "силасорб СФЕР 600" (5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь гексан-этилацетат-метанол в соотношении 75:20: 5, со скоростью протока 1,2 см³/мин, детектируя по поглощению при длине волны 275 нм. Содержание патулина в анализируемой пробе яблочного сока составляет 31,5 нг/г. Расчет концентрации патулина в пробе:

31,5 нг/г или мкг/кг
П р и м е р 2. Анализ яблочного сока (по известному способу).

Навеску сока массой 50 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количество дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³. В мерную колбу вносят 2 см³ концентрированной соляной кислоты, 15 см³ раствора гексациано-(II)-феррата калия с концентрацией 150 г/дм³ и 15 см³ раствора уксуснокислого цинка с концентрацией 300 г/дм³. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через плотный складчатый фильтр в мерный цилиндр. Отфильтровывают 50 см³ раствора. В полученный фильтрат вводят 1 г гидрохлорида гидроксиламина, содержимое цилиндра перемешивают и настаивают в течение 15 мин. Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 см³ этилацетата, переносят его в делительную воронку и интенсивно перемешивают содержимое в течение 1-2 мин. Смеси дают отстояться и после полного разделения водный слой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт переносят в плоскодонную колбу с притертой пробкой. Экстрагирование в аналогичных условиях свежими порциями этилацетата проводят еще 2 раза. Этилацетатные экстракты объединяют и сушат в колбе с притертой пробкой безводным сернокислым натрием (приблизительно 10 г) в течение 10-15 мин. Затем экстракт фильтруют через вату в отгонную колбу. В экстракт вводят 1 г силикагеля. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС. Концом упаривания считают момент, когда силикагель начинает свободно пересыпаться. Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, на нее наливают суспензию 2 г силикагеля в 20 см³ толуола. Толуолу дают стечь, и, не допуская просыхания силикагеля, на него наливают еще 20 см³ толуола. На хроматографическую колонку, находящуюся под слоем толуола, насыпают силикагель с адсорбированным экстрактом из отгонной колбы. Через колонку пропускают еще 100 см³ толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Отгонную колбу ополаскивают 5 см³ смеси гексан-этилацетат в соотношении 2:3 и выливают раствор в колонку, куда приливают еще 100 см³ смеси гексан-этилацетат (2:3). Весь элюат собирают в грушевидную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40^оС до объема 200 мм³. Полученный раствор анализируют с помощью двумерной ТСХ на пластинках "Силуфол" размером 15х15 см. На пластинке на расстоянии 2,5 см от нижнего и правого краев карандашом проводят две тонкие линии. В точку их пересечения микрошприцем наносят 20 мм³ анализируемого раствора. На обеих стартовых линиях отмечают по три точки, в которые микрошприцем наносят различные количества стандартного раствора патулина в интервале от 10 до 80 нг в пятно. После нанесения всех растворов пластинку одной из стартовых линий вниз помещают в камеру для ТСХ, предварительно заполненную смесью хлороформ-ацетон (80:20) на высоту около 1 см. Проявление хроматограммы в первом направлении заканчивают тогда, когда фронт растворителя будет приблизительно в 1 см от края пластинки. После этого пластинку извлекают из камеры и сушат до исчезновения запаха растворителя. Высушенную пластинку поворачивают на 90^о и помещают второй стартовой линией вниз в другую хроматографическую камеру, предварительно заполненную смесью толуол-этилацетат-муравьиная кислота в соотношении 50: 40:10. Проявление хроматограммы во втором направлении заканчивают тогда, когда фронт растворителя будет приблизительно в 1 см от края пластинки. После извлечения из камеры пластинку сушат до исчезновения запаха растворителя. Затем пластинку помещают в камеру с хлором. Атмосферу хлора в камере создают, медленно приливая 25 см³ концентрированной соляной кислоты и 25 см³ раствора марганцевокислого калия с концентрацией 15 г/дм³. Обнаружение пятен патулина достигается после опрыскивания пластинки раствором бензидина в муравьиной кислоте и просушивания ее в токе воздуха. Для увеличения устойчивости окраски пятен патулина пластинку погружают и вынимают из расплавленного парафина с температурой около 60^оС. Парафину дают застыть, держа пластинку в вертикальном положении. Хроматограмму рассматривают в длинноволновом УФ-свете (365 нм). Патулин обнаруживается в виде желто-зеленых флуоресцирующих пятен на темно-фиолетовом фоне. Сравнивая интенсивность флуоресценции и размер пятен стандарта патулина и пятна патулина в анализируемой пробе, определяют, что в пятне патулина в анализируемой пробе содержится 30 нг вещества. Расчет содержания патулина в пробе яблочного сока:

30 нг/г или мкг/кг
Таким образом, содержание патулина в пробе яблочного сока составляет 30 нг/г.

Продолжительность анализа с использованием методов, описанных в примерах 1 и 2, составляет 2 ч 40 мин и 4 ч 5 мин соответственно (см.табл.1).

П р и м е р 3. Анализ яблочно-виноградного напитка, содержащего введенный патулин в концентрации 150 мкг/кг, по предлагаемому способу, включающему элюирование патулина с сорбента "силасорб амин" этиловым эфиром, хлороформом или этилацетатом в количестве 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 см³.

30 проб яблочно-виноградного напитка, содержащего введенный патулин в концентрации 150 мкг/кг, анализировали согласно описанию в примере 1, за исключением того, что с сорбента "силасорб амин" патулин элюировали 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 см³ этилового эфира, хлороформа или этилацетата. В качестве контроля использовали пробу, экстракт из которой не подвергали обработке с использованием сорбента "силасорб амин" (см. табл.2).

Обнаруживают, что этиловый эфир не полностью экстрагирует патулин с сорбента. Этилацетат и хлороформом элюируют патулин полностью, при этом в хлороформный элюат переходит значительно меньше ОМФ, чем в этилацетатный. Все 3 растворителя близки по полярности, причем хлороформ обладает промежуточный полярностью, поэтому апробация растворителей, менее молярных, чем этиловый эфир, и более полярных, чем этилацетат, нецелесообразна. Делается вывод о целесообразности элюирования патулина с сорбента "силасорб амин" хлороформом в количестве 35-40 см³.

П р и м е р 4. Анализ яблочного пюре, содержащего введенный патулин в концентрации 100 мкг/кг по предлагаемому способу.

В пробу яблочного пюре вводят такое количество патулина, чтобы его концентрация составила 100 мкг/кг. Пробу делят на 8 равных частей и проводят анализ в соответствии с примером 1. Получают следующие результаты анализа: 90, 85, 86, 87, 90, 83, 87 и 87 мкг/кг.

П р и м е р 5. Анализ яблочного пюре, содержащего введенный патулин в концентрации 100 мкг/кг, по способу-прототипу. В пробу яблочного пюре вводят такое количество патулина, чтобы его концентрация составила 100 мкг/кг. Пробу делят на 8 равных частей и проводят анализ в соответствии с примером 2. Получают следующие результаты анализа: 84, 83, 92, 78, 96, 93, 70 и 77 мкг/кг. Сравнение результатов анализов яблочного пюре, содержащего введенный патулин в концентрации 100 мкг/кг, с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа представлено в табл.3.

Способ-прототип характеризуется значительно большим значением стандартного отклонения и относительного стандартного отклонения, что позволяет сделать вывод о существенном повышении воспроизводимости результатов при использовании предлагаемого метода.

П р и м е р 6. Анализ виноградного сока, содержащего введенный патулин в концентрации 1,2,3,5,10,15 и 20 мкг/кг, по предлагаемому способу. Пробу виноградного сока делят на 8 равных частей, в которые добавляют патулин в таком количестве, чтобы его концентрация в соке составила 1,2,3,5,8,10,15 и 20 мкг/кг. Определение патулина проводят в соответствии с примером 1. Заданная чувствительность детектора соответствует отношению сигнал-шум 3:1. Патулин надежно определяется во всех частях пробы, кроме первой, где отношение сигнала патулина к шуму оказалось несколько меньше, чем 3:1. Делается вывод о невозможности достоверного (при уровне достоверности 95%) обнаружения патулина в концентрации ниже 2 мкг/кг.

П р и м е р 7. Анализ виноградного сока, содержащего введенный патулин в концентрации 1,2,3,5,8,10,15 и 20 мкг/кг, по способу-прототипу. Пробу виноградного сока делят на 8 равных частей, в которые добавляют патулин в таком количестве, чтобы его концентрация в соке составила 1,2,3,4,5,8,10,15 и 20 мкг/кг. Анализ проводят в соответствии с примером 2. Патулин надежно обнаруживается только в пpобе, где его концентрация была 10 мкг/кг.

Таким образом, сравнение способа-прототипа и предлагаемого способа показало, что их пределы обнаружения оказываются не ниже 10 и 2 мкг/кг соответственно. Сравнение способов определения патулина позволяет сделать заключение о том, что использование предлагаемого способа сокращает продолжительность анализа с 4 до 2,5 ч за счет замены ТСХ на ВЭЖХ, улучшает воспроизводимость результатов за счет замены процесса дериватизации ОМФ на его сорбцию сорбентом "силасорб амин", снижает предел обнаружения и повышает точность метода за счет замены визуальной оценки патулина на инструментальную при использовании метода ВЭЖХ.

Claims

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, предусматривающий отбор пробы, доведение значения ее рН до 1,0 - 1,5 путем введения концентрированной соляной кислоты, осаждение мешающих веществ гексациано-(П)-ферратом калия и уксусно-кислым цинком, фильтрацию, экстракцию этилацетатом, очистку экстракта от оксиметилфурфурола, элюирование с последующим хроматографическим определением патулина, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени, улучшения воспроизводимости результатов и снижения предела обнаружения, очистку экстракта от оксиметилфурфурола ведут на сорбенте "силасорб амин", при этом в качестве элюента используют хлороформ, а количественное определение патулина осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.