CN106908544A - 一种用于动物源样品中痕量f‑2毒素代谢分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于动物源样品中痕量F‑2毒素代谢分析的方法。该方法以十八烷基键合硅胶填充柱为分离柱，在线大体积进样富集；以三元混合试剂为流动相，采用恒流速等度洗脱方式，实现F‑2毒素及代谢组分的快速连续分离；联用荧光检测，在线测定分离组分，实现对动物样品中痕量F‑2毒素及代谢组分的在柱富集和痕量分析。本发明基于高效液相色谱技术，集成了在柱富集、等度洗脱和荧光检测等技术，用于动物样品中痕量F‑2毒素及代谢组分的快速分离、检测，流程简便、操作简单、灵敏度高。

Description

一种用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法。

背景技术

F-2毒素，又称玉米烯酮（ZEN），是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生的一类真菌毒素，常见于粮食及动物饲料中，可经饮用水和食物对动物健康造成影响，在动物所有食用的样品中不得检出。

关于F-2毒素的检测，国内外已建立了多种方法，主要为薄层色谱法、酶联免疫测定法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC），主要集中于F-2毒素单组分检测。AOAC于1995年发布了其官方的薄层色谱法（TLC）分析方法。在我国，1996年发布的行业标准“出口粮谷中赤霉烯酮检验方法”、2004年发布的国家标准“饲料中玉米赤霉烯酮的测定”以及2005年发布的国家标准“粮食卫生标准”均采用薄层色谱法。在免疫分析方面，基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法(ELISA），建立了玉米赤霉烯酮（ZEN）的ZEN-ELISA检测方法。在液相色谱技术方面，我国对ZEN检测的研究主要集中ZEN单组分特异性分析，国家标准“谷物中玉米赤霉烯酮的测定”中采用Vieam ZEN免疫亲和柱进行高效液相分析检测。

在F-2毒素代谢分析方面，目前主要应用液相色谱联用质谱分析技术，采用梯度洗脱分离方式，联用高分辨质谱或串联质谱（MS-MS），采用乙酸铵水溶液与乙腈/甲醇在一定的浓度梯度下洗脱，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，分离效果良好，但仪器要求较高。等度洗脱，流动相的组成比例和流速恒定不变，洗脱操作简单；荧光检测灵敏度较高，技术要求较低，二者的联用对于痕量F-2毒素的代谢分析具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，该方法基于高效液相色谱技术，集成了在柱富集、等度洗脱和荧光检测等技术，用于动物样品中痕量F-2毒素及代谢组分的快速分离、检测，流程简便、操作简单、灵敏度高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，以液相色谱分离柱对动物源样品提取净化液进行在柱连续进样富集，以甲醇-乙腈-水三元混合溶液为流动相，采用恒流等度洗脱和柱后荧光检测模式，连续分离检测动物样品中痕量F-2毒素及代谢组分，实现F-2毒素动物体内代谢反应的痕量分析。

所述F-2毒素代谢中的组分包括β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素。

所述的色谱分离柱为十八烷基键合硅胶填充柱；

所述的甲醇-乙腈-水三元混合溶液体积比为55：13：32；

所述的荧光检测模式的激发波长为274 nm、发射波长为440 nm。

所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，具体包括以下分析步骤：

所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，所述动物源样品为猪的肝脏、肌肉和血清。

所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，对于肝脏、肌肉组织样品分析的具体包括以下步骤：

（1）提取：取1g均质的组织样品，均匀搅碎，置放于10 mL离心管中，加入2.0 mL乙酸钠溶液、3.0 mL无水乙醚，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干；

残渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超声2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氢氧化钠溶液，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干，得固体备用；

（2）净化：在步骤（1）得到的固体中加入体积比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混匀后转入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，弃去；采用3.0ml甲醇洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干，残渣用体积比为1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，过滤，取滤液待测；

（3）在柱富集：以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在步骤（2）得到的滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL；

（4）等度洗脱分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测。

所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，对于血清样品分析的包括以下步骤：

（1）净化：取 1mL 血清样品于 10 mL 离心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀5min，3000r/min 离心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃离心管中，剩余残渣用 4.0 mL 乙酸乙酯分两次清洗，洗液转入玻璃离心管中，40℃水浴氮气吹干，残渣加 1.0 mL 流动相溶解，3000 r/min 离心 10min，取上清液过滤，滤液待测；

（2）在柱富集：以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在步骤（1）得到的滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL；

（3）等度洗脱分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测。

本发明的优点在于：

本发明集成了在柱富集、等度洗脱和荧光检测等技术，提出了一种用于动物样品中痕量F-2毒素及代谢组分的快速分离、灵敏检测的便捷的新技术。针对传统HPLC方法联用质谱分析虽然高分辨高灵敏，但是仪器复杂、操作技术要求高；常规紫外光谱检测简便，但检测灵敏度低，不适用于痕量F-2毒素的检测分析等问题，本发明引入在线大体积进样富集技术，通过在柱高压连续进样，通过调控有机相浓度，控制区带扩散，以实现F-2毒素及代谢组分的高效富集；以三元混合试剂为流动相，采用恒流速等度洗脱方式，实现F-2毒素及代谢组分的快速连续分离；并联用荧光检测，在线测定分离组分，实现对动物样品中痕量F-2毒素及代谢组分的在柱富集和痕量分析。本发明方法流程连续、高效，无需复杂的仪器装备，富集后荧光检测的灵敏度最低可达0.05 ng/mL，适用于痕量F-2毒素及代谢组分的痕量分析。

附图说明

图1为实施例1中连续进样富集后F-2毒素代谢组分检测限，1为β-玉米赤霉烯醇；

图2为实施例2中猪肌肉中F-2毒素及代谢组分分析，1为β-玉米赤霉烯醇，2为F-2毒素；

图3为实施例3中猪肝脏中F-2毒素及代谢组分分析，1为β-玉米赤霉烯醇，2为F-2毒素；

图4为实施例4中猪血清中F-2毒素及代谢组分分析，1为β-玉米赤霉烯醇，2为F-2毒素。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1：

以体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱，在柱连续进样200μL；以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定F-2毒素组分，实现对痕量F-2毒素的色谱等度洗脱-荧光检测，得到痕量β-玉米赤霉烯醇检出图，富集后荧光检测的灵敏度最低可达0.05 ng/mL（图1）。

实施例2：

取1g均质的猪肌肉样品，均匀搅碎，置放于10 mL离心管中，加入2.0 mL乙酸钠溶液、3.0 mL无水乙醚，4000r/min离心10min，上清液转移到另一离心管中；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干；残渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超声2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氢氧化钠溶液，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干，得固体备用。

在上述固体中加入体积比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混匀后转入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，弃去；采用3.0ml甲醇洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干，残渣用体积比为1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，过滤，取滤液待测。

以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在上述滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测，得到肌肉中F-2毒素及代谢组分分析谱图（图2）。

实施例3：

取1g均质的猪肝脏样品，均匀搅碎，置放于10 mL离心管中，加入2.0 mL乙酸钠溶液、3.0 mL无水乙醚，4000r/min离心10min，上清液转移到另一离心管中；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干；残渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超声2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氢氧化钠溶液，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干，得固体备用。

在上述固体中加入体积比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混匀后转入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，弃去；采用3.0ml甲醇洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干，残渣用体积比为1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，过滤，取滤液待测。

以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在上述滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测，得到肝脏中F-2毒素及代谢组分分析谱图（图3）。

实施例4：

取 1.0 mL 血清于 10 mL 离心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀 5min，3000r/min 离心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃离心管中，剩余残渣用 4.0 mL 乙酸乙酯分两次清洗，洗液转入玻璃离心管中，40℃水浴氮气吹干，残渣加 1.0 mL 流动相溶解，3000 r/min 离心 10min，取上清液过滤，滤液待测。

以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在上述滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测（图4）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：以反相色谱柱对动物样品提取净化液进行在柱连续进样富集，以甲醇-乙腈-水三元混合溶液为流动相，采用恒流等度洗脱和柱后荧光检测模式，连续分离检测动物源样品中痕量F-2毒素及代谢组分，实现动物源样品中F-2毒素代谢组分的痕量分析。

2.根据权利要求1所述的用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：所述动物源样品中F-2毒素代谢组分包括F-2毒素、β-玉米赤霉烯醇。

3.根据权利要求1所述的用于动物源样品中F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：

所述的反相色谱柱为十八烷基键合硅胶填充柱；

所述的甲醇-乙腈-水三元混合溶液体积比为55：13：32；

所述的荧光检测模式的激发波长为274 nm、发射波长为440 nm。

4.根据权利要求1所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：所述动物源样品为猪的肝脏、肌肉和血清。

5.根据权利要求1所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：所述方法对于肝脏、肌肉组织样品分析的具体包括以下步骤：

（1）提取：取1g均质的组织样品，均匀搅碎，置放于10 mL离心管中，加入2.0 mL乙酸钠溶液、3.0 mL无水乙醚，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干；

残渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超声2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氢氧化钠溶液，4000r/min离心10min，转移上清液；重复提取一次；合并提取液，40℃下氮气吹干，得固体备用；

（2）净化：在步骤（1）得到的固体中加入体积比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混匀后转入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，弃去；采用3.0ml甲醇洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干，残渣用体积比为1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，过滤，取滤液待测；

（3）在柱富集：以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在步骤（2）得到的滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL；

（4）等度洗脱分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测。

6.根据权利要求1所述用于动物源样品中痕量F-2毒素代谢分析的方法，其特征在于：所述方法对于血清样品分析的具体包括以下步骤：

（1）净化：取 1mL 血清样品于 10 mL 离心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀5min，3000r/min 离心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃离心管中，剩余残渣用 4.0 mL 乙酸乙酯分两次清洗，洗液转入玻璃离心管中，40℃水浴氮气吹干，残渣加 1.0 mL 流动相溶解，3000 r/min 离心 10min，取上清液过滤，滤液待测；

（2）在柱富集：以十八烷基键合硅胶颗粒填充柱为分离柱；在步骤（1）得到的滤液中加入体积比1：3的乙腈-水混合溶液配制样品，在柱连续进样200μL；

（3）等度洗脱分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液为流动相，以流速为1.0 mL/min进行恒流等度洗脱；采用荧光检测方式，激发波长为274 nm、发射波长为440 nm，在线测定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素组分，实现对痕量F-2毒素代谢组分的色谱等度洗脱-荧光检测。