CN104458973A - 一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物在线富集及分离的方法，是利用毛细管电色谱技术，以十八烷基键合硅胶毛细管填充柱，或由乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱作为有机-硅胶杂化毛细管整体柱，在杂化毛细管整体柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，应用高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用，实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的在柱富集和多组分连续分离，从而实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的定量分析。本发明综合应用了毛细管柱在线富集、高压电场驱动和毛细管微流液相分离等多重作用，无需进行待测组分离线处理，流程连续、灵敏度高，可用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的痕量分析。

Description

一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物在线富集及分离的毛细管电色谱测定方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生的一类真菌毒素，主要包括β-玉米赤霉醇（β-ZOL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZAL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZAL）、玉米赤霉酮（ZAN）等，常见于粮食及动物组织中，可经饮用水和食物对人体健康造成影响，多国已禁止其用于动物食品，在所有食用的组织中不得检出。

关于玉米赤霉烯酮毒素的检测，国内外已建立了多种方法，主要为高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法（GC-MS）、液相色谱和质谱联用法（LC-MS）和ELISA方法。气相/液相色谱检测技术通常需要离柱富集，难于直接对痕量玉米赤霉烯酮毒素进行检测；质谱联用技术需要借助富集净化处理技术。固相柱萃取（SPE）、酶联免疫吸附萃取、搅拌吸附萃取等富集时间长，常规色谱在柱富集洗脱流程的压力衰减梯度大、容易产生区带展宽，对于含量极低的玉米赤霉烯酮毒素的分析而言，损失误差大，难以实现准确检测。另外，由于玉米赤霉烯酮毒素不带电荷，高效毛细管电泳方法对其分离不起作用。

毛细管电色谱（CEC），包括毛细管功能柱，作为新兴的分析技术，为高效分离提供了极好的契机。毛细管柱固定相结构稳定，洗脱柱压高、速度快，区带扩散效应小，具有分离快速、高效、高容量的特点，多面体低聚倍半硅氧烷作为一种新型立体结构的功能材料，拥有纳米孔笼状构型，吸附作用强、生物兼容性良好，对痕量样品在柱高效富集及连续分离具有明显优势；在CEC中，溶质运输不仅存在固定相和流动相间的分配作用，而且受到电渗流的驱动作用，其分离综合了高压电场驱动和微流液相分配的双重作用，有利于待测物质的在柱富集和连续分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物在线富集及分离的毛细管电色谱测定方法，该方法流程连续、高效，无需进行组分离线处理，灵敏度高，可用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的痕量自动化分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，是利用毛细管电色谱技术，以十八烷基键合硅胶毛细管填充柱，或由乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱制成有机-硅胶杂化毛细管整体柱，在所用的有机-硅胶杂化毛细管整体柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，在高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用下实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的在柱富集和多组分连续分离，从而实现对玉米赤霉烯酮及其代谢物的定量分析。

所述玉米赤霉烯酮及其代谢物包括玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮。

应用十八烷基键合硅胶毛细管填充柱进行分析的具体条件包括：以体积比11：89的乙腈、水混合溶液配制样品，进样体积300 μL；以体积比83：17的甲醇、乙酸铵-氨水缓冲溶液的混合溶液为流动相，分离电压-15kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min。

应用以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱进行分析的具体条件包括：以体积比为11：89的乙腈、水混合溶液配制样品，进样体积300 μL；以体积比90：10的甲醇、乙酸铵-氨水缓冲溶液的混合溶液为流动相，分离电压-18kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min。

所述乙酸铵-氨水缓冲溶液的pH值为7.50，其中乙酸铵的浓度为1.00 mmol/L。

所述以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱的制备方法包括以下步骤：

1）将乙烯基苄氯、笼型八乙烯基倍半硅氧烷、引发剂和致孔剂混合配制成聚合反应溶液，在氮气气氛中于室温下超声处理15 min；

2）在室温下将超声处理后的聚合反应溶液均匀注入乙烯基衍生化处理的石英毛细管，密封，在60℃条件下加热反应12小时；

3）将二氯乙烷以0.25 L/min的流速冲洗步骤2）得到的聚合物整体柱2小时，然后以0.25 L/min的流速通入过滤的、三氯化铁饱和的二氯乙烷溶液2小时，再以冰水冷却1小时，在80℃条件下加热连续反应2小时，得到所述聚合物整体柱。

按质量百分数之和为100%计，步骤1）所述聚合反应溶液中各组分的质量百分数为：乙烯基苄氯24%，笼型八乙烯基倍半硅氧烷6%，引发剂1%，致孔剂69%；

所述引发剂为偶氮二异丁腈；

所述致孔剂为甲苯和十二醇的混合物，其中甲苯占致孔剂重量的35%。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明将功能化的整体柱与CEC分离模式相结合，针对极性硅胶材料对玉米赤霉烯酮吸附容量小的问题，发展了玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线富集及连续分离的功能柱，即通过在毛细管柱中引入十八烷基键合固定相，对无机硅胶进行表面分子修饰，或以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂制备聚合物整体柱，并将三氯化铁催化剂通入上述聚合物整体柱，经均匀加热进一步引发深度交联反应，在毛细管柱内构筑高比表面积的微孔3D构型，以提高聚合固定相的吸附作用，提升痕量玉米赤霉烯酮毒素在柱富集的高效性。

（2）针对传统HPLC方法在柱富集分离洗脱过程中存在流动相压力梯度大、易产生区带展宽等问题，本发明引入CEC技术，通过在毛细管整体柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，综合应用高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用，减小柱内物理压力梯度变化幅度，控制区带扩散，以实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的高效分离。本发明方法流程连续、高效，无需进行组分离线处理，富集后紫外检测的灵敏度最低可达0.0005μg/mL，比不经富集的毛细管电色谱紫外检测的灵敏度提高了2个数量级以上，适用于痕量玉米赤霉烯酮及其代谢物的自动化分析。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1：

一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，是利用毛细管电色谱技术，以十八烷基键合硅胶毛细管填充柱进行分析，其方法具体为：采用乙腈-水=11：89（v/v）的溶液溶解样品，进样体积300 μL；在毛细管柱末端施加负电荷高压电场和进样端上施加液相泵辅助压力，以甲醇：乙酸铵-氨水缓冲溶液（1.00 mmol/L，pH 7.50）=83：17（v/v）为流动相，分离电压-15kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min，对玉米赤霉烯酮及其代谢物进行毛细管电色谱分离，洗脱峰依次为：β-玉米赤霉烯醇（β-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZOL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZAL）、玉米赤霉酮（ZAN）、玉米赤霉烯酮（ZEN）；富集后五种毒素连续分析的紫外检测灵敏度达到0.005μg/mL，比不经富集的毛细管电色谱紫外检测的灵敏度（0.2-0.5μg/mL）提高了2个数量级以上。

实施例2：

一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，是利用毛细管电色谱技术，以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱进行分析。

所述聚合物整体柱的制备方法包括以下步骤：

1）将乙烯基苄氯、笼型八乙烯基倍半硅氧烷、引发剂和致孔剂混合配制成聚合反应溶液，于氮气气氛中在室温下超声处理15 min；

2）在室温下将超声处理后的聚合反应溶液均匀注入乙烯基衍生化处理的石英毛细管，密封，在60℃条件下加热反应12小时；

3）将二氯乙烷以0.25 L/min的流速冲洗步骤2）得到的聚合整体柱，然后以0.25 L/min的流速通入过滤的、三氯化铁饱和的二氯乙烷溶液2小时，再以冰水冷却1小时，在80℃条件下加热连续反应2小时，得到所述聚合物整体柱。

按质量百分数之和为100%计，所述聚合反应溶液中各组分的质量百分数为：乙烯基苄氯24%，笼型八乙烯基倍半硅氧烷6%，引发剂1%，致孔剂69%；

所述引发剂为偶氮二异丁腈；

所述致孔剂为甲苯和十二醇的混合物，其中甲苯占致孔剂重量的35%。

其具体分析方法为：采用乙腈-水=11：89（v/v）的溶液溶解样品，进样体积300 μL；在毛细管柱末端施加负电荷高压电场和进样端上施加液相泵辅助压力，以甲醇：乙酸铵-氨水缓冲溶液（1.00 mmol/L，pH 7.50）=90：10（v/v）为流动相，分离电压-18kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min，对玉米赤霉烯酮及其代谢物进行毛细管电色谱分离，洗脱峰依次为：β-玉米赤霉烯醇（β-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZOL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZAL）、玉米赤霉酮（ZAN）、玉米赤霉烯酮（ZEN）；富集后单项（ZEN）紫外检测灵敏度达到0.0005μg/mL、五种毒素连续分析检测灵敏度达到0.001μg/mL，比不经富集的毛细管电色谱紫外检测的灵敏度（0.2-0.5μg/mL）提高了2-3个数量级。

本发明针对极性硅胶材料对玉米赤霉烯酮吸附容量小，传统HPLC方法在柱富集分离洗脱过程中存在流动相压力梯度大、易产生区带展宽等问题，通过十八烷基有机相键合硅胶固定相毛细管功能柱、或由乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱制成有机-硅胶杂化毛细管整体柱，以构筑微孔高交联立体构型，改善毛细管柱固定相的吸附作用和溶质流通性，提升痕量玉米赤霉烯酮毒素的在柱富集高效性；并在功能化毛细管柱的基础上，建立了一种用于玉米赤霉烯酮及其代谢物连续分离的毛细管电色谱方法，在柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，综合应用高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用，实现高效富集和分离，富集后单项（ZEN）紫外检测灵敏度达到0.0005μg/mL、五种毒素连续分析检测灵敏度达到0.001μg/mL，比不经富集的毛细管电色谱法紫外检测的灵敏度（0.2-0.5μg/mL）提高了2-3个数量级。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1. 一种适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：利用毛细管电色谱技术，在有机-硅胶杂化毛细管整体柱上同时施加负电荷高压电场和液相泵辅助压力，在高压电场驱动和毛细管微流液相分配分离的双重作用下实现玉米赤霉烯酮及其代谢物的在柱富集和多组分连续分离，从而对玉米赤霉烯酮及其代谢物进行定量分析；

所述有机-硅胶杂化毛细管整体柱为十八烷基键合硅胶毛细管填充柱，或以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱。

2. 根据权利要求1所述适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：所述玉米赤霉烯酮及其代谢物包括玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮。

3. 根据权利要求1所述适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：应用十八烷基键合硅胶毛细管填充柱进行分析的具体条件包括：以体积比11：89的乙腈、水混合溶液配制样品，进样体积300 μL；以体积比83：17的甲醇、乙酸铵-氨水缓冲溶液的混合溶液为流动相，分离电压-15kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min；

所述乙酸铵-氨水缓冲溶液的pH值为7.50，其中乙酸铵的浓度为1.00 mmol/L。

4. 根据权利要求1所述适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：应用以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱进行分析的具体条件包括：以体积比为11：89的乙腈、水混合溶液配制样品，进样体积300 μL；以体积比90：10的甲醇、乙酸铵-氨水缓冲溶液的混合溶液为流动相，分离电压-18kV，液相泵辅助压力1000 psi，流速0.02 mL/min。

5. 根据权利要求1或4所述适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：所述以乙烯基苄氯为功能单体、笼型八乙烯基倍半硅氧烷为交联剂组成的聚合物整体柱的制备方法包括以下步骤：

1）将乙烯基苄氯、笼型八乙烯基倍半硅氧烷、引发剂和致孔剂混合配制成聚合反应溶液，在氮气气氛中于室温下超声处理15 min；

2）在室温下将超声处理后的聚合反应溶液均匀注入乙烯基衍生化处理的石英毛细管，密封，在60℃条件下加热反应12小时；

3）将二氯乙烷以0.25 L/min的流速冲洗步骤2）得到的聚合物整体柱2小时，然后以0.25 L/min的流速通入过滤的、三氯化铁饱和的二氯乙烷溶液2小时，再以冰水冷却1小时，在80℃条件下加热连续反应2小时，得到所述聚合物整体柱。

6. 根据权利要求5所述适用于玉米赤霉烯酮及其代谢物的在线测定方法，其特征在于：按质量百分数之和为100%计，步骤1）所述聚合反应溶液中各组分的质量百分数为：乙烯基苄氯24%，笼型八乙烯基倍半硅氧烷6%，引发剂1%，致孔剂69%；

所述引发剂为偶氮二异丁腈；

所述致孔剂为甲苯和十二醇的混合物，其中甲苯占致孔剂重量的35%。