CN108956822A - 一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法，其特征在于包括：将多个试验动物分成基础日粮阴性对照组、添加ZEN的基础日粮的阳性对照组以及添加ZEN和脱毒剂的实验组，喂食一个周期；分别采集阴性对照组、阳性对照组以及实验组中式样动物的血液，分离血清，并检测该血清中ZEN、α‑ZOL、β‑ZOL、α‑ZEL和β‑ZEL的含量；计算每个生物体C值＝c(ZEN)+c(α‑ZOL)+c(β‑ZOL)+c(α‑ZEL)+c(β‑ZEL)，c表示各个物质的浓度含量；根据统计学显著性检验结果判断，若实验组C值显著低于对照组C值，则判定脱毒剂在试验动物体内有明显脱毒效果；反之，则判定脱毒剂在试验动物体内无明显脱毒效果。本发明实施例的方法简便可行，避免了屠宰动物取内脏的弊端，可大大降低动物实验成本，利于推广。

Description

一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用生物标记物对玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种由镰刀菌次级代谢产生的雌激素类霉菌毒素，是世界上污染程度最广泛的霉菌毒素之一。ZEN对动物和人类都会产生危害，它能导致人或动物(特别是猪)的生殖系统紊乱，临床表现为雌激素过多症，给养殖业带来巨大的经济损失。据报道，全球超过25％的谷物不同程度地受到霉菌毒素污染。我国近年的调查结果显示，我国饲料和原料霉菌毒素超标的比例高达60％～70％以上。

目前，降低饲料中ZEN危害的方法主要有生物法(酶解和微生物发酵法等)、化学法(过氧化氢、臭氧和碳酸钠等)和物理法(清洗、高温、辐射和吸附剂法等)，虽然这些方法均能不同程度地缓解玉米赤霉烯酮污染产生的毒副作用，但是在工业化生产中，添加霉菌毒素脱毒剂是目前最直接、最具可操作性和可行性的方法。霉菌毒素脱毒剂是一类具有吸附霉菌毒素能力的饲料添加剂，能够在动物消化道内与饲料中的霉菌毒素相结合，从而达到减少动物胃肠道对霉菌毒素吸收，增加霉菌毒素通过粪便排出的目的。

目前市场上常用的霉菌毒素脱毒剂种类繁多，质量参差不齐，也无统一的国家或行业标准，迫切需要建立可靠的霉菌毒素脱毒剂脱毒效果评估方法，用于筛选真正有脱毒效果的脱毒剂种类。霉菌毒素脱毒剂脱毒效果的评价主要有体外法和体内法两种。体外法一般以水溶液或消化道模拟液为反应介质，测定脱毒剂对某种霉菌毒素的吸附率。体外法简单快速，但是体外实验不能完全模拟动物体内具有的复杂酶活性、pH值剧烈波动等特点的消化道环境，不能充分说明脱毒剂对霉菌毒素的吸附效果，因此需要与体内动物实验相结合，更合理的评价脱毒剂的安全性和作用效果。体内法通常采用动物生产性能、器官损伤程度、器官指数、血清免疫生化指标或组织中毒素残留等间接指标来评价脱毒剂脱毒效果。

人和动物血液、尿液、胆汁、乳汁和粪便中真菌毒素的原形及其代谢物作为真菌毒素生物标记物，可以通过测定其含量来评价人或动物暴露于真菌毒素的频率和水平。ZEN在动物体内的为代谢产物主要有ZEN、α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol,α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenol,β-ZOL)，α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol,α-ZEL)和β-玉米赤霉醇(β-Zearalanol,β-ZEL)。传统技术中，还没有将ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的组合作为生物标记物用于玉米赤霉烯酮脱毒剂产品体内有效性进行评价。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法，用以解决现有评价方法复杂、安全性和作用效果评价不合理、不够真实的缺陷。

为实现上述目的，本发明实施例提供一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法，其特征在于包括：

将多个试验动物分成基础日粮阴性对照组、添加ZEN的基础日粮的阳性对照组以及添加ZEN和脱毒剂的实验组，喂食一个周期；

分别采集阴性对照组、阳性对照组以及实验组中式样动物的血液，分离血清，并检测该血清中ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的含量；

计算每个生物体C值＝c(ZEN)+c(α-ZOL)+c(β-ZOL)+c(α-ZEL)+c(β-ZEL)，c表示各个物质的浓度含量；

根据统计学显著性检验结果判断，若实验组C值显著低于对照组C值，则判定脱毒剂在试验动物体内有明显脱毒效果；反之，则判定脱毒剂在试验动物体内无明显脱毒效果。

优选的，所述对照组饲喂基础日粮，所述阳性对照组基础日粮中添加1000±50μg/kg ZEN，所述实验组的基础日粮中添加1000±50μg/kg ZEN和质量分数为0.2％的玉米赤霉烯酮脱毒剂。

优选的，所述试验动物为猪。

优选的，所述一个周期为21天。

优选的，所述血液采集时的前一天下午停止对试验动物进行喂养，所述血液经过37℃水浴静置30min，转入离心机3000r/min离心10min，分离血清，并将所述血清低温保藏。

优选的，所述血清采用UHPLC-MS/MS法测定ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的浓度含量。

优选的，所述阳性对照组、阴性对照以及试验组中的试验动物数量为6-10只。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例利用ZEN及其代谢产物作为生物标记物用于评价玉米赤霉烯酮脱毒剂在动物体内的脱毒效果，此方法简便可行，避免了屠宰动物取内脏的弊端，可大大降低动物实验成本，利于推广，能够更加真实的反映玉米赤霉烯酮脱毒剂的脱毒效果。

附图说明

图1为本发明的实施例中试验动物血清中玉米赤霉烯酮生物标记物总浓度试验结果图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例提供一种利用生物标记物评价玉米赤霉烯酮脱毒剂在动物体内脱毒效果的方法，本实施例中，选择猪为试验动物。其具体包括以下步骤：

步骤1：动物模型的建立

其中，猪龄为3-5个月、体重30-40kg，胎次相同的属于杜长大三元杂交的后备母猪18只，将所选的试验猪随机分为三组，即：饲喂基础日粮的阴性对照组、饲喂添加1000±50μg/kg ZEN基础日粮的阳性对照组以及饲喂添加1000±50μg/kg ZEN和0.2％玉米赤霉烯酮脱毒剂A基础日粮的试验组，每组6只，每组个体体重间无显著性差异(p>0.05)；正式开始试验前先预试验一周，预试验期间所有组均饲喂基础日粮；正式试验饲喂周期为21天，期间猪可以自由采食和饮水，猪的管理和免疫按常规进行。

步骤2：收集动物的血清样本

在试验最后一天下午6点对母猪停止饲养，第2日早晨8点对试验猪进行前腔静脉采血8mL，37℃水浴静置30min，转入离心机3000r/min离心10min，分离血清，取得的血清标本编号后放入低温箱中暂存，所有血液标本12h内带回实验室，冻存于-80℃直至测定。

步骤3：检测血清样本中生物标记物的含量

对步骤2收集的血清样本采用UHPLC-MS/MS测定ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的含量。测定方法如下：

(1)样品酶解，取0.5mL血清样品，加入1.5mL 0.2mol/L的乙酸铵缓冲液(pH 5.2)和20μL葡萄糖醛苷酸/硫酸酯酶，37℃气浴震荡器中震荡过夜。

(2)样品净化，在酶解后的样品中加入6mL 0.1％甲酸乙腈，涡旋1min，置于4℃冰箱内冷藏20min，再加入0.4g氯化钠和1.2g无水硫酸镁，涡旋1min，8000r/min离心5min；静置1min，量取上层溶液4.5mL置于10mL具塞塑料离心管中，加入无水硫酸镁150mg和QuECHERs净化材料400mg(C18、PAS和A-AL按2:1:1的质量比混合均匀)，涡旋1min，5000r/min离心5min，取上清液过0.22μm尼龙微孔滤膜；精密量取滤液3.6mL置于10mL塑料离心管中，真空浓缩仪中60℃，1500r/min抽干，用0.3mL 0.1％甲酸水-乙腈(70:30，V/V)溶解残渣，过0.22μm尼龙微孔滤膜，取上清液进样分析。

(3)采用UHPLC-MS/MS测定血清样品中ZEN及其代谢产物含量，色谱条件：C18反相色谱柱(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)，柱温40℃，流速0.3mL/min，进样量3μL。

其中，流动相A为0.1％甲酸-0.5mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-甲醇；梯度洗脱程序如下：0-2min，95％A；2-4min，95％～80％A；4min-12min，80％～5％A；12-12.1min，5％～1％A；12.1-13min，1％A；13-13.5min，1％～95％A；13.5-14min，95％A(梯度洗脱中各百分含量均为体积百分含量)。

质谱条件：仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源电喷雾(ESI)负离子扫描模式，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂气和锥孔气均为N2，脱溶剂气流速为1000L/h，锥孔气流速为40L/h。质谱结果如表1所示。

表1ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的质谱参数如下：

注：*为定量离子。

(4)用空白血清样品提取液配制混合标准溶液，采用外标法对检测结果进行定量分析，检测结果如表1所示。

表1玉米赤霉烯酮生物标记物的含量检测结果。

注：“--”表示浓度低于仪器检测限，未检出

(5)进行玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果有效性结果判定，根据生物标记物检测结果，计算每个个体的C值，其中C＝c(ZEN)+c(α-ZOL)+c(β-ZOL)+c(α-ZEL)+c(β-ZEL)，c表示浓度含量，利用SSPS软件对实验组和阳性对照组的数据进行统计学显著性检验，判断实验组C值和阳性对照组C值是否有显著性差异，若实验组C值显著低于对照组C值(p<0.05)，则判定脱毒剂在体内有明显脱毒效果；反之，则判定脱毒剂在体内无明显脱毒效果。

如图1所示，本发明实施例的玉米赤霉烯酮脱毒剂A能够显著降低血清中玉米赤霉烯酮生物标记物的含量(p<0.05)，说明该脱霉剂在动物体内对玉米赤霉烯酮有明显脱毒效果。

本发明实施例通过一组生物标记物的检测和组合评价玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果，改进了现有评价方法采样复杂，检验周期长等缺陷。本发明实施例采用的血清样本，取材简单，易于标准化，利于推广，能够更加真实的反映玉米赤霉烯酮脱毒剂的脱毒效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种玉米赤霉烯酮脱毒剂体内脱毒效果的评价方法，其特征在于包括：

将多个试验动物分成基础日粮阴性对照组、添加ZEN的基础日粮的阳性对照组以及添加ZEN和脱毒剂的实验组，喂食一个周期；

分别采集阴性对照组、阳性对照组以及实验组中式样动物的血液，分离血清，并检测该血清中ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的含量；

计算每个生物体C值＝c(ZEN)+c(α-ZOL)+c(β-ZOL)+c(α-ZEL)+c(β-ZEL)，c表示各个物质的浓度含量；

根据统计学显著性检验结果判断，若实验组C值显著低于对照组C值，则判定脱毒剂在试验动物体内有明显脱毒效果；反之，则判定脱毒剂在试验动物体内无明显脱毒效果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述对照组饲喂基础日粮，所述阳性对照组基础日粮中添加1000±50μg/kg ZEN，所述实验组的基础日粮中添加1000±50μg/kg ZEN和质量分数为0.2％的玉米赤霉烯酮脱毒剂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述试验动物为猪。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述一个周期为21天。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述血液采集时的前一天下午停止对试验动物进行喂养，所述血液经过37℃水浴静置30min，转入离心机3000r/min离心10min，分离血清，并将所述血清低温保藏。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述血清采用UHPLC-MS/MS法测定ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZEL和β-ZEL的浓度含量。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，

所述阳性对照组、阴性对照以及试验组中的试验动物数量为6-10只。