CN104411833B - 应用maldi‑toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法 - Google Patents

应用maldi‑toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104411833B
CN104411833B CN201380034007.9A CN201380034007A CN104411833B CN 104411833 B CN104411833 B CN 104411833B CN 201380034007 A CN201380034007 A CN 201380034007A CN 104411833 B CN104411833 B CN 104411833B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
interest
purposes
kit
polysaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380034007.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104411833A (zh
Inventor
D.普兰
B.森迪德
Y.格拉德尔
N.弗朗索瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Lille 1 Sciences et Technologies
Universite Lille 2 Droit et Sante
Centre Hospitalier Universitaire de Lille CHU
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Lille 1 Sciences et Technologies
Universite Lille 2 Droit et Sante
Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Lille 1 Sciences et Technologies, Universite Lille 2 Droit et Sante, Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of CN104411833A publication Critical patent/CN104411833A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104411833B publication Critical patent/CN104411833B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G01N2333/40—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Candida
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/40—Monitoring or fighting invasive species
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及通过MALDI‑TOF质谱分析法用于侵染性真菌感染的体外诊断的方法。本发明包括：‑提供来自哺乳动物的生物液体样品，所述的生物样品，具体而言，包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或能与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖；‑处理具有生物液体的样品，以便提取所述的多糖和/或寡糖和/或单糖；‑利用MALDI‑TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖,寡糖和单糖的、至少一种所关注的化合物；‑推断，如果所关注的化合物存在于所述样品中，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。

Description

应用MALDI-TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断 方法
本发明涉及应用MALDI-TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法。本发明的方法还可以对包含于样品中的所关注的化合物进行定量，用作侵染性真菌感染检测的标记。
酵母，例如白色念珠菌(C.albicans)常存在于健康人的黏膜中，而通常不引起特异性的疾病或症状。当身体虚弱时，所述的酵母增殖并进入血液系统，在这样的情况下会产生侵染性或全身感染(systemic infection)。就白色念珠菌而言，40％的念珠菌血症(念珠菌血症，一种由白色念珠菌引起的真菌血症)对人类是致命的。侵染性真菌疾病(IFD)或侵染性真菌感染是常见的严重性入院疾病。尽管可以有效地进行治疗，但治疗成本的攀升使得医院不堪重负，IFD的发病率也没有下降趋势。传统的真菌学方法(分离/鉴定)存在缺陷，这是由于常常没有办法无风险地接触患者感染部位取样。对于近乎一半的IFD病例，血液培养为阴性。所谓的分子生物学方法(PCR)未能解决上述的问题。此外，已证实，早期引入基于诊断的抗真菌治疗影响患者的存活率。在传统真菌学的之外的或替代性的方法中，应用检测患者血清中的循环聚糖(即，含于感染患者血清中的聚糖)的方法已被临床医生所接受。可利用商业性的免疫试验检测这些来自微生物细胞(microcetes)的细胞壁的聚糖或其前体。Candida Antigen试验可检测分别来自念珠菌属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)的甘露聚糖和半乳甘露聚糖(galactamannans)。这些，例如牌的市售生化试剂盒可检测常见于念珠菌属和曲霉属(Aspergillus)的葡聚糖。
上述两种类型的试剂盒均包含多种不同的试剂和内标。由于需要对每个批次构建校准曲线导致试剂消耗增加，尤其是对于需检测血清的情况。对校准(calibration)的需要有时可能导致因财务原因(由于试剂不足)使研究无法进行。例如，很难用确定九孔校准的应用，并且需占用技术人员半天的时间试验一个血清。这些试验还需要特定程序化的自动分析仪并具备信息系统，这些都使得应当对所提出的请求作出及时应答时，基于单个患者的紧急实际应用复杂化。
因此，所有这些试验都对时间和试剂有特别的要求。此外，它们还产生一定数量干扰诊断的假阳性结果。尤其是在葡聚糖生化测定中，其受到存在的血红蛋白(收集时产生的溶血(haemolysed)血清)，或有患IFD风险的患者中常见的代谢异常(如，高甘油三酯血症，存在胆红素或低蛋白血症)的干扰。
结果，有若干次报道了假阳性致使患者以真菌以外生物的多重感染而入院重症监护。检测P-D-葡聚糖中假阳性反应的机制类型未知，因为还没有从分子水平将在这些患者血清中循环的物质表征出来。由于存在假阳性结果，一些无需任何治疗的患者接受了抗真菌抗生素的治疗，使其在院时间延长。对于同样也存在的假阴性结果，被解释成细菌感染而非真菌感染，因此对患者施用抗细菌抗生素，导致患者受到伤害甚至致命。
此外，试剂盒应用来自鲎的血液，鲎日益稀有，且目前无法对其进行饲养。因此，所用的鲎都是从自然界捕获的。从鲎获取血样然后将其释放，但是被释放的鲎中有15％不能存活。
本发明的一个目的在于提供一种新的体外诊断侵染性真菌感染的方法。
另一目的在于提供上述的体外方法，其更加可靠，并特别是一种有助于避免上述的假阴性和假阳性的方法。
本发明涉及用于由病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外方法。根据其特征，所述方法包括：
-提供由哺乳动物获得的并含有蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖的生物液体样品；
-处理所述样品，用于提取所述多糖和/或寡糖和/或单糖；-利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖、寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物。
-推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。
本发明人的贡献之一是表明可以通过MALDI-TOF质谱分析法检测复杂的生物液体中，存在选自糖类，特别是多糖、寡糖和单糖的化合物，所述化合物来源于病源性微生物、而非来自宿主哺乳动物。
本发明人的另一贡献在于，表明这一所关注的化合物是侵染性真菌感染诊断标记。通过MALDI-TOF质谱分析法获得的谱上的可见峰表示所关注化合物(标记)的存在。通过MALDI-TOF质谱分析法在生物液体中检测上述来源于病源性真菌微生物的化合物不是显而易见的。更不必说以所关注的化合物指示侵染性真菌感染。人们会以为所关注的化合物的量太少难于被检测出来，代表所述所关注化合物的信号隐藏于生物液体(特别是血清)中可见的数以千计的信号之中。而且糖类(多糖,寡糖和单糖)与生物液体中的脂质、蛋白质和盐形成复合物，因而难于被检测出来。
利用来自给定的病源性真菌微生物感染的哺乳动物的生物液体样品，通过例如重复本申请中所描述的实验方案，首次鉴定出代表所关注化合物之一的显著的峰，所述的化合物用于诊断由给定的微生物引起的侵染性真菌感染。
本发明的方法可以检测以上列出的所关注的化合物，而无需标记它们。
根据本发明的方法，可以利用MALDI-TOF质谱分析法检测同时存在的几种所关注的化合物，其中的一种属于多糖,寡糖或单糖。根据本发明，也可能所关注的全部化合物都是上述的糖类。
有益地，为了提取上述的所关注化合物，
-通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，解离包含于所述生物液体样品中的所述复合物；
-离心所述的样品，使上清与固体组分分离；
-回收上清；
-通过，尤其是反向色谱法，将包含于上清液中的所关注化合物与其他的残余蛋白质和残余脂质分离，通过，尤其是吸收色谱法(absorption chromatography)，使所关注化合物与所述的盐分离。
根据本发明，可以首先使得所关注的化合物与所述的盐分离，而后将其与残余的蛋白质和/或残余的脂质分离，或是以颠倒的次序进行上述操作。
有益地，为了解离所述的复合物，向所述样品中添加络合剂(complexing agent)，尤其是碱，具体而言如EDTA，将所述的混合物加热至沸腾，具体而言加热到100℃或以上且140℃或以下，特别是接近120℃。本领域技术人员可根据样品的大小、加热技术和盛样品的容器(recipient)调整加热时间。务必使样品整体达到沸腾。调整加热时间，勿使样品尤其是其中所包含的糖类降解。例如，加热时间在3分钟到7分钟之间。
本发明的方法极为实用，所用试剂价格低廉。就分析兼容性(analyticalcompatibility)而言，耗时(technical time)不长于应用任何现有的试剂盒所需时间。络合剂(如EDTA)与加热相结合可使生物液体中的复合物解离。具体而言，所述的络合剂能从依赖二价阳离子的凝集素释放糖类。
根据所使用的具体方法，先应用反向色谱法，之后使用吸收色谱法。
有益地，反向色谱法中使用含疏水相的柱，吸收色谱法中使用含活性碳的柱。所述的疏水柱可以是填充任意固相支持物的柱，其上连接，例如十八烷基(C18)。所述的支持物可以是聚合物(polymer)或多孔硅。这些柱的大小和体积根据待处理的血清体积而不同。
含活性碳的柱可包含等重的活性碳和Celite(硅藻土(diatomised earth))，其使得单糖和二糖从洗脱液中被回收，其他糖类留在柱中。
根据本发明，所述的所关注化合物的大小和分子量没有限制。所述的所关注化合物可以例如具有1000以下的m/z比。所述的所关注化合物可以是二糖，具体而言，m/z信号＝365的己糖二聚体。作为侵染性真菌感染标记的所关注化合物可以是，例如海藻糖。
有益地，所述的络合剂添加后，加入至少一种能降解所述多糖和/或寡糖的酶，进行化学处理以切断所述多糖和/或寡糖链，结果潜在地增加所述所关注化合物的量。
使用内切甘露糖苷酶(endomanosidase)可使得寡甘露糖苷(oligomanosides)游离出来，以便增强它们的质谱分析法(MALDI-TOF)信号的强度。对于此种情况也可以考虑诸如乙酸水解之类的化学处理。也可以对半乳甘露聚糖,葡聚糖甚至几丁质(真菌细胞壁的三种主要化合物)进行类似的处理，以从这些聚合物中释放短链。
由此，在甘露糖苷酶使循环中的甘露聚糖贡献信号后，来自三糖的信号强度增加。
这一分析过程可能通过外切糖苷酶的作用得以补充，其结果相反以信号消失为基础。由此，可以根据生物液体样品中存在的寡糖类型确定所涉及的病原体。
有益地，所述所关注化合物选自下述的单糖和寡糖。[N-乙酰-氨基葡萄糖β-(1,4)N-乙酰-氨基葡萄糖]n,其中，n是等于1，或大于1而小于或等于10的整数，包含2-10个单糖的寡糖，尤其是己糖寡聚体,具体而言己糖二聚体，葡聚糖，特别是[葡萄糖，β-(1,3)葡萄糖]n,[β-(1,6)葡萄糖，β-(1,6)葡萄糖]n型的葡聚糖，其中，n是等于1，或大于1而小于或等于10的整数，甘露聚糖，特别是[甘露糖，α-(1,2)甘露糖]n,[甘露糖，α-(1,3)甘露糖]n,[甘露糖，α-(1,6)甘露糖]n,[甘露糖，β-(1,2)甘露糖]n型的甘露聚糖，其中，n是等于1，或大于1而小于或等于10的整数，半乳甘露聚糖,半乳聚糖,阿拉伯半乳聚糖和葡糖醛酸木甘露聚糖(glucuronoxylomannans)。
根据使用本发明的具体方法，所关注化合物是由病源性真菌微生物产生的化合物，更特别地是海藻糖。
用作标记的所述的所关注化合物可以是己糖二聚体,尤其是海藻糖(m/z＝365)。已发现，此种类型的所关注化合物是病原体感染，尤其是白色念珠菌(Candida albicans)感染的良好标记。
所述的病源性真菌微生物可选自能够应答所述哺乳动物免疫系统作用产生海藻糖的病源性真菌微生物，念珠菌属的种(Candida spp.),尤其是白色念珠菌，曲霉属的种，镰孢属的种(Fusarium spp.)，丝孢酵母属的种(Trichosporon spp.)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),支顶饱菌属的种(Acremonium spp.),粗球孢子菌(Coccidioides immitis),荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum),申克氏孢子丝菌属(Sporothrix schenckii)和卡氏肺囊虫属(Pneumocystis jirovecii)。
有益地，所述病源性真菌微生物选自能够应答所述哺乳动物免疫系统作用产生海藻糖的、上述列出的病源性真菌微生物。
有益地，向所述样品中加入已知量的至少一种标准化合物，以便于将由所述给定的所关注化合物获得的信号与由所述标准化合物获得的信号相比较，由此确定所述样品中包含的所关注化合物的量。所述的标准化合物可以在处理前加入所述样品中，根据本发明，可以将具有接近于待分析的寡糖的m/z值的化合物用作标准化合物。据认为当m/z值属于某种间隔(所述所关注的化合物的m/z-5；所述所关注的化合物的m/z+5)或等于这一间隔的限度，为类似于所述所关注化合物的m/z值。
有益地，所述标准化合物在柱上的色谱表现与待检测的化合物的表现一致。其可以在加热阶段之后、流经两个柱子之前添加。所述的标准化合物不能是存在于生物液体中的化合物，无论是健康的还是病源性的。所述的标准化合物不能是易于被鉴定为细菌污染引起的。为了这些目的，有益地，利用可经放射性同位素标记的二糖或三糖。例如，用氘化的海藻糖(MW 2H海藻糖＝356+Na＝379)作为标准化合物。
根据另一种操作方法，确定来自给定的所关注化合物的信号的信号强度与遍在的内源信号的强度的比率，所述内源信号之前确定并可能特异于获取所述样品的生物液体的类型，由上述的结果可定量所述样品中包含的所关注化合物。
本发明人的另一贡献在于鉴定出了存在于全部血清样品中的恒定信号(所述遍在信号)，其可用于定量生物学液体类型中所述的所关注化合物。本领域技术人员可以通过实施MALDI-TOF分析若干给定的生物学液体类型的(优选地不受感染的或不被怀疑受到感染的)样品。所述的遍在信号是存在于所述液体类型全部样品中的恒定信号，并且上述的信号强度显示为由MALDI-TOF分析获得的光谱上的峰的高度。
因此，根据本发明，所述生物液体可以选自动脉或静脉血,血清，来自生殖器粘膜的液体,呼吸道的液体,具体而言，来自支气管肺泡灌洗,支气管抽吸,气管抽吸,咳痰,唾液的液体，用于收集皮肤和体被的液体,渗漏液,来自闭腔的液体，尤其是脑髓液，来自胃肠道或尿道的液体，以及来自研磨活检碎片的液体。
本发明还包括实施本发明的方法的试剂盒。根据一个具体实施方案，其包括：
-至少一种由能实施反向色谱法的固体疏水相组成的起始支持物；
-至少一种第二容器，其包含进料口，输出口，以及包含在进料口和输出口之间的粉末化活性碳填充物。
所述的填充物可根据本领域技术人员已知的原则，或根据Whistler and Durso,Journal of American Chemical Society,1950中所描述的，通过混合等量可商购的活性碳(硅藻土)来制备。
所述的固体疏水相可以相分离的形式存在并包含磁性材料，以便于在接触所述生物液体后通过磁石去除所述的固相。例如，所述疏水相可以是以疏水材料覆盖的、包含亚铁或磁性材料的多个珠子的形式。使所述分离形式的固体疏水相与生物液体样品相接触。可以将其混合。所述的珠子提供了大的接触表面积。接触了一段时间之后，用磁石去除所述的固体疏水相，例如，将磁石浸入所述生物液体和固体疏水相珠子的混合物中，所述的珠子黏附于磁石,使得经处理的生物液体容易地被分离。
根据另一个实施方案，所述的试剂盒还包含给定量的标准化合物，所述的标准化合物选自：可能经放射性同位素标记的单糖,二糖和三糖，尤其是氘化的海藻糖。
有益地，所述的试剂盒还包含给定量的、能与由生物液体中所包含的多糖和/或寡糖和/或单糖形成的复合物反应的酶。
包含可实施上述反向色谱法的固体疏水相的支持物可以是平板，孔，柱子，试管，或包含大量孔的平板。
填充固体活性碳的容器可以是与上述支持物的选自无关的孔，柱子，试管，或包含大量孔的平板。有益地，本发明的试剂盒还包含MALDI平板。
本发明还涉及所关注化合物在通过MALDI-TOF质谱分析法进行侵染性真菌感染体外诊断中的用途，所述的所关注化物选自多糖，寡糖和单糖，尤其是海藻糖。
在附有下文中的非-穷尽的实施例以及选自下述的附图的说明书描述中，本发明的特征，具体技术特征及其各种有益效果更加清晰明了，所述的附图为：
-图1a-1d分别示出根据本发明的方法通过由列于表I的G25,G32,G42和G49血清制备的MALD1平板分析获得的质谱(MALDI-TOF)，存在于血清样品中的化合物以峰(或信号)示于图谱上，图谱的X轴表示以峰的形式显示的所述化合物的m/z比率(以质量单位计-MU)，Y轴显示信号高度(峰高度)的强度，其相应于包含于所述样品中的化合物的量，以来自全部血清的遍在内源信号值为100％；和
-图2a其纵轴上所示的是，X轴上所示的表I所列血清样品中包含的甘露聚糖(ng/mL)的量，所述的数量由的白色念珠菌试剂盒获得；
-图2b示出表I的血清样品中所含的葡聚糖(ng/mL)的量，Y轴上示出葡聚糖的量，血清号于X轴上显示；所述的量是利用试剂盒测定的；
-图2c示出表I中每个样品所包含的己糖寡聚体(由两个己糖形成的寡聚体，详见下文)的量。Y轴上示出以遍在信号百分数计的上述寡聚体的量，所述的组示于X轴，所述的数量利用本发明的方法获得，表示由上述寡聚物获得的峰高度与遍在信号×100获得的峰高度之间的比率；
定义
根据本发明，所述的哺乳动物没有限制：其可以是人或任意其他的哺乳动物。由此，本发明可用于人类医药或兽类医药。
根据本发明，所述的寡糖和多糖定义为通过糖苷键彼此相连的单糖。所述的寡糖由2-10个单糖组成，所述的多糖由10个以上的单糖组成。
MALDI-TOF光谱仪是质谱仪，其中辅以激光解吸/电离作用的MALDI基质与TOF(飞行时间)质谱仪分析器相偶联。这种类型的仪器应用广泛，包括医院环境。
根据本发明，所关注化合物的存在由通过MALDI-TOF光谱测定法获得的质谱上的可见峰定义。本领域技术人员也可以在所述光谱上识别可见因而显著的峰。具体而言，根据本发明显著的峰表示为参照峰强度的1％或以上；有益地，3％或以上，或更有益地，至少等于参照峰强度的近5％。
根据本发明，术语“侵染性真菌感染”集合了由哺乳动物外周血中的酵母(mushrooms)引起的感染以及引起血液以及至少一种组织损伤的感染。如果是，例如白色念珠菌的感染，可能发生由酵母血管外血源性扩散引起的肝脏和肾损伤，术语“侵染性真菌感染”集合了念珠菌血症和侵染性念珠菌病。
根据本发明，所关注化合物的存在由通过MALDI-TOF光谱测定法获得的质谱上的可见峰定义。本领域技术人员也可以在所述光谱上识别可见因而显著的峰。具体而言，根据本发明显著的峰表示为参照峰强度的1％或以上；有益地，3％或以上，或更有益地，至少等于参照峰强度的近5％。
根据本发明，术语“侵染性真菌感染”集合了由哺乳动物外周血中的酵母(mushrooms)引起的感染以及引起血液以及至少一种组织损伤的感染。如果是，例如白色念珠菌的感染，可能发生由酵母血管外血源性扩散引起的肝脏和肾损伤，术语“侵染性真菌感染”集合了念珠菌血症和侵染性念珠菌病。
根据本发明，作为在宿主液体中病源性微生物的任意残留物质的、来自病源性真菌微生物的化合物，可自发地、或作为微生物本身或通过宿主酶解聚/降解结果释放。所述的所关注化合物可来源于，与来自病源性真菌微生物的糖蛋白或糖脂相偶联的多糖或聚糖。所述的所关注化合物可来源于病源性真菌微生物的细胞壁，或病源性真菌微生物细胞壁的降解产物，由所述病源性真菌微生物分泌的/排泄的化合物，或当所述微生物被宿主细胞破坏时由所述病源性真菌微生物表达并释放的化合物。也可能是来自受感染的哺乳动物和所述病源性真菌微生物之间的相互作用的化合物。
术语“病源性真菌微生物”指真菌(酵母)，其遗传机制使其多糖或寡糖序列不同于哺乳动物产生的那些多糖或寡糖，或以生理上不存在于它们机体中的量产生。
根据本发明，术语“生物液体”指来自活体生物，尤其是哺乳动物，更特别是人的任何液体，包含水，至少一种蛋白质和/或一种类型的液体和/或至少一种以离子，例如钠，钾，形式存在的矿物盐，所述的离子可以是金属离子。就本发明而言，盐定义为离子形式的矿物盐。
以下描述的实验，指由白色念珠菌引起的真菌感染，可由待研究的一种、两种或更多种病源性微生物人工感染哺乳动物制备。因而，下述的实验可用于确定适合用作有待研究的病源性微生物引起的侵染性真菌感染标记的所关注化合物，表征所述的所关注化合物，并确定它/它们与所述感染之间的关系。
实验部分
第一阶段:处理生物样品以检测聚糖，所述程序适用于血清。
-将300pL的试验样品加入到1.5ml无菌微试管中
-向每管中加入100μL的处理溶液(EDTA酸溶液)
-“涡旋”混合
-将用锁闭装置密封的微试管在加热器上，120℃下，6min
-移出所述试管，10,000g离心10min
-将上清(150μl)转移到1.5ml无菌微试管中
接下来，通过质谱分析法在上清中检测聚糖。该处理步骤释放/解离凝聚在凝块中的蛋白质复合物中的甘露聚糖和半乳甘露聚糖，所述的处理步骤不会改变葡聚糖(kit)的比色测量值，其所产生的结果与未经处理的样品所产生的结果一致。相比之下，这一处理步骤去除了由过多的蛋白质,甘油三酯,胆红素和/或血红蛋白造成的干扰。
第二阶段:在实施质谱分析法之前处理上清液以纯化并浓缩所述的寡糖
将100μL的上清置于固相提取(SPE)柱(ref SPE-C18:C18Sep-Pak柱体(Waters))(1体积)),(具有疏水填充物的一个柱)，所述的柱已用五倍体积的乙腈溶液(ANC)和水(75:25,vol/vol)预平衡，并经10倍体积的水洗过。在所收集的上清进入柱体后，用两倍体积的水漂洗，收集。所述的C18柱洗脱液置于含等重的商购活性碳和(当量体积)混合物SPE柱，所述的柱已用五倍体积的乙腈ANC/H20(25:75,vol/vol)溶液预平衡并经10倍体积的水洗过。所述体积的上清流入所述柱体后，用20倍体积的水漂洗所述的柱体，弃去洗脱液。所述的柱用2倍体积的乙腈ANC/H20(25:75,vol/vol)溶液漂洗。弃去第一个100μL，收集之后的300μL。干燥所述的洗脱液(ANC/H20)。
第三阶段:由质谱分析法分析寡糖
所用的质谱仪是MALDI-TOF Voyager Elite DES-TR分光光度计(PerspectiveBiosystems Framingham,MA)。将所述的干提取物溶于水，向1pL溶液中掺入1μL(10mg/ml，于ACN/H20 50/50中)二氢苯甲酸溶液。将1μL所述溶液存放于MALDI TOF板(不锈钢盘，96孔，环形)，于50℃结晶。所述的MALDI-TOF分析以正反射模式(positive reflectron mode)进行，所述的正反馈模式，利用具有1,000以下的m/z比率的中性寡糖优化的采集参数。采集数据后，通过观察生成的加合物(M+Na)+确定所述混合物中存在的寡聚葡萄糖。根据公式MHexn＝180+[162](n-1)+23计算用于诊断的、所关注的质量(M)。通过计算M Hexn信号，即遍在的内源信号的比率，或利用被加到第二阶段的第一相中的样品中的外标，计算分子组的相对定量(Relative quantification)。迄今为止，用于诊断的所关注的信号是M Hex2＝365。进一步给出的分析示例基于对365/361比率的计算。
人血清分析
将本发明的方法应用于来自Lille地方大学医院住院患者的12份血清，并基于下述原则进行筛选：
i)患者在住院期间曾患有全身性念珠菌病，经至少一种白色念珠菌血液培养证实；
ii)患者曾被要求进行血液葡聚糖或甘露聚糖检测，结果之一或两者为阳性，其曾指向或证实了，针对发现血液培养样品为阳性两周内或之前获取的血清样品的诊断；
iii)以合法理由，于-20℃储存一年的至少1mL剩余血清的可获得性。
以下的表I概括了利用抗原和试剂盒，由符合上述标准因而遭受IFD的12位患者的血清所获得的结果。血清样品甘露聚糖由 检测，葡聚糖由检测。
表I
将本发明的方法应用于上述血清样品。结果如图1a-1d以及2a-2c所示。如图1a-1d所示，对表I中实施了本发明的方法的血清G25,G32,G42和G49进行的MALDI平板分析显示，首先，全部血清给出相应于m/z质量＝361的高强度信号。这一信号表示未知的血清构成，并用于校准所述的信号强度。第二，在代表m/z比率＝365的位置，谱上可见以上全部血清的信号。该信号相应于己糖二聚体。由于该信号接近于上述的遍在信号，其可有效地用作标准校准信号。
此外，根据本发明的方法由从健康患者获取的血清(结果未显示)制备的MALDI平板谱不包含代表m/z比率＝365的信号，但包含如通过m/z比率＝361翻印的(reprinted)遍在标志。由此可以推断，所述的、以足以通过MALDI-TOF质谱仪检测的量存在的己糖二聚体，直接地或间接地来源于白色念珠菌病原体。
图2a-2c显示由商购试剂盒获得的结果，以及应用本发明的方法获得的结果。
以下的表II显示由应用本发明的方法获得的血清样品的定量结果。可认为本发明的方法相当于检测所述血清样品中存在的甘露聚糖、以及用于葡聚糖的方法。换言之，相应于上述己糖二聚体(m/z＝365)的信号可被认为至少表征所述血清样品中甘露聚糖和葡聚糖的存在。此外，值得注意的，对于患有葡聚糖血症和甘露聚糖血症两者的患者，相应于m/z＝365的峰高度与相应于m/z＝361的峰高度之比，与所检测的甘露聚糖和葡聚糖的量相关。对于两种商购检测均为阴性的血清G4，本发明的检测结果是阴性(在m/z＝365处无信号)。相比之下，对于在其中不能检测甘露聚糖、并且在其中所检测的葡聚糖水平极低或为0的患者G5,G6和G15，可鉴定出清晰的表示m/z比率＝365的信号。
表II
血清样品 (m/z＝365处的峰高度)/(m/z＝361x100处的峰高度)
G3 25
G4 0
G5 15
G6 10
G10 11
G12 30
G15 5
G21 35
G25 10
G32 33
G42 63
G49 20
因此本发明的方法可以通过检测由Platelia Candida albicans和Fungitell测试验证存在的物质，替代这些测试。另外，本发明的方法可以检测代表m/z＝365的信号，甚至是在经商购试剂盒检测没有发现包含葡聚糖和甘露聚糖的血清中检测上述信号。因此，本发明的方法比上述的商购试剂盒更灵敏，更可靠。所示的结果是由MALDI-TOF M/S装置以“反射”(“reflectron”)分析模式获得；MALDI-TOF“线性”分析模式获得相同的结果。
产生m/z＝365的所关注化合物的表征
为了确定由m/z峰＝365表示的、作为侵染性真菌感染诊断标记的所述所关注化合物的结构，将患侵染性念珠菌病患者的上清或血清全-甲基化(per-methylated)。以上述定义的阶段一和阶段二处理来自患侵染性念珠菌病患者的血清，结果，在第2阶段获得洗脱液中所含的糖，溶于水，而后全甲基化。所述的全甲基化技术是本领域技术人员已知的，并具体描述于下述的公开文献中：“Ciucanu I,Kerek F.1984.”A simple and rapid methodfor the per-methylation of carbohydrates.”Carbohydr Res.131:209-217”。然后，依照上述第三阶段所描述的方案制备MALDI平板，由全甲基化的糖获得的[M+Na]+信号显示m/z值＝477，其的确相应于全甲基化的己糖二糖。
依照上述的两个阶段处理已全甲基化的、来自患侵染性念珠菌病患者的血清，其显示色谱峰(火焰电离检测器气相色谱,FID-GC:Alltech ECONO-CAP EC-1,非极性毛细管柱)[30mx0.25mmx0.25μm]。运行时间＝28.8min，温度梯度180℃-330℃，相应于与甲基化海藻糖(αGlc1-1αGlc)的滞留时间(retention time)同一的滞留时间。GCEI/MS(与电子碰撞质谱相偶联的气相色谱,SGE SolGel-1ms[30mx0.25mmx0.25μm]，与用于来自患侵染性念珠菌病患者的血清的GC/FID相同的实验条件，依照最早的30个上述阶段进行处理，其已进行了全甲基化，显示与全甲基化海藻糖(αGlc1-1αGlc)相同的IEMS断片化谱(fragmentationspectrum)。在此基础上，可以得出结论，由MALDI-TOF质谱分析法鉴定的、由m/z＝365的信号所表示的所述所关注化合物是二糖，更具体而言是海藻糖。由此，这一所关注化合物用作侵染性真菌感染、特别是由白色念珠菌引起的侵染性感染的诊断标记。
确定所述的所关注化合物的真菌来源以及其与侵染性真菌感染的关系
体外实验
从根据Pluskota等(J Immunol.2008Sep 1；181(5):3609-19.)所述的方法接受了腹膜内注射巯基乙酸(thioglycolate)的小鼠的腹腔收集小鼠嗜中性粒细胞。注射后6小时通过二氧化碳吸入处死所述的小鼠，打开腹腔。利用5ml冰冻的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)灌洗腹腔，收集所述的粒细胞。
为了减少可能的巨噬细胞污染，将含有覆盖了胎牛血清的培养组织的培养皿置于含5％二氧化碳的空气的37℃培养箱中，培养所述的细胞1小时。从上清收集非黏附粒细胞，离心(2.250g，10min)，用血球计计数，然后重悬于Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS,购自Invitrogen Company,France)。利用右旋糖柠檬酸溶液(1体积的145M柠檬酸盐和7体积的2％右旋糖,pH＝4.6)从来自健康志愿者的血细胞分离人粒细胞。用Ficoll-Hypaque设备将其离心分离，然后在葡聚糖中使红细胞沉降，并低渗裂解残余的红细胞。
评估利用粒细胞破坏白色念珠菌
将来自白色念珠菌菌株SC5314的酵母(106单位)悬浮于0.25ml含0.1M HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-A/-2'-乙磺酸)的溶液中，pH7，1640rpm混合，而后与3X106的人粒细胞以1:3的比例混合。在37℃下温育所述的粒细胞酵母混合物，轻柔混合1到2小时。每30min移出300μL小份的所述混合物，用于检测相应于m/z＝365的所述的所关注化合物存在与否。在与上述相同的条件下，利用MALDI-TOF质谱分析法检测所述的所关注化合物。
大约2小时后，人和小鼠粒细胞均出现相应于所述所关注化合物m/z＝365的信号，证明所述的所关注化合物可能来源于白色念珠菌和所述粒细胞之间的相互作用，这是哺乳动物中防卫细胞抵抗真菌病原体的第一着。
小鼠体外实验
动物：
本申请中所描述的所有实验，使用雌性C57BL/6，6-8周龄的小鼠。全部的小鼠均由Charles River Laboratories(France)供给，全部的动物实验都是依照Lille大学地方医院动物实验道德委员会的规定实施，并符合用于实验或其他科学目的的动物保护EuropeanDirective 86/609/EEC的规定。
准备四组，每组10只小鼠。全部的小鼠组从实验开始日期D1开始饲养14天。在D＝14通过颈椎脱位杀死全部小鼠，经由心脏穿刺收集血液。在用于检测相应于m/z＝365的所述所关注化合物之前，来自这些血样的血清样品于-20℃下储存。
组0是对照组，即这一组的10只小鼠没有接受任何治疗。白色念珠菌并非天然地(正常地)定居(colonised)于所述的小鼠。
组1通过在第1天到第14天的饮用水中加入1.5％DSS(葡聚糖硫酸钠,MW 36-50kDa；MP Biomedicals,LLC,Germany)诱导了肠炎的组。白色念珠菌没有定居于该组。
组2中的小鼠在D1经口接受了含107单位白色念珠菌的200mL(QPS)。也通过在第1天到第14天的饮用水中加入1.5％DSS(葡聚糖硫酸钠,MW 36-50kDa；MP Biomedicals,LLC,Germany)在组2的小鼠中诱导了肠炎。施用引起肠炎的DSS导致所述的小鼠在其肠道中放任大量的酵母生长。该模型模拟的是广泛地定居有念珠菌的住院患者。这些患者接受了放疗或化疗，他们的肠壁受到损害。
组3的10只小鼠接受了静脉注射104单位的白色念珠菌，在D1包含于0.1ml无菌盐水中的菌株SC5314注入它们的尾静脉。该组模拟广泛性念珠菌血症,引起对小鼠致命的侵染性念珠菌病，代表住院患者的念珠菌血症(侵染性真菌感染)，若不进行治疗通常是致命的。
利用白色念珠菌试剂盒测试来自四组小鼠的血清中是否存在甘露聚糖。下述的表III显示上述组0到组3各组中存在的甘露聚糖的测定平均值。表III小鼠组0到组3指血清中所含的甘露聚糖浓度。
表III
小鼠组 血清中的平均甘露聚糖浓度(pg/mL)
0 <1000
1 2800
2 4200
3 8400
表III中的结果证明了，在没有患念珠菌血症的组3的小鼠中，白色念珠菌试验对于经定居的小鼠也显示阳性。
然后，检测来自每组小鼠的血清中是否存在相应于m/z＝365的所述的所关注化合物。应用与上述针对患者血清相同的实验方案。在来自组0、组1或组2的小鼠的血清中没有检测到代表所述的所关注化合物的m/z＝365信号；只有在经本发明的方法的前两阶段预处理的组3小鼠的各血清中，通过MALDI-TOF质谱分析法检测到了m/z＝365信号。结果，本发明的方法可靠地诊断了侵染性真菌感染，并将侵染性真菌感染与广泛性胃肠道定居化区分开来，这是上述的商购试剂盒不能做到的。

Claims (25)

1.选自多糖、寡糖和单糖的所关注的化合物在制备用于病原性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外诊断的试剂盒中的用途，其中，所述试剂盒用于以下方法：
-提供由哺乳动物获得的并含有蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖的生物液体样品；
-处理所述样品，用于提取所述多糖和/或寡糖和/或单糖；
-利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖、寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖、寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物；
-推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染，
其中，所述的所关注化合物是海藻糖，并且所述病源性真菌微生物是白色念珠菌。
2.权利要求1的用途，其中，为了从所述的生物样品提取所述的多糖和/或寡糖和/或单糖：
-通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，分离包含于所述生物液体样品中的所述复合物；
-离心所述的样品，使上清与固相分离；
-回收上清；
-通过反向色谱法将包含于上清液中的所述多糖和/或寡糖和/或单糖与残余蛋白质和残余脂质分离，并且通过吸收色谱法使所述的多糖和/或寡糖和/或单糖与所述的盐分离。
3.权利要求2的用途，其中，为了解离所述的复合物，向所述样品中添加络合剂并且将所述的混合物加热至沸腾。
4.权利要求3的用途，其中所述络合剂是碱。
5.权利要求3的用途，其中所述络合剂是EDTA。
6.权利要求3的用途，其中将所述的混合物加热至100℃和140℃之间的温度。
7.权利要求3的用途，其中将所述的混合物加热至接近120℃的温度。
8.权利要求2-7任一项的用途，其中，先进行反向色谱法，之后进行吸收色谱法。
9.权利要求1的用途，其中，含疏水相的柱用于反向色谱法，含活性碳的柱用于吸收色谱法。
10.权利要求1的用途，其特征在于，所述的所关注化合物具有1000以下的m/z比率。
11.权利要求1的用途，其中，加入至少一种易于作用于所述多糖和/或寡糖的酶，和/或进行化学处理，以切断由于所述复合物的分解所产生的所述多糖和/或寡糖链，结果潜在地增加所述所关注化合物的量。
12.权利要求1的用途，其中，向所述样品中加入已知量的至少一种标准化合物，以便于将由所述给定的所关注化合物获得的信号与由所述标准化合物获得的信号相比较，由此确定所述样品中包含的所关注化合物的量。
13.权利要求12的用途，其中，确定来自给定的所关注化合物的信号的强度与遍在的内源信号的强度的比率，所述内源信号之前确定并可能特异于获取所述样品的生物液体的类型，由上述的结果可定量所述样品中包含的所关注化合物。
14.权利要求1的用途，其中，所述的生物液体选自：动脉或静脉血、血清、生殖器粘膜的液体、和呼吸道的液体。
15.权利要求1的用途，其中，所述的生物液体选自：来自支气管肺泡灌洗、支气管抽吸、气管抽吸、咳痰、唾液的液体、用于收集皮肤和体被部分的液体、渗漏液和来自闭腔的液体。
16.权利要求1的用途，其中，所述的生物液体选自：脑髓液、来自胃肠道或尿道的液体，以及来自研磨活检碎片的液体。
17.能用于上述任一权利要求的用途中的试剂盒，其中，所述的试剂盒包括：
-至少一种包含能实施反向色谱法的固体疏水相的起始支持物；
-至少一种第二容器，其包含进料口、输出口、以及在进料口和输出口之间的固体活性碳填充物；
所述试剂盒还包含给定量的标准化合物，所述的标准化合物是海藻糖。
18.权利要求17的试剂盒，其中，所述的填充物通过混合等量活性碳和硅藻土来制备。
19.权利要求17或18的试剂盒，其中，所述的疏水固相以相分离的形式存在并包含磁性材料。
20.权利要求17的试剂盒，其中，所述的试剂盒还包含给定量的、能与生物液体中所包含的多糖和/或寡糖和/或单糖形成的复合物反应的酶。
21.权利要求17的试剂盒，其中，所述包含能实施反向色谱法的疏水固相的支持物以及包含所述活性碳填充物的容器，分别独立地选自下述：平板、孔、柱子和试管。
22.权利要求17的试剂盒，其中，所述的试剂盒还包含MALDI平板。
23.根据权利要求17的试剂盒，其中所述海藻糖是经放射性同位素标记的海藻糖。
24.根据权利要求17的试剂盒，其中所述海藻糖是氘化的海藻糖。
25.权利要求21的试剂，其中所述平板是包含大量孔的平板。
CN201380034007.9A 2012-06-26 2013-06-24 应用maldi‑toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法 Active CN104411833B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1201796 2012-06-26
FR12/01796 2012-06-26
PCT/FR2013/000158 WO2014001658A1 (fr) 2012-06-26 2013-06-24 Méthode de diagnostic in vitro d'une infection fongique invasive par spectrométrie de masse maldi-tof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104411833A CN104411833A (zh) 2015-03-11
CN104411833B true CN104411833B (zh) 2017-11-14

Family

ID=46889116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380034007.9A Active CN104411833B (zh) 2012-06-26 2013-06-24 应用maldi‑toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9360470B2 (zh)
EP (1) EP2877590B1 (zh)
JP (1) JP6254585B2 (zh)
CN (1) CN104411833B (zh)
DK (1) DK2877590T3 (zh)
ES (1) ES2577452T3 (zh)
HU (1) HUE028559T2 (zh)
PL (1) PL2877590T3 (zh)
PT (1) PT2877590E (zh)
WO (1) WO2014001658A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142501B (zh) * 2015-03-17 2020-06-05 北京毅新博创生物科技有限公司 全自动多肽提取飞行时间质谱检测仪
CN105866407A (zh) * 2016-04-22 2016-08-17 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
JP2019207106A (ja) * 2016-08-25 2019-12-05 日本たばこ産業株式会社 配糖体の分析方法
CN114414341A (zh) * 2022-01-25 2022-04-29 厦门元谱生物科技有限公司 一种血液培养报阳的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111627A2 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04237496A (ja) * 1991-01-17 1992-08-25 Mitsubishi Kasei Corp 環状イヌロオリゴ糖の製造方法
JP2000041693A (ja) * 1998-07-27 2000-02-15 Morinaga Milk Ind Co Ltd ガラクトオリゴ糖の製造方法
FR2818647B1 (fr) * 2000-12-21 2006-09-29 Pasteur Institut Glycopeptides immunogenes, criblage, preparation et applications
KR101066159B1 (ko) * 2002-12-26 2011-09-20 시오노기 앤드 컴파니, 리미티드 당 사슬-포착 분자로 당 사슬을 정제/농축하는 방법 및 당 사슬 구조의 분석법
DE602006017351D1 (de) 2005-03-31 2010-11-18 Inst Noguchi Analyseverfahren für biologische probe und screening-verfahren für krankheitsmarker
US8246832B2 (en) * 2005-05-25 2012-08-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fluidics device
JP2007145361A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Toray Ind Inc 納豆容器
WO2007118222A2 (en) 2006-04-06 2007-10-18 Ibis Biosciences, INC Compositions for the use in identification of fungi
PL1920781T3 (pl) * 2006-11-10 2015-06-30 Glycotope Gmbh Kompozycje zawierające core-1-dodatnie mikroorganizmy i ich zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce nowotworów
US20100003699A1 (en) * 2008-01-18 2010-01-07 Glykos Finland Ltd. Tissue carbohydrate compositions and analysis thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111627A2 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology;Antony Croxatto 等;《FEMS Microbiol Rev.》;20120331;第36卷(第2期);380-407 *
Chitin, Chitinase Responses, and Invasive Fungal Infections;Karina Vega 等;《International Journal of Microbiology》;20111211;第2012卷;1-10 *
Chromatographic separation of sugars on charcoal;R.WHISTLER 等;《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》;19500228;第72卷(第2期);677-679 *
Evaluation of the MALDI TOF-MS method for identification of Candida strains isolated from blood cultures;Yaman G.等;《Diagn Microbiol Infect Dis.》;20120531;第73卷(第1期);65-67 *
Standardized peptidome profiling of human urine by magnetic bead separation and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry;FIEDLER G.M.等;《CLINICAL CHEMISTRY》;20070301;第53卷(第3期);421-428 *
Update on the Laboratory Diagnosis of Invasive Fungal Infections;Brunella Posteraro 等;《Mediterr J Hematol Infect Dis.》;20110131;第3卷(第1期);e2011002 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2577452T3 (es) 2016-07-15
DK2877590T3 (en) 2016-07-04
EP2877590B1 (fr) 2016-05-18
US20150338391A1 (en) 2015-11-26
WO2014001658A8 (fr) 2014-06-05
JP2015526711A (ja) 2015-09-10
CN104411833A (zh) 2015-03-11
PL2877590T3 (pl) 2016-11-30
US9360470B2 (en) 2016-06-07
JP6254585B2 (ja) 2017-12-27
WO2014001658A1 (fr) 2014-01-03
HUE028559T2 (en) 2016-12-28
PT2877590E (pt) 2016-06-23
EP2877590A1 (fr) 2015-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104411833B (zh) 应用maldi‑toff质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法
CN107505295A (zh) 一种肝癌监测试剂盒及其使用方法
US20120208214A1 (en) Rapid saccharide biomarker assay
Sun et al. Characterization of ginsenoside extracts by delayed luminescence, high-performance liquid chromatography, and bioactivity tests
CN109884234A (zh) 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法
CN109771579A (zh) 正交实验法优化桦树茸与玉米须降糖成分提取工艺的方法
Iversen Phytohemagglutinin response of recirculating and non-recirculating rat lymphocytes
CN109187814A (zh) 一种鉴定肾移植预后生物标记物的方法及其检测试剂盒
CN105973888B (zh) 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒
Hu et al. Detection of hypoxic fractions in murine tumors by comet assay: comparison with other techniques
CN109280633A (zh) 纳米SiO2致肺细胞恶性转化的模型细胞株及其应用
Gimsing et al. Cobalamin forms in plasma and tissue during treatment of vitamin B12 deficiency
Liu et al. Flow cytometric scoring of micronucleated reticulocytes as a possible high‐throughput radiation biodosimeter
CN110221041A (zh) 利用发光蚯蚓进行重金属污染土壤生态毒性检测的方法
CN109212101A (zh) 一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒
CN109406656A (zh) 一种鉴定银屑病生物标记物的方法及其检测试剂盒
Harrison Vitamin B12 levels in erythrocytes in normal subjects and in pernicious anaemia
EP0175267A2 (en) Testing agent for neutrophil function
US20230030753A1 (en) Method for detecting short-chain fatty acids in biological sample
RU2235318C2 (ru) Способ оценки индивидуальной чувствительности организма к лекарственным препаратам
CN112089711A (zh) 一种游离脂肪酸在制备治疗前列腺癌药物中的应用
CN109212098A (zh) 一种鉴定肺炎生物标记物的方法及其检测试剂盒
RU2098824C1 (ru) Способ определения кишечных инфекций
RU2156465C1 (ru) Способ диагностики микогенной сенсибилизации
CN111638324A (zh) 一种冠心病诊断生物标记物组合及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant