PT2877590E - Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa taldi-tof - Google Patents

Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa taldi-tof Download PDF

Info

Publication number
PT2877590E
PT2877590E PT137565248T PT13756524T PT2877590E PT 2877590 E PT2877590 E PT 2877590E PT 137565248 T PT137565248 T PT 137565248T PT 13756524 T PT13756524 T PT 13756524T PT 2877590 E PT2877590 E PT 2877590E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
compound
interest
sample
oligosaccharides
polysaccharides
Prior art date
Application number
PT137565248T
Other languages
English (en)
Inventor
Poulain Daniel
Sendid Boualem
Francois Nadine
Guerardel Yann
Original Assignee
Centre Nat De La Rech Scient (Cnrs)
Centre Hospitalier Regional Univ Lille
Université de Droit et Santé de Lille
Universitã Sciences Tech Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Nat De La Rech Scient (Cnrs), Centre Hospitalier Regional Univ Lille, Université de Droit et Santé de Lille, Universitã Sciences Tech Lille filed Critical Centre Nat De La Rech Scient (Cnrs)
Publication of PT2877590E publication Critical patent/PT2877590E/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G01N2333/40—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Candida
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/40—Monitoring or fighting invasive species
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE UMA INFEÇÃO FÚNGICA INVASIVA POR ESPECTROMETRIA DE MASSA TALDI-TOF"
Este invento refere-se a um método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa MALDI-TOF. 0 método do invento permite igualmente, a quantificação de um composto de interesse contido numa amostra e utilizado como marcador para o diagnóstico de uma infeção fúngica invasiva. As leveduras como C. albicans estão frequentemente presentes nas mucosas dos indivíduos sãos nos quais não provocam habitualmente nenhuma doença ou sintoma particular. Quando o organismo está debilitado as leveduras proliferam e passam para o sistema sanguíneo: fala-se então de uma infeção invasiva ou sistémica. No caso de C. albicans, 40% da candidemias (fungemias provocadas por C. albicans) são fatais no Homem. As doenças fúngicas invasivas (MFI) ou infeções fúngicas invasivas são afeções frequentes e graves em meio hospitalar. Apesar das terapêuticas eficazes, cujo custo constitui uma carga suplementar e cada vez mais difícil de suportar nos hospitais, a morbi-mortalidade das MFI não decresce. Os métodos micológicos convencionais (isolamento, identificação) estão frequentemente em defeito dado que o acesso, sem risco para o doente, aos locais de infeção localizados com o fim de recolher o fungo é frequentemente impossível. Por outro lado, as hemoculturas são negativas em perto de metade dos casos de MFI. Os métodos designados de biologia molecular (PCR) não resolvem estes problemas. Além disso, foi finalmente estabelecido que a precocidade da realização do tratamento fúngico - com base no diagnóstico - condiciona a sobrevivência do doente. Entre os métodos de diagnóstico complementares ou alternativos à micologia convencional, a utilidade dos métodos de deteção de glicanos circulantes (ou seja os glicanos fúngicos contidos no soro dos doentes infetados) nos soros dos doentes é agora reconhecida pelos clínicos. Estes glicanos provêm da parede dos micromicetas ou dos seus precursores e podem ser detetados por testes imunológicos comerciais. Assim, o kit Platelia® Candida Antigen permite detetar os mananos e os galactomananos provenientes, respetivamente, de Candida e de Aspergillus. Os kits dos testes bioquímicos, tais como o comercializado sob a designação da marca Fungitell®, por exemplo, permitem detetar os glucanos comuns aos Candida e aos Aspergillus.
Cada "kit" destes dois tipos atrás citados compreende numerosos reagentes e padrões internos diferentes. A necessidade de realizar as curvas de calibração para cada série conduz a um consumo acrescido de reagentes normalmente destinados para testar soros. Esta necessária normalização pode, por vezes, conduzir a refazer exames por razões económicas (falta de uma quantidade suficiente de reagentes) . É, por exemplo, difícil, no que se refere ao Fungitell®, justificar a utilização de 9 poços para a normalização e a monopolização de um agente técnico durante meio dia para testar um soro. Estes testes necessitam igualmente do acesso a autómatos programados especifi-camente e apresentam interfaces com o sistema informático o que complica ainda mars a sua prática unitária na urgência quando deveriam estar a ponto de responder com a maior brevidade em relação à sua prescrição.
Todos estes testes são particularmente onerosos em tempo e/ou em reagentes. Além disso, existe sempre um certo número de falsos positivos que perturbam o diagnóstico. Isto é particularmente verdade para as dosagens de glucano(s) por via bioquímica que são perturbados pela presença de hemoglobina (soros hemolisados na altura da sua recolha) ou de perturbações metabólicas frequentes nos doentes com risco de MFI, tais como uma hipertrigliceride-mia, a presença de bilirrubina ou de uma hiperproteinemia. Finalmente, a presença de falsos positivos nos doentes hospitalizados em reanimação e pluri-infetados por outros germes que não os fungos foi relatada de várias maneiras. A natureza dos mecanismos que conduzem a esta falsa posi-tividade da deteção dos β-D-glucanos continua desconhecida pela falta de caracterização molecular dos produtos que circulam nos soros destes doentes. Devido à presença destes falsos positivos, certos doentes que não necessitariam de nenhum tratamento veêm-se a administrar uma antibioterapia antifúngica que prolonga a sua estadia no hospital. No caso dos falsos negativos que também existem, considera-se que não há infeção fúngica mas uma infeção bacteriana; o doente vê-se assim a administrar uma antibioterapia antibacteriana que é nefasta para ele e que pode ser fatal.
Por outro lado, o kit Fungitell® utiliza sangue de limulo, um animal que começa a ser raro. Com efeito, atualmente é impossível criar limulos. Os limulos são assim capturados no seu meio natural. Recolhe-se uma fração do seu sangue antes de os libertar. Quinze por cento dos limulos libertados não sobrevivem.
Um objetivo do presente invento é o de propor um novo método in vitro de diagnóstico de uma infeção fúngica invasiva.
Um outro objetivo é o de propor um método in vitro tal como o atrás citado que seja mais fiável, em particular, um método que permita evitar os falsos negativos e/ou os falsos positivos descritos previamente. 0 presente invento refere-se a um método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva provocada por um microorganismo fúngico patogénico, de acordo com a reivindicação 1.
Cada um dos documentos WO 2005/111627 A2, US 2010/003699 AI e MASS SPECTROMETRY LETTERS, vol. 2, n°3, 15 de setembro de 2011, páginas 61-64, XP055059988, ISSN 2233-4203 descreve um processo para diagnosticar uma doença e sobretudo o cancro, determinando a presença/ausência de biomarcadores glicanos numa amostra de líquido biológico através da espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Mas deve notar-se que os biomarcadores detetados na técnica anterior são provenientes do indivíduo a examinar e são por isso endógenos.
Um mérito dos inventores é assim o de ter podido mostrar que era possível, através de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF, detetar, num líquido biológico complexo, a presença de um composto escolhido de entre os açúcares, em partiular os polissacáridos, os oligossa-cáridos e os monossacáridos que provêm do microorganismo patogénico e não do mamífero hospedeiro. Um outro mérito dos inventores é o de ter demonstrado que este composto de interesse demonstra ser um marcador para o diagnóstico das infeções fúngicas invasivas. A presença do composto de interesse (marcador) corresponde a um pico visível no espectro obtido pela espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Não era evidente, com efeito, que um composto tal como o anteriormente citado proveniente de um microorganismo fúngico patogénico pudesse ser detetado por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF num líquido biológico. Era ainda menos evidente que este composto de interesse pudesse indicar uma infeção fúngica invasiva. Com efeito, poderia pensar-se que a quantidade do composto de interesse seria muito baixa para ser detetada ou que o sinal correspondente a este composto de interesse seria mascarado pelos milhares de sinais que podem ser observados num meio biológico, nomeadamente sérico. Além disso, os açúcares (polissacáridos, oligossacáridos e monossacáridos) formam, nos líquidos biológicos, complexos com os lípidos, proteínas e sais e são assim dificilmente detetáveis. 0 ou os picos significativos e correspondendo a um ou aos compostos de interesse que permite(m) diagnosticar uma infeção fúngica invasiva causada por um dado microorganismo são previamente colocados em evidência reproduzindo, por exemplo, o protocolo experimental descrito no presente pedido com amostras de liquido biológico proveniente de mamíferos infetados pelo ou pelos dado(s) microorganismo(s) fúngico(s) patogénico(s). 0 método do invento permite detetar os compostos de interesse tais como os atrás citados sem necessitar de os marcar. É possível, de acordo com o método do invento detetar por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF a presença simultânea de vários compostos de interesse de entre os quais pelo um faz parte de polissacáridos, oligossacáridos ou monossacáridos. Todos os compostos de interesse podem igualmente, de acordo com o invento, ser açúcares tais como os atrás citados. Com vantagem, para extrair o referido composto de interesse, dissociam-se os referidos complexos contidos na referida amostra de líquido biológico por precipitação/coagulação da maioria das referidas proteínas e/ou referidos lípidos; - centrifuga-se a referida amostra e separa-se ο sobrenadante da fração sólida; - recupera-se o sobrenadante; separa-se o referido composto de interesse contido no sobrenadante, as eventuais proteínas residuais e os eventuais lípidos residuais, nomeadamente, por croma-tografia de fase inversa e separa-se o referido composto de interesse dos referidos sais, nomeadamente realizando uma cromatografia de absorção.
De acordo com o invento, é possível separar primeiro o composto de interesse dos sais e depois o separar de eventuais proteínas residuais e/ou lípidos residuais ou de efetuar estas duas etapas por ordem inversa.
Com vantagem, para dissociar os referidos complexos, junta-se um agente complexante à referida amostra, nomeadamente uma base, em particular EDTA, e aquece-se a referida mistura obtida, até à ebulição e em particular a uma temperatura superior ou igual a 100°C e inferior ou igual a 140°C e, nomeadamente, sensivelmente igual a 120°C. A duração do aquecimento pode ser ajustada por um especialista na matéria em função da dimensão da amostra, da técnica usada para o aquecimento e do recipiente contendo a amostra. A totalidade do volume da amostra deve ser levada até à ebulição. A duração do aquecimento é adaptada para não degradar a amostra, em particular os açúcares que contém. A título de exemplo, a duração do aquecimento está compreendida entre 3 e 7 minutos. 0 método do invento é particularmente robusto e com um custo muito baixo em matéria de reagentes; em termos de contibilidade analítica o tempo de técnico não é superior ao ligado à utilização dos kits existentes. 0 agente complexante, por exemplo o EDTA associado ao aquecimento permite dissociar os complexos existentes no líquido biológico bruto. 0 agente complexante permite nomeadamente libertar os açúcares das lectinas dependentes de catiões divalentes.
De acordo com uma forma de concretização particular, efetua-se primeiro a cromatografia em fase inversa e depois a cromatografia de absorção.
Com vantagem, utiliza-se uma coluna compreendendo uma fase sólida hidrófoba para a cromatografia inversa de uma coluna contendo carvão ativado para a cromatografia de absorção. A coluna hidrófoba pode ser uma coluna cheia com qualquer suporte sólido no qual estão enxertados, por exemplo, grupos do tipo octadecilo (C18). 0 suporte pode ser um polímero ou sílica porosa. A dimensão e o volume destas colunas são variáveis em função do volume de soro a tratar. A coluna contendo carvão ativado contém uma mistura em peso igual de carvão ativado e de celite® (terra de diatomáceas), o que permite recuperar no eluido os mono e dissacáridos, sendo os outros sacáridos retidos na coluna. A dimensão e a massa molar do composto de interesse não são limitadas de acordo com o invento. 0 composto de interesse pode, por exemplo, apresentar uma razão m/z inferior a 1000. O composto de interesse pode, por exemplo, ser um dissacárido, em particular um dimero de hexose correspondendo a um sinal de m/z=365. Este composto de interesse que é um marcador de uma infeção fúngica invasiva pode ser, por exemplo, a tre-halose.
Com vantagem, após juntar o referido agente complexante, adiciona-se, pelo menos, um enzima capaz de degradrar os polissacáridos e/ou os oligossacáridos e/ou efetua-se um tratamento quimico com o fim de cortar as cadeias dos referidos polissacáridos e/ou oligossacáridos, graças ao que se aumenta potencialmente a quantidade do referido composto de interesse. A utilização das endomanosidases permite libertar os oligomanósidos livres com o fim de aumentar a intensidade dos seus sinais em espectrometria de massa (MALDI-TOF). Um tratamento quimico, acetólise, por exemplo, pode igualmente ser previsto neste caso. É igualmente possivel agir da mesma form com os galactomananos, os glucanos, inclusivamente a quitina (três compostos maioritários no seio da parede fúngica) de modo a libertar as cadeias curtas a partir destes polímeros.
Assim, um aumento da intensidade do sinal de um trissacárido após manosidase permite atribuir o sinal aos mananos circulantes.
Este processo analítico pode-se completar com a ação de exoglicosidases para as quais as conclusões serão baseadas inversamente ao desaparecimento do sinal. Pode-se assim conseguir determinar o patogéneo implicado em função do tipo de oligossacáridos presentes na amostra do líquido biológico.
Com vantagem, o referido composto de interesse é escolhido de entre os monossacáridos e oligossacáridos seguintes: [N-acetil-glucosamina-β-(1,4)-N-acetil-glucosa-minajn em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10, compreendendo os oligossacáridos de 2 a 10 monossacáridos, nomeadamente os oligómeros de hexose, em particular os dímeros de hexose, os glucanos, nomeadamente os glucanos do tipo [glucose-β-(1,3)-glucose] n, [glucose-β-(1, 6)-glucose] n, em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10; os mananos, nomeadamente os mananos do tipo [manose-α-(1,2)-manoseln, [manose-α-(1,3)-manose]n/ [manose-α-(1,6)-mano-se] n, [manose-β-(1,2)-manose] n, em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10; os galactomananos, os galactanos, os arabinogalactanos e os glucuronoxilomananos.
De acordo com uma forma de concretização particular do método do invento, o composto de interesse é um composto produzido pelo microorganismo fúngico patogénico e, mais particularmente, a tre-halose. 0 composto de interesse gue serve de marcador pode ser um dimero de hexose, em particular a tre-halose (m/z = 365). Um tal tipo de composto de interesse revela-se ser um bom marcador de uma infeção por um patogéneo, em particular uma infeção por Candida albicans.
Os microorganismos fúngicos patogénicos podem ser escolhidos de entre os microorganismos fúngicos patogénicos capazes de produzir tre-halose sob a ação de um sistema imunitário do referido mamífero, Candida spp., em particular Candida albicans, Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenkii e Pneumocystis jirovecii.
Com vantagem, o microorganismo fúngico patogénico é escolhido de entre os microorganismos fúngicos patogénicos atrás citados que, sob a ação do sistema imunitário dos mamíferos, produzem tre-halose.
Com vantagem, adiciona-se à referida amostra uma quantidade conhecida de, pelo menos, um composto padrão, mediante o qual, comparando a intensidade do sinal obtido para o referido composto de interesse dado com o sinal obtido pelo referido composto padrão, pode-se determinar a dada quantidade do referido composto de interesse contido na referida amostra. 0 composto padrão pode ser adicionado à amostra, antes do tratamento deste. É possível, de acordo com o invento, utilizar como composto padrão compostos que apresentam valores de m/z próximos dos oligossacáridos a analisar. Considera-se que os valores de m/z que pertencem a um intervalo [m/z do composto de interesse -5; m/z do composto de interesse +5] ou são iguais aos limites deste intervalo estão próximos do valor de m/z do composto de interesse.
Com vantagem, o composto padrão apresenta um comportamento cromatográfico nas colunas utilizadas idêntico ao do composto a detetar. Neste caso, este pode ser adicionado após a etapa de aquecimento e antes da passagem nas duas colunas. 0 composto padrão não deve ser um composto presente nos líquidos biológicos, quer sejam sãos quer patológicos. 0 composto padrão não deve ser suscetível de ser identificado como resultado de contaminação microbiana. Utilizar-se-á nomeadamente com vantagem para estes fins dissacáridos ou trissacáridos, eventualmente, marcados com um radioisótopo. A tre-halose deuterada (MW 2H tre-halose = 356 + Na = 379) pode, por exemplo, ser utilizado como composto padrão.
De acordo com uma outra forma de concretização, determina-se a razão da intensidade do sinal correspondente ao dado composto de interesse em relação à intensidade de um sinal endógeno ubíquo, sendo o referido sinal endógeno previamente identificado e eventualmente específico do tipo de líquido biológico de onde provém a amostra, mediante o qual se pode quantificar o referido dado composto de interesse contido na referida amostra. É, com efeito, um outro mérito dos inventores ter identificado um sinal constante (o referido sinal ubíquo) presente em todas as amostras de soro que pode servir para a quantificação do composto de interesse neste tipo de líquido biológico. Os especialistas na matéria podem determinar facilmente um sinal ubíquo realizando a análise MALDI-TOF de várias amostras (preferencialmente não infetadas ou não suspeitas como tal) de um dado tipo de líquido biológico. 0 sinal ubíquo corresponde a um sinal constante encontrado para todas as amostras deste tipo de fluido. A intensidade do sinal tal como atrás citado corresponde à altura do pico que aparece no espectrograma obtido pela análise MALDI-TOF.
Deste modo, o invento, o líquido biológico pode ser escolhido de entre o sangue venoso e arterial, o soro, os líquidos das mucosas genitais, os líquidos das vias aéreas, nomeadamente o líquido proveniente da lavagem bronco-alveolar, de aspiração brônquica, de aspiração traqueal, de expectoração, os escarros, os líquidos que serviram para recolher fragmentos de pele e fâneros, os líquidos de efusão, os líquidos das cavidades fechadas, nomeadamente, o líquido cefalo-raquidiano, os líquidos do sistema digestivo ou urinário e os líquidos obtidos a partir de fragmentação de fragmentos de biópsia. 0 presente invento refere-se igualmente a um kit que permite a concretização do processo de acordo com a reivindicação 14. 0 enchimento pode ser preparado misturando uma quantidade igual de carvão ativado comercial e de Celite® (terra de diatomáceas) de acordo com um princípio bem conhecido pelos especialistas na matéria e descrito na publicação seguinte: Whistler and Durso, Journal of American Chemical Society, 1950. A fase sólida hidrófoba apresenta-se sob forma dividida e compreende um material magnético, graças ao qual é possível retirar a fase sólida com o auxílio de um íman após contacto com o referido líquido biológico. Os tais materiais são conhecidos do documento CLINICAL CHEMISTRY, vol. 53, n° 3, 1 de março de 2007, páginas 421-428, XP002505366, ISSN 0009-9147. Por exemplo, a fase sólida hidrófoba pode apresentar-se sob a forma de uma pluralidade de esferas contendo um material ferroso ou magnético e recobertas com um material hidrófobo. Mete-se em contacto a fase sólida hidrófoba sob forma dividida com a amostra de líquido biológico. Mistura-se eventualmente. As esferas apresentam uma grande superfície de contacto. Depois de um certo tempo de contacto, retira-se a fase sólida hidrófoba com um íman, mergulhando, por exemplo este último na mistura liquido biológico-esferas de fase sólida hidrófoba. As esferas aderem ao iman o que permite facilmente separar o líquido biológico tratado.
De acordo com uma outra forma de concretização, o kit compreende, além disso, uma dada quantidade de um composto padrão escolhido de entre os monossacáridos, os dissacáridos e os trissacáridos, eventualmente marcados com um isótopo radioativo, nomeadamente a tre-halose deuterada.
Com vantagem, o kit pode ainda compreender uma dada quantidade de um enzima apto a reagir com os complexos formados pelos polissacáridos e/ou os oligossacáridos e/ou monossacáridos contidos num líquido biológico. 0 suporte compreendendo uma fase sólida hidrófoba que permite a concretização de uma cromatografia de fase inversa atrás citada pode ser uma placa, um poço, uma coluna, um tubo, uma placa compreendendo uma pluralidade de poços. 0 recipiente contendo o enchimento de carvão ativado sólido pode ser um poço, uma coluna, um tubo, uma placa compreendendo uma pluralidade de poços, independentemente da escolha do atrás citado suporte.
Com vantagem, o kit de acordo com o invento compreende além disso uma placa MALDI. 0 presente invento refere-se igualmente à utilização de um composto de interesse escolhido de entre os polissacáridos, os oligossacáridos e os monossacáridos, em particular a tre-halose para o diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. 0 presente invento, as suas características, particularidades e diversas vantagens que apresenta tornar-se-ão mais evidentes com a leitura da descrição que se segue e que faz referência a um modo particular de concretização, apresenta a titulo de exemplo não limitativo e fazendo referência aos desenhos em anexo nos quais: - As Fig la a ld representam, respetivamente, os espectros de massa (MALDI-TOF) obtidos de acordo com o invento por análise das placas MALDI preparadas a partir dos soros G25, G32, G42 e G49 reportados na tabela I, um composto presente na amostra de soro é representado no espectro através de um pico (ou sinal), o eixo das abcissas do espectro indica a razão m/z (em unidades de massa m.u.) do composto representado pelo pico, o eixo das ordenadas indica a intensidade do sinal (altura do pico) que corresponde à quantidade de composto representado que está contido na amostra, sendo o valor de 100% atribuído a um sinal ubíquo endógeno em todos os soros; e A Fig. 2a representa no eixo vertical a quantidade de mananos (em ng/ml) contidos nas amostras de soros identificados na tabela I e que são registados nas abcissas, sendo a referida quantidade obtida por utilização do kit Platélia® Candida antigen; - A Fig. 2b representa a quantidade de glucanos (em ng/ml) contidos nas amostras de soros da tabela I, a quantidade de glucanos é registada no eixo das ordenadas enquanto que o número do soro é indicado em abcissas, sendo a referida quantidade medida através da utilização do kit Fungitell®; e - A Fig. 2c representa a quantidade de oligómeros de hexose (oligómero formado por duas hexoses mais amplamente explicitado aqui em baixo) contidos em cada uma das amostras da tabela I, a quantidade de oligómero atrás citado em % de sinal ubiquo é representada em ordenadas, os grupos são indicados em abcissas, sendo a referida quantidade obtida por utilização do processo do invento e correspondendo à razão da altura do pico obtido pelo oligómero atrás citado em relação à altura do pico obtido para o sinal ubiquo x 100;
Definições
De acordo com o invento, o mamifero não é limitado; pode tratar-se de um ser humano ou de qualquer outro mamifero. O presente invento encontra assim uma aplicação em medicina humana e em medicina veterinária.
De acordo com o invento, os oligossacáridos e os polissacáridos são definidos como sendo os polímeros de monossacáridos ligados entre eles por ligações glicosí-dicas. Os oligossacáridos são constituídos por 2 a 10 monossacáridos e os polissacáridos por mais de Io monossacáridos.
Um espectrómetro do tipo MALDI-TOF é um espec-trómetro de massa ligando uma fonte de ionização laser assistido por uma matriz (MALDI, MAtrix Assisted Laser Desorption/Ionisation) e um analisador de tempo de voo (TOF, time-of-flight mass spectrometry). Este tipo de aparelho é atualmente muito generalizado e existente no meio hospitalar.
De acordo com o invento, define-se a presença do composto de interesse pela presença de um pico visível no espectro de massa obtido por espectrometria MALDI-TOF. Os especialistas na matéria podem mesmo reconhecer num tal espectro a presença de um pico visível e assim significativo. Em particular, um pico significativo pode corresponder, de acordo com o invento, a um pico de intensidade superior ou igual a 1%, com vantagem superior ou igual a 3% e, mais vantajosamente, pelo menos, sensivelmente igual a 5% em relação à intensidade de um pico de referência.
De acordo com o invento, os termos "infeção fúngica invasiva" incluem as infeções que provocam a presença de leveduras (fungos) no sangue periférico do mamífero e as infeções que possam afetar o sangue e, pelo menos, um tecido. No caso de uma infeção por C. albicans, por exemplo, na qual pode dar origem a afeções hepáticas e renais que provêm de uma disseminação hematogénica e extravascular das leveduras, os termos "infeção fúngica invasiva" incluem a candidemia e a candidose invasiva.
De acordo com o invento, define-se um composto proveniente de um microorganismo fúngico patogénico como sendo qualquer resíduo de microorganismo fúngico patogénico presente nos líquidos biológicos do hospedeiro, espontaneamente libertado ou resultado da despolimerização/de-gradação pelo próprio microorganismo ou por ação dos enzimas do hospedeiro. Assim, o composto de interesse pode ser proveniente dos polissacáridos ou de ligações glicânicas de glicoproteínas ou de glicolípidos provenientes do microorganismo fúngico patogénico. 0 composto de interesse pode ser proveniente da parede do microorganismo fúngico patogénico, de um produto de degradação deste último, de um composto secretado/excretado por este último ou expresso por este último e libertado na altura da destruição do referido microorganismo por células do hospedeiro. Pode-se tratar de um composto que é proveniente de uma interação entre o sistema imunitário do mamífero infetado e o referido microorganismo fúngico patogénico.
Por "microorganismo fúngico patogénico" entendem-se os fungos (leveduras) cujo equipamento genético permite construir sequências polissacarídicas ou oligossacarídicas diferentes das sintetizadas pelos mamíferos ou produzi-los em quantidade não fisiologicamente presente nos seus organismos. Define-se, de acordo com o invento, pelos termos "liquido biológico" qualquer liquido proveniente de um organismo vivo, em particular de um mamífero e mais particularmente de um humano e contendo água, pelo menos, um tipo de proteína e/ou, pelo menos, um tipo de lípido e/ou, pelo menos, um tipo de sal mineral, presente sob a forma de ião, tal como, por exemplo, sódio, potássio, podendo o ião ser metálico. Define-se no seio do presente invento um sal como sendo um sal mineral sob a forma de ião.
As experiências decritas aqui a seguir com referência a uma infeção fúngica provocada por C. albicans podem ser reproduzidas com os mamíferos artificialmente infetados com um, dois ou vários microorganismos fúngicos patogénicos a estudar. As experiências a seguir podem então servir para determinar o ou os compostos de interesse aptos a servirem como marcador da infeção fúngica invasiva provocada pelo ou pelos microorganismos fúngicos patogénicos a estudar, para caracterizar o referido ou os referidos compostos de interesse e para conhecer a sua relação com a infeção.
Parte Experimental
Primeira etapa: Tratamento das amostras biológicas para a deteção de glicanos. Procedimento aplicado aos soros • Distribuir 300 μΐ das amostras a testar nos microtubos de 1,5 ml estéreis. • Adicionar 100 μΐ da solução de tratamento (solução ácida de EDTA) em cada tubo. • Homogeneizar com "vortex". • Colocar os microtubos fechados hermeticamente com grampos de pressão durante 6 min a 120°C num bloco de aquecimento. • Retirar os tubos e centrifugar 10 min a 10000 g· • O sobrenadante (150 μΐ) é transferido para um microtubo de 1,5 ml estéril.
Os tratamentos ulteriores para a detecção de glicanos por espectrometria de massa são efetuados no sobrenadante. Este tratamento liberta/dissocia os mananos e os galactomananos dos complexos proteicos coagulados no fundo; não altera em nada a dosagem colorimétrica do glucano (kit Fungitell®) para o qual dá resultados concordantes com a mesma amostra não tratada. Pelo contrário, este tratamento permite eliminar as interferências ligadas ao excesso de proteinas, de triglicéridos, de bilirrubina e/ou de hemoglobina.
Segunda etapa: Tratamento dos sobrenadantes para purificar e concentrar os oligossacáridos previamente à espectrometria de massa. 100 μΐ do sobrenadante é depositado num cartucho de Extração em Fase Sólida (SPE) (referência SPE-C18: C18 Sep-Pak cartridge (Waters)) (1 volume) (coluna com um enchimento hidrófobo), que foi previamente condicionado com 5 volumes de uma solução de acetonitrilo (ANC) e de água (75:25, vol/vol) e lavou-se com 10 volumes de água. Após a penetração do volume de sobrenadante recolhido no cartucho, este é enxaguado com 2 volumes de água que são recolhidos. O eluido da coluna C18 é colocado num cartucho SPE contendo uma mistura em peso igual de carvão ativado comercial e de Celite® (volume equivalente) previamente condicionado com 5 volumes de uma solução ANC/H20 (75:25, vol/vol) e depois enxaguado com 10 volumes de água. Após penetração do volume de sobrenadante no cartucho, este é enxaguado com vinte volumes de água. O eluido é rejeitado. A coluna é enxaguada com dois volumes de uma solução ANC/H20 (75:25, vol/vol). Os cem primeiros μΐ são rejeitados. Os 300 μΐ seguintes são recolhidos. O eluido (ANC/H20) é seco.
Terceira etapa: Análise dos oligossacáridos por espectrometria de massa. O espectrómetro de massa utilizado é um espectrómetro MALDI-TOF Voyager Elite DE-STR (Perspective Biosystems Framingham, MA). O eluido seco é solubilizado em água. 1 μΐ de solução é adicionado com 1 μΐ de uma solução de ácido di-hidrobenzóico (10 mg/ml em ACN/H20 50:50). 1 μΐ da solução é colocado numa placa MALDI-TOF (placa Applied Biosystems, aço inoxidável, 96 poços, circular) e crista- lizada a 50°C. A análise MALDI-TOF é realizada em modo reflectrão-positivo de acordo com parâmetros de aquisição de dados otimizados para a observação de oligossacáridos neutros apresentando uma razão m/z inferior a 1000. Após a aquisição dos dados, a presença dos oligoglucanos na mistura é estabelecida pelo observação dos aductos [M+Na]+ gerados. As massas (M) de interesse para o diagnóstico são calculados de acordo com a fórmula M Hexn = 180+[162]<n-d+23. A quantificação relativa das espécies moleculares efetua-se calculando a razão entre os sinais M Hexn, seja em relação a um sinal ubiquo endógeno, seja em relação a uma amostra externa introduzida na amostra na altura da primeira fase da segunda etapa. Até esta altura, o sinal que apresenta interesse para o diagnóstico é M Hex2 = 365. Os exemplos das análises apresentadas a seguir no texto são baseados no cálculo da razão dos sinais 365/361.
Análise de soros humanos O método do invento foi aplicado a 12 soros de doentes hospitalizados no CHRU de Lille e selecionados de acordo com os critérios seguintes: i) ter desenvolvido no decurso da sua hospitalização uma candidose sistémica provada por pelo menos uma hemocultura com C. albicans ii) ter beneficado da prescrição de um teste de deteção da glucanemia ou da mananemia que se tenha revelado positivo isoladamente ou conjuntamente e tendo orientado ou confirmado o diagnóstico num soro recolhido na semana precedente ou nas 2 semanas que se seguem à recolha para hemocultura e se tenham revelado positivo e iii) a disposição de um volume minimo de 1 ml de soro residual armazenado a -20°C durante um ano por razões legais A tabela I a seguir recapitula os resultados obtidos pela utilização de kits Platelia® Candida antigen e Fongitell® com os doze soros de doentes que respondem aos critérios atrás citados e portanto doentes com MFI.
Tabela I
0 método de acordo com o invento foi aplicado às amostras dos soros atrás citados. Os resultados são visíveis nas Fig. la a ld e nas Fig. 2a a 2c.
Como representado nas Fig. la a ld, a análise das placas MALDI realizadas a partir dos soros G25, G32, G42 e G49 da tabela I submetidas ao processo do invento mostram, por um lado, que existe um sinal de grande intensidade correspondente a uma massa m/z = 361 qualquer que seja o soro. Este sinal corresponde a um composto desconhecido do soro e serve de padrão de intensidade do sinal. Por outra parte, aparece um sinal no espectro de todos os soros atrás citados numa posição correspondente a uma razão m/z = 365. Este sinal corresponde a um dímero de hexose. Sendo este sinal próximo do sinal ubíquo atrás citado, pode este último ser efetivamente usado como sinal padrão.
Por outro lado, os espectros de placas MALDI preparadas de acordo com o processo do invento a partir de soros de doentes sãos (resultados não representados) não compreendem o sinal correspondente a uma razão m/z = 365 mas compreendem o sinal ubíquo correspondente a uma razão m/z = 361. Desde logo, é possível deduzir que o dímero de hexose que está em quantidade suficiente para ser detetável por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF é proveniente, diretamente ou não, do agente patogénico Candida albicans.
As Fig. 2a a 2c mostram os resultados obtidos com os kits comerciais e os resultados obtidos por utilização do processo de acordo com o invento. A tabela II embaixo agrupa os resultados quantitativos obtidos para as amostras de soro concretizando o método do invento. 0 método de acordo com o invento pode ser considerado como equivalente à deteção dos mananos presentes na amostra de soro assim como à dos glucanos. Noutros termos, o sinal correspondente ao dimero de hexose atrás citado (m/z = 365) pode ser considerado como sendo, pelo menos, característico da presença de mananos e de glucanos na amostra de soro relacionada. Além disso, notar-se-á que para os doentes que apresentam por sua vez uma glucanemia e uma mananemia, a razão da altura do pico correspondendo a m/z = 365 em relação à altura do pico correspondendo a m/z = 361 está relativamente correlacionada com a quantidade de mananos e de glucanos detetados. Para o soro G4, negativo com os dois testes comerciais, os resultados são negativos de acordo com o processo do invento (nenhum sinal com m/z = 365) . Ao contrário, para os doentes G5, G6, G15 para os quais não foi possível detetar mananos e para os quais as taxas de glucanos detetados eram muito fracas ou nulas, um sinal claro correspondente a uma razão m/z = 365 é identificável .
Tabela II
0 processo do invento pode assim substituir o Platelia® Candida Antigen e o Fungitell® detetando produtos cuja presença é concomitante com a positividade destes testes. Além disso, o processo de acordo com o invento permite detetar um sinal correspondente a m/z = 365 mesmo nos soros que, através dos kits comerciais se tinham demonstrado como sendo desprovidos de glucanos e de mananos. 0 processo do invento demonstra pois ser mais sensível e mais fiável que os atrás citados kits superficiais.
Os resultados apresentados foram adquiridos com um equipamento MALDI-TOF/MS em modo de análise do referido "refletrão". 0 modo de análise "linear" em MALDI-TOF/MS permite obter os mesmos resultados.
Caracterização do composto de interesse dando um sinal de m/z=365
Para determinar a estrutura do composto de interesse que serve de marcador para o diaqnóstico de uma infeção fúngica invasiva e correspondendo ao pico m/z=365, realizou-se a permetilação do sobrenadante dos soros dos doentes atingidos pela candidose invasiva. Os soros dos doentes atingidos por candidose invasiva são assim tratados de acordo com as etapas um e dois, definidas previamente. Efetua-se em seguida a permetilação dos açúcares contidos no eluido seco obtido como resultado da segunda etapa e solubiliza-se em água. A técnica de permetilação utilizada é conhecida pelos especialistas na matéria e descrita nomeadamente na publicação seguinte: "Ciucanu I, Kerek F. 1984. A simple and rapid method for the per methylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131: 209-217". Realizam-se em seguida placas MALDI conforme o protocolo descrito na terceira etapa atrás citada. O sinal [M+Na]+ obtido pelo açúcar permetilado aparece para um valor de m/z=477 o que corresponde bem a um dissacárido Hexose-Hexose permetilado.
Os soros dos doentes atingidos por candidose invasiva, tratados de acordo com as duas primeiras etapas atrás citadas e possuindo uma permetilação apresentando um pico cromatográfico (cromatografia em fase gasosa com detetor de ionização de chama CG-FID: coluna capilar apoiar Altech ECONO-CAP EC-1 [30 m x 0,25 mm x 0,25 pm]. Tempo de eluição = 28,8 min com um gradiente de temperatura de 180°c a 330°C) correspondendo a um tempo de retenção idêntico à da tre-halose (cxGlcl-laGlc) permetilada. A análise de GC/EI-MS (cromatografia em fase gasosa associada a um espectrómetro de massa de tipo impacto eletrónico, coluna SolGel-l-ms [30 m x 0,25 mm x 0,25 pm] . As condições experimentais idênticas às de GC/FID) dos soros dos doentes diagnosticados com uma candidose invasiva, tratados de acordo com as duas primeiras etapas atrás citadas e tendo sofrido uma permetilação apresentando um espectro de fragmentação EI-MS idêntico ao da tre-halose (aGlcl-laGlc) permetilada. Nesta base, conclui-se que o compsto de interesse detetado por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e correspondendo a um sinal de m/z=365 é um dissacárido e, mais particularmente, tre-halose. Este composto de interesse pode assim ser utilizado como marcador para o diagnóstico de uma infeção fúngica, mais particularmente de uma infeção provocada por C. albicans.
Determinação da origem fúngica do composto de interesse e da sua relação com uma infeção fúngica invasiva
Experiências in vitro
Granulócitos neutrófilos de rato foram recolhidos na cavidade abdominal de rato que recebeu uma injeção intraperitoneal de tioglicolato, de acordo com o método descrito por Pluskota et al. (J Immunol. 2008 Sep 1: 181(5): 3609-19). Seis horas após a injeção atrás citada, os ratos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono. A cavidade abdominal foi aberta e os granulócitos foram recolhidos por lavagem da cavidade abdominal com 5 ml de uma solução de PBS (solução tampão de fosfato salino) arrefecido em gelo. Para reduzir a possivel contaminação por macrófagos, as células foram cultivadas em caixas de Petri contendo tecido de cultura coberto com soro ovino fetal num incubador a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, durante uma hora. Os granulócitos não aderentes foram recolhidos a partir do sobrenadante, centrifugados durante 10 minutos a 2250 g), contados com um hematimetro e depois ressuspensos numa Solução Salina Equilibrada de Rank (HBSS, comercializada pela empresa Invitrogen, França). Os granulócitos humanos foram isolados das células sanguíneas de sangue de voluntários sãos com uma solução ácida de citrato de dextrose (1 volume de citrato 145 mM e 7 vol de dextrose a 2%, pH=4,6) . O isolamento foi realizado por centrifugação com um aparelho do tipo Ficoll-Hypaque, seguido por uma sedimentação de eritrócitos em dextrano e uma lise hipotónica dos eritrócitos residuais.
Avaliação da destruição de C. albicans pelos granulócitos
Leveduras (106 unidades) da estirpe SC5314 de C. albicans foram suspensas em 0,25 ml de solução contendo HEPES 0,1 M (ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N-2'-eta-nossulfónico), pH 7,8, mantidos sob agitação a 1640 rotações/min) e misturadas com 3xl06 granulócitos humanos com uma razão de 1:3. A mistura granulócitos-leveduras foi incubada a 37°C sob fraca agitação durante 1 a 2 horas. Todos os 30 minutos, um volume aliquota de 300 μΐ da mistura é recolhida e utilizada para detetar a presença ou não do composto de interesse correspondente a m/z=365. A detecção do composto de interesse atrás citado foi realizada por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF nas mesmas condições de atrás citadas.
Quer se trate de granulócitos humanos quer de murinos, o sinal correspondente ao composto de interesse m/z=365 aparece após cerca de duas horas o que prova que o composto de interesse é provavelmente obtido por interação entre a C. albicans e os granulócitos que são células da primeira linha de defesa dos mamíferos para com os agentes patogénicos fúngicos.
Experiências in vivo no rato
Animais: ratos fêmeas c57BL/6 com idades de 6 a 8 semanas foram utilizados para todas as experiências descritas no presente pedido de patente. Todos os ratos foram fornecidos pelos laboratórios Charles River Laboratories (França). Todas as experiências animais foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pelo comité técnico em experimentação animal do Centre Régional Hospitalier Universitaire de Lille e de acordo com a diretiva europeia (86/609/CEE) relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais ou para outros fins científicos.
Quatro grupos de 10 ratos cada um foram criados. Todos os grupos de ratos foram criados 14 dias a partir de j =1 que é o dia do início da experimentação. Em j = 14, todos os ratos são sacrificados por deslocação das vértebras cervicais. O seu sangue é recolhido por punção cardíaca. As amostras de soro foram realizadas a partir destas recolhas sanguíneas e armazenadas a -20°C antes da sua utilização para a detecção do composto de interesse correspondente a m/z=365. O grupo 0 é o grupo testemunha, ou seja, é composto por 10 ratos que não receberam nenhum tratamento. O rato não é naturalmente (normalmente) colonizado por C. albicans. O grupo 1 é o grupo dos ratos nos quais se induziu uma inflamação intestinal por adição de 1,5% de DSS (sulfato de sódio de dextrano, MW 36-50 kDa; MP Biomedicals, LLC, Alemanha) na água para beber dada do dia j=l a j = 14. Este grupo não é colonizado com C. albicans.
Os ratos do grupo 2 recebem por via oral, em j=l, 200 ml de (PBS) contendo 107 unidades de C. albicans. Uma inflamação intestinal é igualmente induzida nos ratos do grupo 2 por adição de 1,5% de DSS (sulfato de sódio de dextrano, MW 36-50 kDa; MP Biomedicals, LLC, Alemanha) na água para beber dada do dia j=l a j=14. A administração de DSS que provoca uma inflamação intestinal torna o rato permissivo ao estabelecimento de grandes quantidades de leveduras no seu tubo digestivo. Este modelo imita os doentes hospitalizados e fortemente colonizados pelos Candida. Trata-se de doentes submetidos a rádio ou quimioterapias e que apresentam uma alteração das paredes intestinais.
Os 10 ratos do grupo 3 recebem em j=l uma injeção intravenosa na veia da cauda de 104 unidades de C. albicans da estirpe SC5314 contidos em 0,1 ml de solução salina estéril. Este grupo imita uma candidemia massiva induzindo uma candidose invasiva, com resultado fatal nos ratos. Este modelo corresponde a uma candidemia (infeção fúngica invasiva) no doente hospitalizado cujo resultado é geralmente fatal na ausência de tratamento. A presença ou não de mananos nos soros dos quatro grupos de ratos foi testada com o kit Platelia® Candida antigen. A tabela III abaixo apresenta os valores médios das dosagens de mananos presentes nos soros de cada um dos grupos 0 a 3 atrás citados.
Tabela III
Os resultados da Tabela III provam que o teste Platelia® Candida antigen demonstra ser igualmente positivo no caso dos ratos colonizados mas que não são atingidos pela candidemia como é o caso do rato do grupo 3.
Detetou-se ou não em seguida a presença do composto de interesse correspondente a m/z=365 em cada um dos soros de rato de cada grupo. Foi utilizado o mesmo protocolo experimental que foi citado atrás com referência aos soros dos doentes. Nenhum sinal m/z=365 correspondente ao composto de interesse pode ser detetado nos soros dos ratos dos grupos 0, 1 e 2. Só pode ser detetado um sinal a m/z=365 por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF em cada um dos soros previamente tratados de acordo com as duas primeiras etapas do método do invento, o dos ratos do grupo 3. Resulta que o método do invento permite diagnosticar de maneira fiável uma infeção fúngica invasiva e diferenciar uma infeção fúngica invasiva de uma colonização massiva do trato digestivo o que não é o caso dos kits comerciais atrás citados.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva provocada por um microorganismo fúngico patogénico, catacterizado por: - se fornecer uma amostra de um liquido biológico proveniente de um mamifero, contendo o referido liquido biológico nomeadamente, proteinas e/ou lipidos e/ou sais e/ou polissacáridos e/ou oligossacáridos e/ou monossacáridos suscetíveis de formar complexos com as referidas proteínas e/ou lipidos e/ou sais; - se tratar a referida amostra de líquido biológico de maneira a extrair os referidos polissacáridos e/ou oligossacáridos e/ou monossacáridos; - se determinar por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF a presença ou não, de entre os referidos polissacáridos, oligossacáridos e/ou monossacáridos extraídos, pelo menos um dado composto de interesse proveniente do referido microorganismo fúngico e escolhido de entre os polissacáridos, os oligossacáridos e os monossacáridos; se deduzir que se o referido dado composto de interesse está presente na referida amostra, o referido mamífero está atingido por uma infeção fúngica invasiva.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por para extrair os referidos polissacáridos e/ou oligossacáridos e/ou monossacáridos da referida amostra biológica: - se dissociarem os referidos complexos contidos na referida amostra de liquido biológico por precipita- çao/coagulação da maioria das referidas proteínas e/ou dos referidos lípidos; - se centrifugar a referida amostra e se separar o sobrenadante da fração sólida; - se recuperar o sobrenadante; - se separarem os referidos polissacáridos e/ou oligossacáridos e/ou monossacáridos contidos no sobrenadante, de eventuais proteínas residuais e de eventuais lípidos residuais, nomeadamente, por cromato-grafia de fase inversa e se separarem os referidos polissacáridos e/ou oligossacáridos e/ou monossacáridos dos referidos sais, em particular, realizando uma cromatografia de absorção.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de para dissociar os referidos complexos, se juntar um agente complexante, nomeadamente uma base, em particular EDTA e se aquecer a referida mistura obtida até à ebulição e nomeadamente até uma temperatura compreendida entre 100°C e 140°C e, em particular, sensivelmente igual a 120°C.
  4. 4. Método de acordo com uma das reivindicações 2 e 3, caracterizada por se efetuar primeiro a cromato- grafia em fase inversa e depois a cromatografia de absorção.
  5. 5. Método de acordo com uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado por se utilizar uma coluna compreendendo uma fase sólida hidrófoba para a cromatografia de fase inversa e uma coluna contendo carvão ativado para a cromatografia de absorção.
  6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o referido composto de interesse apresentar uma razão m/z inferior a 1000.
  7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se juntar pelo menos um enzima suscetível de agir com os referidos complexos e/ou se efetuar um tratamento quimico com a finalidade de cortar as cadeias dos referidos polissacá-ridos e/ou oligossacáridos provenientes da dissociação dos referidos complexos, mediante o que se aumenta potencialmente a quantidade do referido composto de interesse.
  8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o referido composto de interesse ser escolhido de entre os monómeros e os oligómeros seguintes: [N-acetil-glucosamina-β-(1,4)-N-acetil-glucosamina]n em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10, as oses, compreendendo os oligossacáridos de 2 a 10 oses, nomeadamente os oligómeros de hexose, nomeadamente os dímeros de hexose, os glucanos, nomeadamente os glucanos do tipo [glucose-β-(1,3)-glucose]n, [glucose-β-(1,6)-glucose]n, em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10; os mananos, nomeadamente os mananos do tipo [manose-a-(1,2)-manose]n, [manose-α-(1,3)-manose]n, [manose-α- (1,6)-manose]n, [manose-β- (1,2) -manose] n, em que n é um número inteiro superior ou igual ale inferior ou igual a 10; os galactomananos, os galactanos, os arabinogalactanos e os glucuronoxilomananos.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido composto de interesse ser um composto produzido pelo referido microorganismo fúngico patogénico sob a ação do sistema imunitário do referido mamifero e nomeadamente a tre-halose.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o referido microorganismo fúngico patogénico ser escolhido de entre Candida spp., em particular Candida albicans, Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cere-visiae, Acremonium spp., Scedosporium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenkii e Pneumocystis j irovecii e os microorganismos fúngicos patogénicos que produzem tre-halose sob ação do sistema imunitário do referido mamifero.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se juntar à referida amostra uma quantidade conhecida de, pelo menos, um composto padrão, mediante o qual, comparando a intensidade do sinal obtido para o dado referido composto de interesse com o sinal obtido para o referido composto padrão, se pode determinar a quantidade do dado referido composto de interesse contido na referida amostra.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se determinar a razão da intensidade do sinal correspondente ao dado composto de interesse em relação à intensidade de um sinal endógeno ubiquo, sendo o referido sinal endógeno previamente identificado e eventualmente especifico do tipo de liquido biológico de onde provém a amostra, mediante o qual se pode quantificar o dado referido composto de interesse contido na referida amostra.
  13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o referido liquido biológico ser rescolhido de entre o sangue venoso e arterial, o soro, os líquidos das mucosas genitais, os líquidos das vias aéreas, nomeadamente o líquido proveniente da lavagem broncoalveolar, de aspiração brônquica, de aspiração traqueal, de expectoração, os escarros, os líquidos que serviram para recolher fragmentos de pele e fâneros, os líquidos de efusão, os líquidos das cavidades fechadas, nomeadamente, o líquido cefalo-raquidiano, os líquidos do sistema digestivo ou urinário e os líquidos obtidos a partir de fragmentação de fragmentos de biopsia.
  14. 14. Kit que permite a concretização do processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por compreender: - pelo menos um primeiro suporte compreendendo uma fase sólida hidrófoba permitindo a concretização de uma cromatografia em fase inversa; - pelo menos um segundo recipiente compreendendo uma abertura de entrada, uma abertura de saida e contendo um enchimento de carvão ativado sólido, disposto entre a referida abertura de entrada e a referida abertura de saida, por o referido suporte compreendendo uma fase sólida hidrófoba permitindo a concretização de uma cromatografia em fase inversa e o referido recipiente contendo o referido enchimento de carvão ativado serem escolhidos, independentemente um do outro, de entre os elementos seguintes: uma placa, um poço, uma coluna, um tubo e uma placa compreendendo uma pluralidade de poços; por compreender para além disso, uma placa MALDI, por o referido enchimento ser preparado misturando uma quantidade igual de carvão ativado e de terra de diatomáceas e por a referida fase sólida hidrófoba se apresentar de preferência sob forma dividida e compreender um material magnético.
  15. 15. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender uma dada quantidade de um composto padrão escolhido de entre os monossacáridos, os dissacáridos e os trissacáridos, eventualmente marcados com um isótopo radioativo e, nomeadamente a tre-halose deuterada e/ou, além disso, uma dada quantidade de um enzima apto a reagir com os complexos formados pelos polissacáridos e/ou os oligossacáridos e/ou monossacáridos contidos num liquido biológico.
PT137565248T 2012-06-26 2013-06-24 Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa taldi-tof PT2877590E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1201796 2012-06-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2877590E true PT2877590E (pt) 2016-06-23

Family

ID=46889116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT137565248T PT2877590E (pt) 2012-06-26 2013-06-24 Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa taldi-tof

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9360470B2 (pt)
EP (1) EP2877590B1 (pt)
JP (1) JP6254585B2 (pt)
CN (1) CN104411833B (pt)
DK (1) DK2877590T3 (pt)
ES (1) ES2577452T3 (pt)
HU (1) HUE028559T2 (pt)
PL (1) PL2877590T3 (pt)
PT (1) PT2877590E (pt)
WO (1) WO2014001658A1 (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142501B (zh) * 2015-03-17 2020-06-05 北京毅新博创生物科技有限公司 全自动多肽提取飞行时间质谱检测仪
CN105866407A (zh) * 2016-04-22 2016-08-17 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
JP2019207106A (ja) * 2016-08-25 2019-12-05 日本たばこ産業株式会社 配糖体の分析方法
CN114414341A (zh) * 2022-01-25 2022-04-29 厦门元谱生物科技有限公司 一种血液培养报阳的检测方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04237496A (ja) * 1991-01-17 1992-08-25 Mitsubishi Kasei Corp 環状イヌロオリゴ糖の製造方法
JP2000041693A (ja) * 1998-07-27 2000-02-15 Morinaga Milk Ind Co Ltd ガラクトオリゴ糖の製造方法
FR2818647B1 (fr) * 2000-12-21 2006-09-29 Pasteur Institut Glycopeptides immunogenes, criblage, preparation et applications
EP2444408A3 (en) * 2002-12-26 2014-01-01 Shionogi&Co., Ltd. Method of purifying/concentrating sugar chain with sugar chain-trapping molecule and method of analyzing sugar chain structure
US20060057638A1 (en) * 2004-04-15 2006-03-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates
JP4262289B2 (ja) 2005-03-31 2009-05-13 財団法人野口研究所 生体試料の解析法及び疾患マーカーの検索法
WO2006127056A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fluidics device
JP2007145361A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Toray Ind Inc 納豆容器
EP2010679A2 (en) 2006-04-06 2009-01-07 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for the use in identification of fungi
PL1920781T3 (pl) * 2006-11-10 2015-06-30 Glycotope Gmbh Kompozycje zawierające core-1-dodatnie mikroorganizmy i ich zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce nowotworów
US20100003699A1 (en) * 2008-01-18 2010-01-07 Glykos Finland Ltd. Tissue carbohydrate compositions and analysis thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ES2577452T3 (es) 2016-07-15
CN104411833A (zh) 2015-03-11
PL2877590T3 (pl) 2016-11-30
EP2877590B1 (fr) 2016-05-18
EP2877590A1 (fr) 2015-06-03
US9360470B2 (en) 2016-06-07
WO2014001658A8 (fr) 2014-06-05
JP2015526711A (ja) 2015-09-10
HUE028559T2 (en) 2016-12-28
JP6254585B2 (ja) 2017-12-27
DK2877590T3 (en) 2016-07-04
CN104411833B (zh) 2017-11-14
WO2014001658A1 (fr) 2014-01-03
US20150338391A1 (en) 2015-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11285166B2 (en) Glycan-based drugs, therapies and biomarkers
US8003392B2 (en) Diagnostic test for the detection of early stage liver cancer
PT2877590E (pt) Método de diagnóstico in vitro de uma infeção fúngica invasiva por espectrometria de massa taldi-tof
WO2009126652A2 (en) Glycan based array and uses thereof
US11766450B2 (en) Use of polysaccharide for treating ST-elevation myocardial infarction and diseases of the digestion system
US20120208214A1 (en) Rapid saccharide biomarker assay
Gunnarsson et al. Oligosaccharide structures mediating agglutination of sheep erythrocytes by Staphylococcus saprophyticus
Blangy-Letheule et al. New approaches to identify sepsis biomarkers: the importance of model and sample source for mass spectrometry
Khatua et al. Sialylation of outer membrane porin protein D: a mechanistic basis of antibiotic uptake in Pseudomonas aeruginosa
Sendid et al. Preliminary evidence for a serum disaccharide signature of invasive Candida albicans infection detected by MALDI mass spectrometry
Arya et al. Involvement of the toll-like receptors-2/nuclear factor-kappa B signaling pathway in atherosclerosis induced by high-fat diet and zymosan A in C57BL/6 mice
Mastrodonato et al. Histochemical characterization of the sialic acid residues in mouse colon mucins
Guerrero et al. New strategies for resolving oligosaccharide isomers by exploiting mechanistic and thermochemical aspects of fragment ion formation
Ishizuka et al. Interference of (1→ 3)-β-D-glucan administration in the measurement of plasma (1→ 3)-β-D-glucan
Tsuchiya et al. Isolation and characterization of an N-linked oligosaccharide that is increased in glioblastoma tissue and cell lines
Bassareo et al. Prematurity at birth and increased cardiovascular risk: is a metabolomic approach the right solution?
Maltesen Postoperative lung injury-the path from initiation to clinical diagnosis: a molecular view on a complex pathophysiological process
Kehinde et al. Ellagic Acid and Hesperetin Ameliorates Lipopolysaccharide-Induced Multiple Organ Perturbation of Glycolytic and Mitochondrial Metabolizing Enzymes in Murine Model
Pidvalna INTERNATIONAL PUBLICATIONS OF UKRAINIAN AUTHORS
Premkumar The impact of obesity on severe acute illness
Hasija Erythrocyte Membrane Glycoprotein Changes During Cancer Cervix
RU2235318C2 (ru) Способ оценки индивидуальной чувствительности организма к лекарственным препаратам
RU1803870C (ru) Способ определени периодов гипертонической болезни
Ali et al. Evaluation of serum fucose and protein bound fucose on myocardial infarction patients in Erbil city
Durgawale Pushpa et al. ROLE OF S. GRANTII LECTIN IN DETECTION OF THE SURFACE CARBOHYDRATES OF RBC OF NORMAL AND CANCER PATIENTS