JP6254585B2 - Maldi−tof質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断法 - Google Patents

Maldi−tof質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断法 Download PDF

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Description

本発明は、MALDI−TOF質量分析(MALDI-TOF Spectrometry)による侵襲性真菌感染症(invasive fungal infection)の体外診断法に関する。本発明の方法では、サンプルに含まれ、侵襲性真菌感染症の診断用のマーカーとして使用される関心対象の化合物を定量化することができる。
C.アルビカンス(C. albicans)等の酵母が健常者の粘膜に存在することは多いが、通常はそれらが特定の疾患または症状を引き起こすことはない。体が弱ると酵母が増殖して血液系に移行し、その場合には侵襲性または全身性感染症が言及される。C.アルビカンスの場合、ヒトのカンジダ血症(C.アルビカンスに起因する真菌血症)はその40%が死に至る。侵襲性真菌疾患(IFD)すなわち侵襲性真菌感染症は一般的で深刻な院内疾患である。有効な医療法はあるものの、病院がそれを行うには費用面で益々難しく、IFDの罹患率は減少していない。真菌をサンプリングするために患者の感染した局所的部位へリスクなしに接近することは不可能なことが多く、従来の菌学的方法(単離/同定)は多くの場合不完全である。また、血液培養はIFDの症例のほぼ半分で陰性である。いわゆる分子生物学的方法(PCR)はこれらの問題を解決しない。加えて、(診断に基づく)抗真菌性治療を早期に導入することが患者の生存に影響することが確認されている。従来の菌学の付加的または代替的診断法の内、患者血清中の循環グリカン(すなわち、感染した患者の血清に含まれる真菌グリカン)を検出する方法を臨床医は評価している。このグリカンは微生物(microcetes)またはその前駆体の細胞壁に由来するものであり、商業的免疫学的検査で検出することができる。また、Platelia(登録商標)カンジダ抗原試験では、カンジダとアスペルギルスの夫々に由来するマンナンやガラクタマンナン(galactamannan)を検出することができる。例えば、商標Fungitell(登録商標)で販売される生化学キットは、カンジダとアスペルギルスに共通のグルカンを検出することができる。
上記2種類の「キット」の各々は多くの異なる試薬と内部標準を含んでいる。特に血清を試験する目的である場合、バッチ毎に較正曲線を作製する必要があり、試薬の消費が増加する。このような較正が必要であるため、経済的な理由から(不十分な試薬のため)調査が場合によっては行われない可能性がある。例えば、Fungitell(登録商標)では較正のために9個のウェル(well)を使用し、そして1つの血清を試験するために技術者を半日拘束することは困難である。これらの試験には特にプログラムされた自動分析装置へのアクセスが要求され、情報システムとのインターフェースを有しており、それらの要求にできるだけ応えるとき、そのシステムは1人の患者の緊急の実用的使用が更に複雑になる。
したがって、これらの試験の全てにおいて時間および/または被験者に関する要求が特に多い。加えて、ある一定数の偽陽性結果が生じ、これが診断を妨げている。IFD、例えば高トリグリセリド血症の危険に晒された患者において、ヘモグロビン(収集時に溶血する血清)の存在もしくは頻繁な代謝性異常またはビリルビンもしくは低蛋白血症の存在によって妨害されるグルカン(複数可)の生化学測定には、このことは特に当てはまる。
最後に、真菌以外の生物による多重感染の集中治療を受けている入院患者の偽陽性結果が何度も報告されている。これらの患者の血清中で循環する物質は分子ベースで特性化されていないので、P−D−グルカンを検出する際の偽陽性反応の機序の種類が分かっていない。これらの偽陽性結果があるため、治療の必要がない一部の患者に抗真菌性抗生物質療法が施され、このためにこの患者の入院期間が延びている。偽陰性結果の場合、感染が真菌性ではなく細菌性であると解釈され、患者は抗菌抗生物質療法を施され、このことは有害であり、致命的な場合がある。
加えて、Fungitell(登録商標)キットは、稀少になりつつある動物であるカブトガニ由来の血液を使用しているが、現在、カブトガニを飼育することができない。したがって、カブトガニは自然環境で捕獲される。血液サンプルをカブトガニから採取した後で放つが、放たれたカブトガニの20%は生きられない。
本発明の1つの目的は、侵襲性真菌感染症の体外診断法の提案である。
他の目的は、上述の偽陰性や偽陽性という検査結果を回避するために役立つ体外診断法の提案である。
本発明は、病原性真菌微生物に起因する侵襲性真菌感染症の体外診断法に関し、この診断法は、
・哺乳動物から得られる、タンパク質および/または脂質および/または塩および/または多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖と複合体を形成しやすい前記タンパク質および/または脂質および/または塩、および/または前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖が含まれる生物学的液体のサンプルを提供し、
・前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を抽出する前記サンプルを処理し、
・前記真菌微生物由来の少なくとも1つの所与の関心対象の化合物中の多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖の有無を確認するためにMALDI−TOF質量分光分析を使用し、
・前記サンプルに前記所与の関心対象の化合物が存在するとき、前記哺乳動物は侵襲性真菌感染症に罹っていると結論付ける。
したがって、発明者の1つの利点は、MALDI−TOF質量分析で、複雑な生物学的液体中に宿主哺乳動物ではなく病原性微生物由来の糖、特に多糖、オリゴ糖および単糖から選択された化合物の存在が検出可能であることを示したことである。本発明者の他の利点は、関心対象の化合物が侵襲性真菌感染症の診断用マーカーであることを示したことである。関心対象の化合物(マーカー)の存在は、MALDI−TOF質量分析によって得られたスペクトルの可視のピークによって表される。病原性真菌微生物由来の上記化合物がMALDI−TOF質量分析によって生物学的液体から検出できることが明白ではなかった。また、この関心対象の化合物が侵襲性真菌感染症を表せることも明白ではなかった。関心対象の化合物を検出するには量が少なすぎることや、関心対象の化合物を表すシグナルが生物学的液体、特に血清で見られる何千もの信号の中に隠れていることも考えられる。また、糖(多糖、オリゴ糖および単糖)は生物学的液体中の脂質、タンパク質と塩と複合体を形成し、したがって、検出するのが困難である。
所与の微生物に起因する侵襲性真菌感染症の診断に用いられる関心対象の化合物の1つを表している重要なピーク(複数可)が、例えば、所与の病原性真菌微生物(複数可)に感染している哺乳動物由来の生物学的液体のサンプルで本願において記載された実験的なプロトコルを再現することによって最初に特定される。
本発明の方法は、それらを標識する必要なしに上記関心対象の化合物を検出することができる。
幾つかの関心対象の化合物であって、そのうちの1つが多糖、オリゴ糖または単糖に属する化合物が同時に存在することを検出するために、MALDI−TOF質量分析を本発明の方法に従って使用することが可能である。関心対象の化合物の全てが、本発明によれば、後述するような糖でもあり得る。
有利には、前記生物学的サンプルから前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を抽出するために、
・前記タンパク質および/または前記脂質の大部分の沈殿/凝固によって生物学的液体から前記サンプルに含まれる前記複合体を解離し、
・前記サンプルを遠心分離し、上清を固相から分離し、
・上清を回収し、
・上清に含まれる前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を特に逆相クロマトグラフィーによって残留蛋白質および残留脂質から分離し、前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を特に吸収クロマトグラフィーの実行によって前記塩から分離する。
本発明によれば、最初に関心対象の化合物を塩から分離することができ、次いで、それを残留蛋白質および/または残留脂質から分離するか、これらの工程を逆の順序で実施することが可能である。
有利には、前記複合体を解離させるために、錯化剤、特に塩基、特にEDTAが添加され、その混合物が沸騰加熱される。その温度は100℃〜140℃、具体的には略120℃である。加熱時間はサンプルのサイズや、加熱に使われる技術や、サンプルを含む受容器に応じて当業者が調節可能である。サンプルの全量を沸騰させる必要がある。加熱時間は特にサンプルに含まれる糖を分解しないように調節される。一例として、加熱時間は3分〜7分である。
本発明の方法は、試薬の観点から特には確実かつ非常に安価である。分析適合性に関して、技術時間は、既存のキットに使用に必要である時間程度である。EDTA等の錯化剤は、加熱と組み合わせて前記生物学的液体中に存在する複合体を解離させることができる。錯化剤は、特に二価陽イオンに依存するレクチンから糖を放出することができる。
特定の使用方法によれば、最初に逆相クロマトグラフィーを適用し、続いて吸収クロマトグラフィーを行う。
有利には、疎水性相を含むカラムを逆相クロマトグラフィーのために使用し、活性炭を含むカラムを吸収クロマトグラフィーのために使用する。
疎水性カラムは、例えばオクタデシル基(C18)に結合している任意の固体支持体で充填されたカラムであってもよい。支持体はポリマーまたは多孔質シリカであってもよい。これらのカラムのサイズおよび容積は、処理される血清の容積によって変わる。活性炭を含むカラムは同じ重量の活性炭とセライト(珪藻土)とを含んでもよく、これによって単糖および二糖を溶出液中で回収することが可能になり、他の糖類はカラム中に保持される。
関心対象の化合物のサイズおよび分子量は本発明によって限定されない。例えば、関心対象の化合物は1000未満のm/z比であってもよい。関心対象の化合物は二糖、特にm/zシグナル=365を示すヘキソースダイマーであってもよい。侵襲性真菌感染症のマーカーであるこの関心対象の化合物は、例えばトレハロースであってもよい。
有利には、前記錯化剤を添加した後、多糖および/またはオリゴ糖鎖を切断させることができる少なくとも1つの酵素を添加し、前記関心対象の化合物を切断するために化学処理を適用し、その結果、関心対象の前記化合物の量が潜在的に増加する。エンドマンノシダーゼ(endomanosidase)の使用は、それらの質量分析(MALDI−TOF)シグナルの強度を増加させるために、オリゴマンノシド(oligomanoside)を遊離させることができる。アセトリシス等の化学処理もこの状況で考慮することができる。これらのポリマーから短鎖を放出させるために、ガラクトマンナン、グルカン、そしてさらにはキチン(真菌の壁の3つの主な化合物)に関して同様に作業することも可能である。
このように、マンノシダーゼ後の三糖からのシグナル強度の増大によってシグナルは循環マンナンに帰属される。
この分析プロセスはエキソグリコシダーゼの作用によって補完されてもよく、それに基づく結論はシグナルの消失に反する。したがって、関連する病原体は、生物学的液体のサンプルに存在するオリゴ糖の種類によって確定することができる。
有利には、前記関心対象の化合物の添加後、以下の単糖およびオリゴ糖から選択される:[N−アセチル−グルコサミンβ−(1,4)N−アセチル−グルコサミン]n(この式中のnは1以上で10以下の整数)、2〜10個の単糖を含むオリゴ糖、特にヘキソースオリゴマー、特にヘキソースダイマー;特に[グルコース、β−(1,3)グルコース]n、[β−(1,6)グルコース、β−(1,6)グルコース]n(この式中のnは1以上で10以下の整数)のグルカン;マンナン、特に[マンノース、α−(1,2)マンノース]n、[マンノース、α−(1,3)マンノース]n、[マンノース、α−(1,6)マンノース]n、および[マンノース、β−(1,2)マンノース]n(この式中のnは1以上で10以下の整数)タイプのマンナン、ガラクトマンナン、ガラクタン、アラビノガラクタン、およびグルクロノキシロマンナンから選択される。
本発明の特定の使用方法によると、関心対象の化合物は、病原性真菌微生物によって産生される化合物であり、さらに具体的にはトレハロースである。
マーカーとして使用される関心対象の化合物は、ヘキソースダイマー、特にトレハロース(m/z=365)であってもよい。そのような種類の関心対象の化合物は、病原菌の感染症、特にC.アルビカンスの感染症の良好なマーカーであることが判明している。
病原性真菌微生物は、前記哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生することができる病原性真菌微生物、カンジダ(Candida)種、特にC.アルビカンス、アスペルギルス(Aspergillus)種、フザリウム(Fusarium)種、トリコスポロン(Trichosporon)種、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アクレモニウム(Acremonium)種、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、スポロトリックスシェンキイ(Sporothrix schenckii)およびニューモシスチス・ジロヴェチ(Pneumocystis jirovecii)から選択することができる。
有利には、病原性真菌微生物は哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生する上記病原性真菌微生物から選択される。
有利には、前記標準化合物について得られたシグナルと関心対象の前記所与の化合物について得られたシグナルの強度を比較することによって、前記サンプルに含まれる前記関心対象の化合物の量を確認することができるように、既知量の少なくとも1つの標準化合物を前記サンプルに添加する。化合物は処理される前にサンプルに添加してもよい。本発明によれば、標準化合物として、分析されるオリゴ糖に近いm/z値を有する化合物を使用することが可能である。m/z値がある区間(関心対象の化合物のm/z−5;関心対象の化合物のm/z+5)に含まれるか、またはこの区間の境界値にある場合、関心対象の化合物のm/z値と類似していると見なされる。
有利には、標準化合物は、検出される化合物の挙動と同じように使用されるカラム上でクロマトグラフ的に挙動する。この場合、加熱段階の後で、2本のカラムに通す前に、添加することができる。健常であるか病的であるにかかわらず、標準カラムは生物学的液体の中に存在する化合物であってはならない。標準カラムは、微生物汚染から生じると確認されやすくてはならない。有利には、これらの目的のために、おそらくは放射性同位元素で標識された二糖または三糖が使用される。例えば、重水素化トレハロース(MW 2Hトレハロース=356+Na=379)を標準化合物として使用してもよい。
他の実施の形態によれば、前記所与の関心対象の化合物と対応するシグナルのシグナル強度とユビキタス内因性シグナルの強度との比を決定し、前記内因性シグナルは前もって同定され、おそらくはサンプルを得た生物学的液体の種類に特異的であり、その結果、前記サンプルに含まれる関心対象の前記所与の化合物を定量化することができる。
これは、実際に生物学的液体の種類で関心対象の化合物を定量化するのに用いられる可能性がある全ての血清サンプルに存在する一定シグナル(ユビキタスシグナルと言われる)を同定したことが本発明者のもう一つの利点である。当業者は、生物学的液体の所与のタイプの(好ましくは、感染していないか、感染していないと思われる)幾つかのサンプルに関してMALDI−TOF分析を行うことによって、ユビキタスシグナルを容易に同定することができる。ユビキタスシグナルは、シグナルがこの種類の液体の全てのサンプルで見いだされる一定シグナルであり、上述のシグナルの強度は液体のタイプを表し、上述のシグナルの強度はMALDI−TOF分析から得られるスペクトログラムの上に現れるピークの高さである。
したがって、本発明によれば、生物学的液体は、動脈または静脈血、血清、生殖粘膜液、気道液、特に気管支肺胞洗浄から得られる液体、気管支吸引、気管吸引、吐出物、痰、皮膚および外皮を収集するために用いられた液体、浸出液、閉鎖腔からの液体、特に脳脊髄液体、胃腸管または尿管および生検断片の摩砕から得られる液体から選択されてもよい。
また、本発明は、本発明の方法を可能にするキットに関する。一実施の形態のキットは、
・逆相クロマトグラフィーを実行可能にする固形疎水性相からなる少なくとも第1の支持体と、
・インプット開口部と、アウトプット開口部と、前記インプット開口部と前記アウトプット開口部との間に配置される粉末状活性炭の充填物を含む少なくとも第2容器と、を含んでいる。
刊行物:Whistler and Durso, Journal of American Chemical Society, 1950に記載された当業者に周知の原理に基づいて、同じ量の商業的な活性炭セライト(登録商標)(珪藻土)を混合することによって充填物が調製されてもよい。
固体疎水性相は分割された形態で存在してもよく、前記生物学的液体と接触した後に磁石で固相を除去することが可能になるように磁性材料を含んでもよい。例えば、固体疎水性相は、鉄または磁性材料を含み、疎水性材料で覆われる複数のビードの形態であってもよい。分割された形態の固体疎水性相は、生物学的液体のサンプルと接触して配置される。それらを混合してもよい。ビードは大きな接触面面積を提供する。ある接触時間後、例えば磁石を生物学的液体と固体疎水性相のビードの混合物中に浸漬することによって、固体疎水性相が磁石で除去され、ビードは磁石に付着し、それによって処理された生物学的液体を容易に分離することができる。
もう一つの実施の形態によれば、キットは場合によって放射性同位体で標識された単糖、二糖および三糖から選択される所定の量の標準化合物、特に重水素化トレハロースを含んでもよい。
有利には、キットは生物学的液体に含まれる多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖によって形成される複合体と反応することができる所与の量の酵素をふくんでもよい。
前記逆相クロマトグラフィーが適用されることを可能にする固体疎水性相を含む支持体は、プレート(plate)、ウェル(well)、カラム(column)、チューブ(tube)、または多数のウェルを含むプレートであってもよい。
固体活性炭充填物用の容器は、前記支持体の選択とは無関係に、ウェル、カラム、チューブまたは多くのウェルを含むプレートであってもよい。
有利には、本発明のキットはMALDIプレートも含んでいる。
また、MALDI−TOF質量分析による侵襲性真菌感染症の体外診断のために、本発明は、多糖、オリゴ糖および単糖の中から選択される関心対象の化合物、特にトレハロースの使用を含んでいる。
本発明、その特性、特定の特徴、様々な利点は、以下に記載した非網羅的一例として示された特定の操作法について言及した説明を添付図面を参照して読むことによってより明らかになる:
図1a〜1dは、夫々表1に記載されるG25、G32、G42およびG49血清から調製したMALDIプレートの分析により本発明の方法によって得られた質量スペクトル(MALDI−TOF)を表し、血清のサンプルに存在する化合物は、スペクトルのピーク(シグナル)によって表され、スペクトルのX軸はピークによって表される化合物のm/z比(質量単位−MU)を表している。Y軸は、シグナル高さ(ピークの高さ)の強度を示し、サンプルに含まれる、示された化合物の量に相当し、100%の値は、全ての血清からのユビキタス内因性シグナルに起因する。 図2aは、表1で同定された血清サンプルに含まれるマンナンの量(ng/mL)を垂直軸上に表し、X軸上にPlatelia(登録商標)C.アルビカンス・キットを使用することによって得られる量を示している。 図2bは、表1の血清のサンプルに含まれるグルカンの量(ng/mL)を表し、グルカンの量はY軸上に示され、一方、血清番号はX軸に示され、前記量は、Fungitell(登録商標)キットを使用して測定される、 図2cは、表1からサンプルの各々に含まれるヘキソースオリゴマー(2つのヘキソースから形成され、以下に詳細に記載されるオリゴマー)の量を表している。ユビキタスシグナルの前記オリゴマーの量(パーセンテージ)はY軸およびX軸上の群で示され、前記量は、前記オリゴマーから得られるピーク高さの、ユビキタスシグナルについて得られるピーク高さの比×100で表される。
定義
本発明によれば、哺乳動物は限定されず、ヒトであっても他の任意の哺乳動物であってもよい。したがって、本発明はヒト用医薬と獣医用医薬の両方に適用される。
本発明によれば、オリゴ糖と多糖はグリコシド結合で互いに結合する単糖であると定義される。オリゴ糖は2〜10個の単糖から構成され、多糖は10個を超える単糖から構成される。
MALDI−TOF分光計は、MALDIマトリクス支援レーザー脱離イオン化法がTOF(飛行時間)質量分析計)と連結された質量分析計である。この種の機器は、病院環境をはじめとして明らかに比較的広範で利用可能である。
本発明によれば、関心対象の化合物の存在がMALDI−TOF分光法によって得られる質量スペクトルの目に見えるピークによって定義される。したがって、当業者は、そのスペクトルの目に見える重大なピークの存在を認識することができる。特に、本発明によれば、重要なピークが参照ピークの強度の1%以上、有利には3%以上、さらに有利には少なくともほぼ5%であってもよい。
本発明によれば、「侵襲性真菌感染症」という用語は、哺乳動物末梢血中の酵母(キノコ)の存在に起因する感染症と、血液および少なくとも1つの組織を傷つける感染症を纏めたものである。例えば、酵母の血管外血行性伝播から生じる、肝障害および腎障害が起こり得るC.アルビカンスの感染症の場合、「侵襲性真菌感染症」という用語はカンジダ血症および侵襲性カンジダ症を纏めたものである。
本発明によれば、関心対象の化合物の存在はMALDI−TOF分光法によって得られる質量スペクトル上の目に見えるピークの存在によって定義される。当業者は、そのようなスペクトルの上で目に見えるので、したがって重大なピークの存在も認めることができる。特に、重要なピークは、本発明によれば、参照ピークの強度の1%以上、有利には3%以上、さらに有利には少なくともほぼ5%であってもよい。
本発明によれば、「侵襲性真菌感染症」という用語は、末梢哺乳動物血液中の酵母(キノコ)の存在に起因するそれらの感染症と、血液および少なくとも1つの組織を傷つける感染症とをまとめたものである。例えば、酵母の血管外血行性伝播から生じる、肝障害および腎障害が起こり得るC.アルビカンスの感染症の場合、「侵襲性真菌感染症」という用語は、カンジダ血症および侵襲性カンジダ症をまとめたものである。
本発明によれば、自発的または微生物自身もしくは宿主酵素による解重合/分解の結果として放出される、宿主生物学的液体中に存在する病原性微生物の残留物質である病原性真菌微生物由来の化合物であって、関心対象の化合物は、病原性真菌微生物由来の多糖または糖蛋白もしくは糖脂質のグリカン対由来である可能性がある。関心対象の化合物は、病原性真菌微生物の壁由来であるか、または壁の分解生成物、病原性真菌微生物によって分泌/排出または発現され、前記微生物が宿主細胞によって破壊されると放出される化合物である可能性がある。それは感染した哺乳動物と前記病原性真菌微生物との間の相互作用から生じる化合物であってもよい。
「病原性真菌微生物」という用語は、その遺伝機構が哺乳動物によって産生されるものと異なる多糖またはオリゴ糖配列を可能にする真菌(酵母)を意味するか、またはそれらの体内で生理学的に存在しない量のそれらが産生されることを意味している。本発明によれば、「生物学的液体」という用語は、生きている生物、特に哺乳動物、さらに具体的にはヒト由来であり、水、少なくとも1種類のタンパク質および/または1種類の液体および/または例えば、ナトリウムまたはカリウム等のイオンの形態で存在する少なくとも1種類のミネラル塩を含む任意の液体を指し、イオンはおそらくは金属イオンである。本発明によれば、塩はイオンの形態のミネラル塩であると定義される。
C.アルビカンスに起因する真菌感染症に関した下記実験は、研究される1つ、または複数の病原性真菌微生物によって人工的に感染させた哺乳動物を用いて行ってもよい。下記実験は、研究される病原微生物(複数可)に起因する侵襲性真菌感染症のマーカーとして使用するのに適した関心対象の化合物(複数可)を確立し、関心対象の前記化合物(複数可)を特性化して、その感染症との関係を確立するために使用できる。
実験
第1段階: グリカンを検出する生物学的サンプルが処理される段階であり、下記手順が血清に適用される。
・300pLの試験サンプルを1.5mlの滅菌マイクロチューブに入れる。
・100μLの処理溶液(EDTA酸溶液)を各試験管中に添加する。
・ボルテックス混合する。
・密封されたマイクロチューブを加熱ブロック上に置き、120℃で6分間連動ジャンプさせる。
・試験管を取り出して10,000gで10分間遠心分離する。
・上清(150μl)を無菌1.5mlマイクロチューブに移す。
質量分析によってグリカンを検出する後処理を上清に関して実施する。このプロセスでは、凝固して塊になるタンパク質複合体のマンナンおよびガラクトマンナンが放出/分離され、グルカン(Fungitell(登録商標)キット)の比色測定を全く変えず、これによって同じ未処理のサンプルから得られるものと一致した結果が得られる。反対に、この処理は過剰なタンパク質、トリグリセリド、ビリルビンおよび/またはヘモグロビンによる干渉を排除する。
第2段階: 上清を処理し、質量分析前にオリゴ糖を精製し、濃縮する。
100μLの上清を5容積のアセトニトリル(ANC)および水の溶液(75:25、vol/vol)で予め調整し、10容積の水で洗浄した、固相抽出(SPE)カートリッジ(ref SPE−C18:C18 Sep−Pakカートリッジ(Waters))(1容積))(1つのカラムは疎水性充填物を含む)上に入れる。集めた上清をカートリッジに入れた後、カートリッジを2容積の水ですすぎ、これを集める。C18カラム溶出液を5容積のANC/H2O(25:75、vol/vol)で予め調整し、次いで10容積の水ですすいだ、同じ重量の商業的な活性炭とセライト(登録商標)(等容積)との混合物を含むSPEカートリッジ上に載せた。上清をカートリッジに通過させた後、カートリッジを20容積の水ですすぎ、溶出液を捨てる。カラムを2容積のANC/H2O(25:75、vol/vol)ですすぐ。最初の100μLを不合格とし、次の300μLを集める。溶出液(ANC/H2O)を乾燥する。
第3段階: 質量分析によりオリゴ糖を分析する。
質量分析にはMALDI−TOF Voyager Elite DES−TR分光光度計(Perspective Biosystems Framingham, MA)が使用される。乾燥抽出物を水中に溶解させ、1μL溶液をジヒドロ安息香酸溶液の1μL溶液(ACN/H2O 50/50中10mg/ml)でスパイクする。1μLの溶液をMALDI−TOFプレート(フープ状の96ウェルステンレスプレートによって適用)上に堆積させ、50℃で結晶化させる。MALDI−TOF分析は陽性リフレクトロンモード、つまり取得パラメータを使用してリフレクトロン様式が1,000未満のm/z比を有する中性オリゴ糖から最適化された取得パラメータを使用するリフレクトロンモードで実施される。データ収集後、混合物中のオリゴグルカンの存在は、生成した付加物(M+Na)+を観察することで確認される。診断のための関心対象の質量(M)は、方程式M Hexn=180+[162](n−1)+23によって算出される。分子群の相対的な定量化は、M Hexnシグナル、すなわちユビキタス内因性シグナルの比の算出、または第2段階の第1相におけるサンプルに添加された外部標準で実施される。現在まで、診断のための興味深いシグナルはM Hex2=365である。テキスト中でさらに示される分析例は365/361のシグナル比の算出に基づいている。
ヒト血清の分析
本発明の方法がリール地方大学病院に入院している患者の内、以下の基準に基づいて選択された患者の12の血清に適用された。
i)少なくとも1つのC.アルビカンス血液培養(C. albicans blood culture)によって証明され、入院中に全身性カンジダ症(systemic candidiasis)を発症した患者。
ii)一方または両方について陽性であり、血液培養サンプルが陽性であると判明する1週間前または判明後2週間以内に採取された血清サンプルに関して診断を導き、確定した血液グルカンまたはマンナン試験の検出が要請された患者。
iii)法律上の理由のために1年間−20℃で貯蔵された残留血清の内、最少量1mlが利用可能なもの。
下記の表1は上記の基準を満たし、したがってIFDに罹っている12人の患者の血清に関してPlatelia(登録商標)抗原およびFongitell(登録商標)キットを使用して得られる結果を纏めたものである。
Figure 0006254585
本発明の方法が上記血清サンプルに適用された。その結果は図1a〜1dおよび2a〜2cに見ることができる。
図1a〜1dに示されるように、本発明の方法を適用した表1の血清G25、G32、G42およびG49に関して実施されたMALDIプレート分析では、最初に全血清に関してm/z質量=361に対応する高強度シグナルを示した。このシグナルは未知の血清構成要素を表し、シグナル強度を較正するために使用される。第2に、シグナルは、m/z比=365を表す位置で、全ての上記の血清のスペクトルで見られる。シグナルはヘキソースダイマーと対応し、シグナルは前記ユビキタスシグナルに近いので、標準的校正シグナルとして有効に使用可能である。
加えて、健常な患者(結果は示さず)から採取される血清から本発明の方法によって調製されるMALDIプレートスペクトルは、m/z比=365を示すシグナルを含まないが、m/z比=361によってリプリントされるユビキタスシンボルを含んでいる。したがって、MALDI−TOF質量分光法によって検出可能な充分な量で存在するヘキソースダイマーが直接または間接的にC.アルビカンス病原体から生じると推論することができる。
図2a〜2cは、市販のキットで得られる結果と本発明による方法を使用して得られる結果を示している。
下記表2は、本発明の方法を適用する血清サンプルから得られる定量的結果を示している。
本発明の方法は、血清サンプルに存在するマンナンの検出とグルカンのための方法に等しいと見なすことができる。換言すれば、上述のヘキソース・ダイマー(m/z=365)に対応するシグナルは、関係する血清サンプルのマンナンおよびグルカンの存在に対して少なくとも特徴的であるとみなすことができる。加えて、グルカン血症とマンナン血症の両方に罹っている患者では、m/z=361に対応するピーク高さに対するm/z=365に対応しているピークの高さは、検出されるマンナンおよびグルカンの量と相対的に関連している。両商業試験で陰性だった血清G4に関して、本発明の方法では陰性であった(m/z=365のシグナルはない)。反対に、マンナンを検出することができず、検出されるグルカンのレベルが非常に低いかまたは0であった患者G5、G6およびG15に関しては、m/z比=365を示す明瞭なシグナルが確認できる。
Figure 0006254585
したがって、本発明の方法は、これらの試験の陽性によって存在が示される、存在する物質を検出することによってPlatelia(登録商標)カンジダ・アルビカンスとFungitell(登録商標)試験の両方を置換することができる。加えて、市販のキットでグルカンおよびマンナンを含まないと判明した血清でさえ、本発明の方法によってm/z=365を示すシグナルを検出することができる。したがって、本発明の方法は上述の市販のキットより感受性が高く、かつ信頼性が高い。これは「反射」分析モードのMALDI−TOF・M/S装置で得られた結果であり、MALDI−TOF「線状」分析モードでも同じ結果が得られる。
m/z=365を生じる関心対象の物質の特性化
m/zピーク=365によって表される侵襲性真菌感染症の診断用のマーカーとして使用される関心対象の化合物の構造を確定するために、侵襲性カンジダ症で苦しんでいる患者の上清または血清をプレメチル化(pre−methylate)した。したがって、侵襲性カンジダ症で苦しんでいる患者からの血清を、上記定義の段階1および2にしたがって処理し、第2段階で得られた溶出液中に含まれ、水中に溶解させた糖を次いでプレメチル化した。プレメチル化技術は当業者には公知であり、以下の刊行物「Ciucanu I, Kerek F. 1984. “A simple and rapid method for the pre−methylation of carbohydrates.” Carbohydr Res. 131:209−217」で特に記載されている。MALDIプレートを次いで、上記第3段階で記載されるプロトコルにしたがって調製する。プレメチル化された糖から得られる[M+Na]+シグナルはm/z値=477で現れ、それは実際、プレメチル化されたヘキソース二糖に相当する。
プレメチル化を受けた、最初の2つの上記段階にしたがって処理された侵襲性カンジダ症患者からの血清はクロマトグラフィーピークを示す(フレームイオン化検出器を用いた気相式クロマトグラフィー、FID−GC:Alltech ECONO−CAP EC−1、無極キャピラリーカラム[30m×0.25mm×0.25um]。180℃から330℃までの温度勾配で実行時間=28.8分はプレメチル化トレハロース(αGlc1−1αGlc)に対する保持時間と同じ保持時間に相当する。GCEI/MS(電子衝撃質量分析に連結した気相クロマトグラフィー、SGE SolGel−1ms[30m×0.25mm×0.25μm]、侵襲性カンジダ症と診断された患者からの血清のGC/FIDに使用したものと同じ実験条件、前記段階の最初の30にしたがって処理し、プレメチル化を受けたもの)は、プレメチル化トレハロース(αGlc−1αGlc)と同じIEMSフラグメンテーションスペクトルを示す。このことから、m/z=365のシグナルによって表されるMALDI−TOF質量分析によって同定される関心対象の化合物が二糖、さらに詳細にはトレハロースであると結論づけられる。したがって、この関心対象の化合物は、侵襲性真菌感染症、さらに詳細にはC.アルビカンスに起因する侵襲性感染の診断用のマーカーとして使用することができる。
関心対象の化合物の真菌起源および侵襲性真菌感染症とのその関係の確認
体外実験
Pluskotaらによって記載された方法(J Immunol. 2008 Sep 1;181(5):3609−19)にしたがってチオグリコール酸塩の腹腔内注射を受けたマウスの腹腔からマウス好中球顆粒球を集めた。この注射の6時間後に、マウスを二酸化炭素吸入によって屠殺し、腹腔を切開した。5mlの氷冷PBS(リン酸緩衝食塩水)溶液を用いて、顆粒球を腹腔洗浄によって集めた。
起こり得るマクロファージによる汚染を減らすために、5%の二酸化炭素含有雰囲気中、37℃のインキュベーター中で、ウシ胎児血清で覆われた培養組織を含むペトリ皿で細胞を培養した。非接着顆粒球を上清から集め、血球計で計数し、遠心分離(2.250gで10分間)し、次いでハンクス平衡塩類溶液(HBSS(Invitrogen Company, Franceによって販売)中に再懸濁させた。ヒト顆粒球を、酸性クエン酸ブドウ糖液(1容積の154Mのクエン酸塩および2容積の2%ブドウ糖(pH=4.6))で健常ボランティアから採取された血球から単離した。Ficoll−Hypaque装置で遠心分離することによって単離した後、デキストラン中で赤血球を沈降させ、残存赤血球の低張溶解(hypotonic lysis)をおこなった。
顆粒球によるC.アルビカンスの破壊の評価
C.アルビカンス株SC5314由来の酵母(106単位)を、0.1MのHEPES(N−2−ヒドロキシ・エチルピペラジン−N−2’−エタンスルホン酸)pH7を含む0.25mlの溶液の中に懸濁させ、3×106のヒト顆粒球と1:3の比で1640rpmにて混合した。顆粒球(酵母)の混合物を、1〜2時間おだやかに混合しながら37℃でインキュベートした。30分毎に、混合物の300μLのアリコートを取り出し、m/z=365に対応する関心対象の化合物の有無を検出するために使用した。関心対象の化合物は、上記と同じ条件下でMALDI−TOF質量分光法によって検出された。m/z=365の関心対象の化合物に対応するシグナルが、ヒトおよびネズミ顆粒球の両方について約2時間後に現れ、関心対象の化合物が、C.アルビカンスと、真菌病原体に対する哺乳動物の防衛細胞の最前線である顆粒球との間の相互作用からおそらく生じるということを示す。
マウスにおける体内実験
動物: 6〜8週令の雌C57BL/6マウスを本願で記述される全ての実験に使用した。全てのマウスはCharles River Laboratories(フランス)から供給され、動物実験は全てリール大学地方病院センター動物実験倫理委員会によって承認され、実験および他の科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州指針86/609/EECに合致したプロトコルにしたがって実施した。
各々10匹のマウスの4群を形成した。マウス群は全て実験の開始日であるD1から14日間飼育した。D=14にはマウスは全て頸椎脱臼によって屠殺し、心臓穿刺によって血液を採取した。血清サンプルをこれらの血液サンプルから得、m/z=365に対応する関心対象の化合物を検出するために使用するまで−20℃で保管した。群0は対照群であった。すなわち、この群はいかなる治療も受けなかった10匹のマウスを含んでいた。マウスはC.アルビカンスで自然に(通常)コロニーを形成しない。
群1には、1日目から14日目まで与えた飲料水に1.5%のDSS(デキストラン硫酸ナトリウム、MW36〜50kDa; MPBiomedicals, LLC, Germany)を加えることによって腸炎を誘発させた群であった。この群は、C.アルビカンスでコロニーを形成しなかった。群2のマウスには、107単位のC.アルビカンスを含む200mlの(QPS)をD1に経口投与した。D1からD14まで与えた飲料水中に1.5%のDSS(ナトリウム硫酸デキストラン、MW36〜50kDa; MPBiomedicals, LLC, Germany)を加えることによって、群2のマウスでも腸炎症を誘発させた。腸炎症を誘発するDSSの投与は、マウスをその胃腸管における多数の酵母の成長に対して寛容にする。このモデルは、カンジダ属で広範囲にコロニーを形成する入院患者を再現する。これらは放射線治療または化学治療を受けた患者であり、彼らの腸壁は損傷を受けている。
群3の10匹のマウスは、D1に0.1mlの滅菌食塩水に含まれる104単位のC.アルビカンス株SC5314の静注を尾静脈中から受けた。この群は侵襲性カンジダ症を引き起こす広範囲に及ぶカンジダ血症を模倣し、カンジダ症はマウスでは致命的であり、入院患者ではカンジダ血症(侵襲性真菌感染症)に相当し、治療を受けない場合は通常、致命的である。マウスの4つの群からの血清におけるマンナンの有無は、Platelia(登録商標)C.アルビカンス・キットを使用して検査した。下記表3は、上述の群0〜3の各々の血清中に存在するマンナンの平均測定値を示している。表3のマウス群0〜3は血清中に含まれる平均マンナン濃度である。
Figure 0006254585
表3の結果は、Platelia(登録商標)カンジダ・アルビカンス試験が、群3からマウスでカンジダ血症にかかっていないコロニー形成マウスの場合も陽性だったことを示している。
次いで、m/z=365に対応する関心対象の化合物の有無が各群のマウス由来の血清で検出された。患者血清について記載したのと同じ実験プロトコルを使用した。関心対象の化合物を表すm/z=365シグナルは、群0、1または2に属するマウス由来の血清では検出されなかった;m/z=365シグナルは、群3のマウスにおける本発明の方法の最初の2段階にしたがって前処理された血清の各々で、MALDI−TOF質量分光法によってのみ検出された。その結果、本発明の方法は侵襲性真菌感染症を確実に診断し、侵襲性真菌感染症と胃腸管の広範囲のコロニー形成とを区別し、このことは上述の市販キットではできないことである。

Claims (14)

  1. 病原性真菌微生物由来のトレハロースの有無を判定する方法であって、
    タンパク質および/または脂質および/または塩および/または前記タンパク質および/または脂質および/または塩と複合体を形成しやすい多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を含む生物学的液体のサンプルをあらかじめ用意する工程、
    前記あらかじめ用意したサンプルを処理して前記複合体から、前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を分離して、前記トレハロースを抽出する工程
    MALDI−TOF質量分析を用いて前記トレハロースの有無を判定する工程、
    を有する方法。
  2. 前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖を前記サンプルから抽出するために、
    前記タンパク質および/または前記脂質の大部分の沈殿/凝集によって前記サンプルに含まれる前記複合体を前記生物学的液体から分離し、
    前記サンプルを遠心分離して上清を固相から分離し、
    前記上清を回収し、
    前記上清中に含まれる前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖が特に逆相クロマトグラフィーによって任意の残留タンパク質および任意の残留脂質から分離され、前記多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖が特に吸収クロマトグラフィーによって前記塩から分離される請求項1記載の方法。
  3. 前記複合体を解離させるために、錯化剤、特に前記錯化剤から選ばれた塩基であるもの、特にEDTAを添加し、結果として得られる混合物を沸点まで、特に100℃〜140℃の温度、具体的には120℃の温度まで加熱する請求項2記載の方法。
  4. 最初に逆相クロマトグラフィーを実施し、続いて吸収クロマトグラフィーを実施する請求項2または3に記載の方法。
  5. 疎水性相を含むカラムを逆相クロマトグラフィーのために使用し、活性炭を含むカラムを吸収クロマトグラフィーのために使用する請求項3または4に記載の方法。
  6. 前記複合体の解離から生じる前記多糖および/またはオリゴ糖の鎖を切断するために、添加される前記複合体に対して反応しやすい少なくとも1つの酵素の添加および/または化学処理を行い、結果として前記トレハロースの量が潜在的に増加する、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記トレハロースが、哺乳動物の免疫系の作用後に病原性真菌微生物によって産生される、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記病原性真菌微生物が、カンジダ(Candida)種、特にC.アルビカンス、アスペルギルス(Aspergillus)種、フザリウム(Fusarium)種、トリコスポロン(Trichosporon)種、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アクレモニウム(Acremonium)種、スケドスポリウム(Scedosporium)種、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、スポロトリックスシェンキイ(Sporothrix schenckii)およびニューモシスチス・ジロヴェチ(Pneumocystis jirovecii)ならびに記哺乳動物の免疫系の作用に反応してトレハロースを産生する病原性真菌微生物から選択される、請求項7に記載の方法。
  9. 所与の前記トレハロースについて得られるシグナルの強度を標準化合物から得られるシグナルと比較することによって、前記サンプルに含まれる所与の前記トレハロースの量を確定することができるように、既知量の少なくとも1つの標準サンプルを前記サンプルに添加する、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
  10. ユビキタス内因性シグナルの強度と対する前記所与のトレハロースに対応するシグナルの強度の比が決定され、前記内因性シグナルが前もって同定され、場合によって前記サンプルが得られた前記生物学的液体の種類に特異的であり、その結果、前記サンプルに含まれる前記所与のトレハロースを定量化できる請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
  11. 前記生物学的液体が、動脈または静脈血、血清、生殖粘膜液、気道液、特に気管支肺胞洗浄から得られる液体、気管支吸引、気管吸引、吐出物、痰、皮膚および外皮を収集するために用いられた液体、浸出液、閉鎖腔からの液体、特に脳脊髄液体、胃腸管または尿液および生検断片の摩砕から得られる液体から選択される請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
  12. 請求項1〜11の何れか一項に記載の方法を実施するために用いるキットであって、
    ・少なくとも、逆相クロマトグラフィーを実行可能にする疎水性固相を含む第1支持体と、
    ・少なくともインプット開口部、アウトプット開口部ならびに前記インプット開口部とアウトプット開口部との間に配置された固体活性炭充填物を含む第2の容器と、を含み、
    前記支持体は、逆相クロマトグラフィーを実行可能にする疎水性固相を含み、
    前記固体活性炭充填物を含む前記容器が互いに独立して以下の部品:プレート、ウェル、カラム、チューブおよび複数のウェルを含むプレートから選択され、前記キットは、さらにMALDIプレートも含み、
    前記固体活性炭充填物は、等量の活性炭と珪藻土とを混合することによって調製され、
    前記疎水性固相は、粉末状であり、かつ、磁性材料を含む、
    キット。
  13. 場合によって放射性同位体で標識された、単糖、二糖および三糖から選択される所与の量の標準化合物、特に重水素化トレハロースを含む請求項12に記載のキット。
  14. 生物学的液体に含まれる多糖および/またはオリゴ糖および/または単糖により形成される複合体と反応することができる所与の量の酵素をさらに含む請求項12または13に記載のキット。
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