CN109212101A - 一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒 - Google Patents

一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴定哮喘的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖以及葡萄糖与甘露糖的比值。本发明检测方法为柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血便可区分正常人和哮喘患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量哮喘患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与哮喘之间的关系、寻找新型哮喘临床检测标志物有着非常重要的意义。

Description

一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定哮喘的生物标记物的方法及其检测试剂盒。
背景技术
哮喘又名支气管哮喘，是一种常见的呼吸系统疾病；是由多种细胞及细胞组份参与的气道慢性炎症性疾病。全世界约有3亿哮喘患者，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。在临床上，体检是检查哮喘的方式之一，临床上血液常规检查嗜酸性粒细胞增高、痰液检查嗜酸性粒细胞是否退化形成尖棱结晶，黏液栓和透明的哮喘珠、肺功能检查最大呼气流量以及呼气峰值流量是否减少都是哮喘的检验手段。此外，血气分析是否有呼吸性碱中毒，胸部X线检查患者两肺透亮度是否增加而呈过度充气状态也是常用的方法。上述方法在哮喘发作期都有着相应的检测优势，但在机体无异常体征的缓解期实现哮喘的检测，难度很大，都存在着一定的局限性，尤其是在患者最初尚未明确哮喘时，则更为明显。血液分析有着其方便快捷的独特优势，因此，开发出一种基于血液检测的哮喘生物标志物，对于解决哮喘检测技术的局限，意义重大。
血清中还原性单糖似乎仅限于甘露糖和葡萄。文献报道，哮喘患者血清中，游离的葡萄糖和甘露糖水平比正常人高。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。
发明内容
本发明的目的是提供了用于鉴定哮喘的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测哮喘患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测哮喘患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定哮喘患者。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
用于鉴定哮喘的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。
用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：
(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；
(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；
(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；
(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；
(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；
(6)制备甘露糖和葡萄糖的标准曲线；
(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。
所述高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：A相为乙腈，B相为pH为5.5的0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液。
所述步骤(5)中流动相的梯度变化为：
0min，A相15％，B相85％；
10min，A相22％，B相78％；
15min，A相24％，B相76％；
15.1min，A相15％，B相85％；
20min，A相15％，B相85％。
所述步骤(3)中盐酸的浓度为0.3mol/L。
所述步骤(4)中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。
生物标记物在制备用于检测哮喘的试剂盒中的用途。
生物标记物在制备用于检测哮喘的试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂盒中葡萄糖和甘露糖的总量比为54.79的标准液。
一种鉴定哮喘的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有生物标记物，即血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。
所述试剂盒中葡萄糖和甘露糖的总量比为54.79的标准液。
鉴定哮喘的试剂盒在制备用于检测哮喘的试剂盒中的用途。
与现有技术相比，本发明将柱前PMP衍生的高效液相色谱法用于哮喘患者血清游离单糖的检测，其有益技术效果是：
1、前处理简单。
2、分析时间短。
3、所需要的血清用量少，每次只需小于1mL的血量。
4、仪器价格合理，符合常规使用。
5、操作步骤简单易学。
6、检测准确。
本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法同时测定血清游离甘露糖和葡萄糖，简化操作，并且血清用量少，而且也已证实此方法甘露糖浓度的测定不会受高浓度葡萄糖的影响。通过对血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖和甘露糖浓度的比值(G/M比值)的统计学数据分析，建立了哮喘与三者之间的关系。使用本发明的技术方案可以快速区分正常人和哮喘患者。
附图说明
图1为两种类型色谱柱色谱图
图2为不同流动相梯度的色谱图
图3为哮喘患者与正常人血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值散点图；
图4为哮喘患者血清游离甘露糖和葡萄糖的ROC曲线；
图5为正常人和哮喘患者血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值构建的三维立体图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例中涉及的所有血样均由青岛市青岛大学附属医院提供。
本发明的技术方案包括以下步骤：
实施例1
(1)精密称取甘露糖(Man)、葡萄糖胺(GlcN)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)适量，加去离子水配制两份含以上单糖0.1mg/mL混合标准品溶液，现用现配；
(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mL EP管，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；
(3)PMP衍生：每个样品加入60μL 0.5mol/L 1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；
(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL 0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；
(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；
(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，两份样品分别使用不同的色谱柱A和B进行高效液相分析，高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，所得色谱图，见图1。
色谱柱A：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；
Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)色谱条件：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；
梯度变化：
色谱柱B：Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；
Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)色谱条件：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；
梯度变化：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 15％ 85％
40min 22％ 78％
40.1min 15％ 85％
55min 15％ 85％
从图1可以看出，Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱分析时间长，色谱峰分离度差，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱分析时间是ZORBAX XDB-C18色谱柱的1/3，色谱峰良好。横坐标为时间(min)，纵坐标为DAD信号强度。1，2，3，4，5，6，7，8依次Man，GlcN，GalN，GlcUA，Glc，Gal，Xyl，Fuc的色谱峰。
实施例2
(1)精密称取甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)和葡萄糖(Glc)适量，加去离子水配制相同的5份含以上单糖0.1mg/mL混合标准品溶液，现用现配；
(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mL EP管，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；
(3)PMP衍生：每个样品加入60μL 0.5mol/L PMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；
(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL 0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；
(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；
(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，5份样品分别在不同流动相变化梯度下用于高效液相分析，所得色谱图，见图2。
高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；
色谱条件：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；
流动相变化梯度A：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 15％ 85％
20min 15％ 85％
流动相变化梯度B：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 20％ 80％
20min 20％ 80％
流动相变化梯度C：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 22％ 78％
20min 22％ 78％
流动相变化梯度D：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 15％ 85％
10min 22％ 78％
15min 15％ 85％
20min 15％ 85％
流动相变化梯度E：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 15％ 85％
10min 22％ 78％
15min 24％ 76％
15.1min 15％ 85％
20min 15％ 85％
从图2可以看出，在梯度A条件下，只有Man被洗脱出来；在梯度B条件下，尽管三者能够被分离开来，但是溶剂PMP的峰与Man离的较近；而在梯度C条件下，溶剂峰与Man峰重合；在梯度E条件下，Glc峰洗脱出来的时间过长，导致不能形成尖而高的峰。只有在梯度E条件下，出峰对称，且分离度好。横坐标为时间(min)，纵坐标为DAD信号强度。1，2和3依次是Man，Rha和Glc的色谱峰。
实施例3
(1)精密称取甘露糖和葡萄糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.01mg/mL，0.005mg/mL，0.0025mg/mL，0.001mg/mL，0.0005mg/mL的混合标准品溶液，现用现配；
(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mL EP管，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；
(3)PMP衍生：每个样品加入60μL 0.5mol/L PMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；
(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL 0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；
(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；
(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。
高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；
色谱条件：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；
流动相变化梯度：
时间 乙腈 0.1mol/L 乙酸铵pH 5.5
0min 15％ 85％
10min 22％ 78％
15min 24％ 76％
15.1min 15％ 85％
20min 15％ 85％
(7)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线。
实施例4
(1)创造碱性环境：分别取30例正常人血清样品和30例已确诊的哮喘患者血清样品10μL加30μL超纯水于1.5mL EP管中，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；
(2)其余步骤同实施例3，分析计算甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。统计检测结果，见图3。
将图3结果总结至表1和表2。
表1.哮喘患者血清游离单糖和G/M比值与正常人的相对趋势
葡萄糖 甘露糖 G/M比值
哮喘 ↓NS ↓* ↓***
注释：“NS”代表与正常人相比无显著性差异，“***p＜0.001”、“**p＜0.01”和“*p＜0.05”分别代表与正常人相比有显著性差异，“↑”和“↓”分别代表与正常人相比上升或下降。
表2.哮喘患者及正常人血清中2种游离单糖浓度(μmol/L)及其比值结果
葡萄糖 甘露糖 G/M比值
正常人 5657±2109 72.38±25.72 79.48±18.09
哮喘 4982±1636 58.16±24.68 55.06±12.50
另外，对表1中与正常人有显著性差异的甘露糖和葡萄糖进行了ROC曲线分析，以期望找到曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性均较高的指标，以确定最佳筛查阳性临界值(cutoff值)，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。检测结果见图4，将图4结果总结至表3。
表3.哮喘患者血清中甘露糖和葡萄糖的cutoff值(μmol/L)及其灵敏度(％)和特异性(％)
AUC cutoff值 灵敏度 特异性
甘露糖 0.6667 67.63 80.00 56.67
葡萄糖 0.5922 3755 30 96.67
G/M比值 0.8589 54.79 63.33 96.67
从图3，表1，表2可以看出，哮喘患者血清葡萄糖与甘露糖的比值显著下降。另外，表3显示，甘露糖与葡萄糖的比值的灵敏度和特异性比单独的甘露糖和葡萄糖的高，因此可以以游离甘露糖与葡萄糖的比值作为生物标志物来检测哮喘患者。
实施例5
利用本发明所述的生物标记物用于检测哮喘的应用，具体包括以下步骤：
(1)创造碱性环境：取待检测的血清样品10μL加30μL超纯水于1.5mL EP管中，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；
(2)PMP衍生：每个样品加入60μL 0.5mol/L PMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；
(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL 0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；
(4)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；
(5)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；
色谱条件：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；
梯度变化：
(6)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线：精密称取甘露糖和葡萄糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.01mg/mL，0.005mg/mL，0.0025mg/mL，0.001mg/mL，0.0005mg/mL的混合标准品溶液，现用现配；取40μL混合单糖标准品于1.5mL EP管，加入40μL 0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；其余步骤同(2)、(3)、(4)、(5)。
(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(5)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。并通过Origin 9软件作出三者之间的三维立体图，以便更直观的观察三者联合能否将正常人与哮喘患者区分开，见图5。
如果待测血清样品中葡萄糖与甘露糖的比值为当G/M≤54.79时，有很大的风险患有哮喘。
以上结果均表明：该方法前处理简单；分析时间短；所需要的血清用量少，每次只需小于1mL的血量；仪器价格合理，符合常规使用；操作步骤简单易学；检测准确。检测并计算血清中游离的甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值可以区分正常人和哮喘患者，适合临床上用于哮喘患者的诊断。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.用于鉴定哮喘的生物标记物，其特征在于：所述生物标记物为血清经过柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖以及葡萄糖与甘露糖的比值。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：
(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；
(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；
(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；
(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；
(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；
(6)制备甘露糖和葡萄糖的标准曲线；
(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱为Agilent 1260高效液相系统，Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：
检测波长：254nm，带宽4nm；
参比波长：350nm，带宽100nm；
柱温：37℃；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：A相为乙腈，B相为pH为5.5的0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：所述步骤(5)中流动相的梯度变化为：
0min，A相15％，B相85％；
10min，A相22％，B相78％；
15min，A相24％，B相76％；
15.1min，A相15％，B相85％；
20min，A相15％，B相85％。
5.根据权利要求2所述的用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：所述步骤(3)中盐酸的浓度为0.3mol/L。
6.根据权利要求2所述的用于鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：所述步骤(4)中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。
7.权利要求2-6所述的鉴定哮喘的生物标记物的定量分析方法在哮喘疾病中的应用，其特征在于所述血清样品为哮喘患者的血清。
8.一种鉴定哮喘的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的生物标记物，即血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖以及葡萄糖与甘露糖的比值。
9.根据权利要求8所述的鉴定哮喘的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中葡萄糖和甘露糖的总量比为54.79的标准液。
10.权利要求2-9任一项所述的试剂耗材在制备用于哮喘患者血清中甘露糖和葡萄糖定量的试剂盒中的用途。
11.一种鉴定哮喘的试剂盒，其特征在于通过血清中的甘露糖和葡萄糖定量鉴定哮喘。
12.权利要求8-11任一项所述的鉴定哮喘的试剂盒在体外检测哮喘的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于通过血清中的甘露糖和葡萄糖定量鉴定哮喘。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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