CN105973888B - 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，包括检测芯片和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测芯片包括不吸水的底板和不吸水的盖板，所述底板上依次设置有样品池、混合池和检测池，所述样品池与混合池之间以及混合池与检测池之间均设置有微管道，所述样品池内填充有样品垫，所述样品垫上包被有钴标准品，所述检测池内填充有检测垫，所述检测垫上包被有钴指示剂，所述盖板固定设置于底板上方，所述盖板上且位于样品池的上方开设有加样孔，所述检测试剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液。本发明的试剂盒是基于白蛋白钴结合试验原理，将样品分离以及检测分析过程整合到一个器件中，使得IMA检测更便捷。

Description

一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒。
背景技术
急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是20世纪80年代以来提出的冠状动脉粥样硬化性心脏病的诊断新概念。以冠状动脉粥样硬化斑块不稳定性为基本病理、生理特点，以急性心肌缺血为共同特征的一组疾病群。ACS是人类最常见的心血管疾病。我国目前每年新增ACS患者约1百万以上，ACS占总人口疾病死亡原因的10％以上，ACS已经成为危害人民健康的常见疾病。误诊或延误诊断不但给患者精神和身体造成伤害，还给社会公共医疗资源造成极大的损失和浪费。
心肌缺血是引发ACS疾病群的病理机制。Morrow等指出：理想的心肌缺血标志物应该具备以下特点：(1)灵敏度及特异性均高，必须能检测心肌缺血，但在健康个体、炎症及其他器官损伤期间均不增加；(2)心肌缺血期间应该能够早期检测，且与心肌受累的范围成正比；(3)在循环中稳定性好，可持续检测以保持一个足够的期间；(4)24小时内血中浓度恢复到基础水平，以便检测复发性缺血等特性。
研究发现，缺血修饰白蛋白(Ischemia modified albumin，IMA)是反映早期心肌缺血的标志物。作为心肌早期缺血的特异指标，IMA在临床实践中表现了良好指导作用，其检测方法--白蛋白钴结合试验(albumin-cobalt binding,ACB)是美国FDA近20年来唯一批准的用来评价心肌缺血损伤的试验。
IMA的形成与组织缺氧有关。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)其氨基末端N-天冬氨酸-丙氨酸-组氨酸-赖氨酸为人类所特有,在正常生理情况下是钴(Co++)、铜(Cu++)、镍(Ni++)等过渡金属离子的主要结合位点，但容易受生化因素,如pH等的影响而被降解，使HAS失去与Co++等离子的结合能力，形成IMA。
Bar-Or等通过研究发现IMA在组织缺血后数分钟后迅速升高，其变化在心肌其它指标(CK-MB，Mb，cTnI)等增高之前6-24小时即显著增高。作为目前临床唯一指定的心肌缺血的生化指标，IMA具有：
(1)早期并灵敏反映心肌缺血状况。IMA在心肌缺血发生后数分钟即升高，明显优于其它生化指标(一般4-6小时以后发生心肌坏死后方可升高)
(2)显著的阴性预测效果，有助于临床工作者对急诊患者进行危险分层，排除低危患者ACS可能。
(3)IMA浓度可以作为心肌缺血的严重程度以及预后的判断指标。
因此，IMA对于急性心肌缺血的早期诊断，ACS排除诊断及ACS危险性分层评价，均具有重要意义。在临床实践中，对于疑似ACS患者迅速进行IMA检测，可以帮助临床医务工作者对患者做出及时、准确的诊断并施行积极有效的治疗方案。
已经报道检测IMA的方法有比色法、液相色谱法，质谱测定法以及核磁共振检测法等。除比色法之外，其余均不适合临床常规分析。目前，比色法检测IMA试验已经被美国FDA纳入临床常规检测项目，其常用的技术手段为：
1)仪器检测分析，即大型的生化分析仪器，如罗氏公司的日立，康巴斯公司的Cobas MIRA PLUS等多种自动分析仪上进行检测，
2)比色法试剂盒通过分光光度仪或酶标仪检测分析。
无论是传统的比色法或者目前先进的自动分析仪器检测或者试剂盒检测，全部需要在实验室进行样品分离/仪器分析检测，均不能够满足临床急诊或基层医疗单位对心肌缺血及时准确判断的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒。该试剂盒是基于白蛋白钴结合试验原理，采用微全分析系统技术，将样品分离以及检测分析过程整合到一个器件中，使得IMA检测更便捷。该试剂盒检测方法简单、结果易于判断，适合在基层医院、急诊等医疗单位，或住院患者床头使用，使医务工作者可以对患者危险分层进行迅速判断，节约医疗资源和保健成本。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，包括检测芯片和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测芯片包括不吸水的底板和不吸水的盖板，所述底板上依次设置有样品池、混合池和检测池，所述样品池与混合池之间以及混合池与检测池之间均设置有微管道，所述样品池内填充有样品垫，所述样品垫上包被有钴标准品，所述检测池内填充有检测垫，所述检测垫上包被有钴指示剂，所述盖板固定设置于底板上方，所述盖板上且位于样品池的上方开设有加样孔，所述检测试剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，检测试剂的pH值为7.8。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括防潮袋，以及用于盛装检测芯片、试剂瓶和防潮袋的盒体。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述盖板上开设有排气孔。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述排气孔的数量为多个，多个所述排气孔分别设置于样品池上方、混合池上方和检测池上方。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述底板上设置有与样品池相连通的样品池排气槽，与混合池相连通的混合池排气槽，和与检测池相连通的检测池排气槽。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述排气孔的数量为多个，多个所述排气孔分别设置于样品池排气槽上方、混合池排气槽上方和检测池排气槽上方。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样品池排气槽位于样品池上靠近混合池的一端。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述钴标准品为氯化钴或硫酸钴，所述钴指示剂为1-硝酸亚萘酸、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述钴标准品的包被量为1μL～100μL，钴标准品的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L，所述钴指示剂的包被量为1μL～100μL，钴指示剂的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L。
上述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样品垫和检测垫的材质均为纤维。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的试剂盒是基于白蛋白钴结合试验原理，采用微全分析系统技术，将样品分离以及检测分析过程整合到一个器件中。
2、本发明按照白蛋白钴结合试验的原理，通过设置样品池、混合池、检测池和微管道系统，使得白蛋白钴结合试验中各步骤反应可以按顺序依次发生。
3、本发明芯片的混合池位于样品池与检测池之间，给检测样品与钴离子结合提供更多缓冲混匀空间，使得通过微管道流入检测池中样品的理化性质更均一，减少技术误差。
4、本发明优选在盖板上设置排气孔，能够使待检测样品和检测试剂流动顺利，并调节各步骤反应时间。
5、本发明的试剂盒检测方法简单、结果易于判断，适合在基层医院、急诊等医疗单位，或住院患者床头使用，使医务工作者可以对患者危险分层进行迅速判断，节约医疗资源和保健成本。
6、本发明的试剂盒使用方便，成本低廉，容易普及到基层医疗单位使用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1的底板的结构示意图。
图2为本发明实施例1的底板去除样品垫和检测垫的结构示意图。
图3为本发明实施例1的盖板的结构示意图。
图4为本发明实施例2的底板的结构示意图。
图5为本发明实施例2的底板去除样品垫和检测垫的结构示意图。
图6为本发明实施例2的盖板的结构示意图。
附图标记说明：
1—底板； 2—盖板； 3—样品池；
4—混合池； 5—检测池； 6—样品垫；
7—检测垫； 8—加样孔； 9—微管道；
10—排气孔； 11—样品池排气槽； 12—混合池排气槽；
13—检测池排气槽。
具体实施方式
实施例1
如图1、图2和图3所示，本实施例的快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，包括检测芯片和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测芯片包括不吸水的底板1和不吸水的盖板2，所述底板1上依次设置有样品池3、混合池4和检测池5，所述样品池3与混合池4之间以及混合池4与检测池5之间均设置有微管道9，所述样品池3内填充有样品垫6，所述样品垫6上包被有钴标准品，所述检测池5内填充有检测垫7，所述检测垫7上包被有钴指示剂，所述盖板2固定设置于底板1上方，所述盖板2上且位于样品池3的上方开设有加样孔8，所述检测试剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，检测试剂的pH值为7.8。所述底板和盖板可采用透明的玻璃、石英、塑料或硅胶等材质，底片和盖片可通过热压粘合或化学溶蚀等方式固定在一起。
本实施例中，还包括防潮袋，以及用于盛装检测芯片、试剂瓶和防潮袋的盒体。
本实施例中，所述盖板2上开设有排气孔10。
本实施例中，所述底板1上设置有与样品池3相连通的样品池排气槽11，与混合池4相连通的混合池排气槽12，和与检测池5相连通的检测池排气槽13。
本实施例中，所述排气孔10的数量为多个(优选3～7个)，多个所述排气孔10分别设置于样品池排气槽11上方、混合池排气槽12上方和检测池排气槽13上方。
本实施例中，所述样品池排气槽11位于样品池3上靠近混合池4的一端。
本实施例中，所述钴标准品为氯化钴或硫酸钴，所述钴指示剂为1-硝酸亚萘酸、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。
本实施例中，所述钴标准品的包被量为1μL～100μL，钴标准品的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L，所述钴指示剂的包被量为1μL～100μL，钴指示剂的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L。
本实施例中，所述样品垫6和检测垫7的材质均为纤维。
本实施例中，钴标准品和钴指示剂的优选的包被量和包被浓度均见下表。
表1实施例1的钴标准品和钴指示剂优选的包被量和包被浓度
实施例2
如图4、图5和图6所示，本实施例的快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，包括检测芯片和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测芯片包括不吸水的底板1和不吸水的盖板2，所述底板1上依次设置有样品池3、混合池4和检测池5，所述样品池3与混合池4之间以及混合池4与检测池5之间均设置有微管道9，所述样品池3内填充有样品垫6，所述样品垫6上包被有钴标准品，所述检测池5内填充有检测垫7，所述检测垫7上包被有钴指示剂，所述盖板2固定设置于底板1上方，所述盖板2上且位于样品池3的上方开设有加样孔8，所述检测试剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，检测试剂的pH值为7.8。所述底板和盖板可采用透明的玻璃、石英、塑料或硅胶等材质，底片和盖片可通过热压粘合或化学溶蚀等方式固定在一起。
本实施例中，还包括防潮袋，以及用于盛装检测芯片、试剂瓶和防潮袋的盒体。
本实施例中，所述盖板2上开设有排气孔10。
本实施例中，所述排气孔10的数量为多个(优选3～7个)，多个所述排气孔10分别设置于样品池3上方、混合池4上方和检测池5上方。
本实施例中，所述钴标准品为氯化钴或硫酸钴，所述钴指示剂为1-硝酸亚萘酸、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。
本实施例中，所述钴标准品的包被量为1μL～100μL，钴标准品的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L，所述钴指示剂的包被量为1μL～100μL，钴指示剂的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L。
本实施例中，所述样品垫6和检测垫7的材质均为纤维。
本实施例中，钴标准品和钴指示剂的优选的包被量和包被浓度均见下表。
表2实施例2的钴标准品和钴指示剂优选的包被量和包被浓度
本发明的试剂盒的设计思路是不借助任何仪器的帮助独立完成IMA的检测，其原理是通过评估检测样品与钴标准品中钴离子结合能力的变化从而判断检测样品中IMA是否升高。
本发明试剂盒的使用方法如下：通过样品孔8向样品垫6中加入25μL无抗凝剂的血清样品或40μL无抗凝剂的全血样品，然后向样品垫6中加入30μL检测试剂，静置5分钟；再向样品垫6中逐滴加入50μL检测试剂，静置5分钟；最后于1分钟内向样品垫6中逐滴加入100μL检测试剂，静置10分钟后观察检测垫7的颜色变化，并与标准比色板比较，判断测试样品中的IMA浓度。
标准比色板由以下方法制备：
以本发明实施例1的试剂盒为例，分别制备含有不同钴标准品和钴指示剂的试剂盒，检测钴标准品中钴的质量与待检测样品的体积之间的关系，得出待检测样品的体积(单位为μL)与钴标准品中钴的质量(单位为ng)的较佳比例为1:(1～5)；应用40μL全血或25μL血清样品进行试验，当钴指示剂的浓度为1μM～2000μM时，钴标准品中钴离子浓度为0～2000μM时，钴指示剂颜色变化的强度与钴离子的浓度成正比并且容易辨识；制备钴离子浓度为0～1000μM的五个浓度梯度的钴标准品，选择等量不同浓度的钴标准品包被检测芯片的样品垫，按照钴标准品浓度由小到大依次标注为SD1、SD2、SD3、SD4和SD5，以25μL血清为待检测样品进行检测，所得的结果依次记录为–、+、++、+++和++++，根据检测垫显示的颜色制备标准比色板。
结果验证：
1、采用180U/mL的IMA标准品为原料，生理盐水为稀释剂，制备浓度分别为180U/mL、145U/mL、120U/mL、90U/mL、60U/mL、45U/mL和0U/mL的IMA试样。
按照上述本发明试剂盒的使用方法对制备的不同浓度的IMA试样进行检测，结果与上述方法制备的标准比色板进行对比，结果如下表。
表3不同浓度IMA试样的检测结果
2、采用180U/mL的IMA标准品(HSD)为原料，使用健康混合血清(HS)为稀释剂对IMA标准品进行系列稀释，按照上述本发明试剂盒的使用方法对健康混合血清稀释的IMA试样进行检测，结果与上述方法制备的标准比色板进行对比，结果如下表。
表4不同稀释比例的IMA试样的检测结果
HSD:HS(体积比) 1:0 2:1 1:1 1:5 0:1
检测结果 ++++ +++ ++～+++ ++ +
由以上两个实验可以看出，本发明的试剂盒检测的结果与待检测样品中的IMA浓度有关。
对比检测：
选购市售IMA检测试剂盒(上海微银生物技术有限公司)，按照说明书随机检测20例急诊疑似ACS患者的IMA水平，同时采取末梢血按照上述本发明试剂盒的使用方法用本发明的试剂盒检测患者IMA水平。结果如下：
表5市售IMA检测试剂盒与本发明试剂盒的检测结果
(市售IMA检测试剂盒生产商建议的cut-off值为67U/mL)
由以上对比试验可以看出，本发明试剂盒可以检测出不同样品中IMA浓度的变化，检测结果与市面已有的产品结果一致。
影响因素：
对不同影响因素对本发明试剂盒检测结果的影响进行分析。
1、血清白蛋白浓度
缺血修饰白蛋白的检测结果直接受血清白蛋白浓度影响。根据已有的报道，在缺血修饰白蛋白的检测过程中，当血清白蛋白浓度在20g/L～55g/L时，血清白蛋白浓度对IMA检测结果的影响可以忽略不计。本发明通过系列稀释人血清白蛋白溶液，得到浓度为20g/L、30g/L、40g/L和50g/L的白蛋白溶液，使用上述本发明试剂盒的使用方法进行检测，结果显示白蛋白稀释样本检测结果无差别。
2、血红蛋白/溶血样品
将IMA高值样品(180U/mL)用生理盐水稀释成120U/mL、60U/mL样品，并分别加入系列稀释的血红蛋白，使血红蛋白浓度为0～160g/L，应用本发明试剂盒检测并观察检测结果。血红蛋白浓度在0～160g/L浓度范围内对本发明试剂盒IMA检测结果无影响。
3、甘油三酯(TG)
向IMA高值样品(120U/mL)与低值样品(60U/mL)中分别加入不同量的甘油三酯，使甘油三酯浓度在0～800mmol/L之间。应用本发明试剂盒检测并观察检测结果变化。甘油三酯浓度在≤800mmol/L时，对本发明试剂盒检测结果无影响。
稳定性实验：
将本发明检测芯片干燥密封后，置于37℃恒温箱14天，然后取出，平衡至室温；同一生产批号的检测芯片干燥密封后，2℃～8℃保存，于试验前取出，平衡至室温；然后比较不同保存方法的检测芯片的检测结果。结果显示37℃储存14天对本发明试剂盒检测结果无影响。
本发明的试剂盒不仅可采用目测比较检测样品中IMA浓度的高低，还可采用手机拍照传送数据到数据中心进行结果分析比较。另外，还可设计芯片读取机进行数据分析并根据标准曲线换算出IMA数值，使得本发明试剂盒的检测结果具体数字化。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (7)

1.一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，包括检测芯片和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测芯片包括不吸水的底板(1)和不吸水的盖板(2)，所述底板(1)上依次设置有样品池(3)、混合池(4)和检测池(5)，所述样品池(3)与混合池(4)之间以及混合池(4)与检测池(5)之间均设置有微管道(9)，所述样品池(3)内填充有样品垫(6)，所述样品垫(6)上包被有钴标准品，所述检测池(5)内填充有检测垫(7)，所述检测垫(7)上包被有钴指示剂，所述盖板(2)固定设置于底板(1)上方，所述盖板(2)上且位于样品池(3)的上方开设有加样孔(8)，所述检测试剂为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述盖板(2)上开设有排气孔(10)，所述排气孔(10)的数量为多个，多个所述排气孔(10)分别设置于样品池(3)上方、混合池(4)上方和检测池(5)上方；所述底板(1)上设置有与样品池(3)相连通的样品池排气槽(11)，与混合池(4)相连通的混合池排气槽(12)，和与检测池(5)相连通的检测池排气槽(13)。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括防潮袋，以及用于盛装检测芯片、试剂瓶和防潮袋的盒体。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述排气孔(10)的数量为多个，多个所述排气孔(10)分别设置于样品池排气槽(11)上方、混合池排气槽(12)上方和检测池排气槽(13)上方。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样品池排气槽(11)位于样品池(3)上靠近混合池(4)的一端。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述钴标准品为氯化钴或硫酸钴，所述钴指示剂为1-硝酸亚萘酸、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。
6.根据权利要求5所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述钴标准品的包被量为1μL～100μL，钴标准品的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L，所述钴指示剂的包被量为1μL～100μL，钴指示剂的包被浓度为0.1mmol/L～15mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述样品垫(6)和检测垫(7)的材质均为纤维。
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