CN102590363A - 检测不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法 - Google Patents

Abstract

关于检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，包括中药样品的提取，纯化及检测，所述的样品采用甲醇-水(80∶20，V/V)提取，pH7.0吐温-PBS缓冲溶液稀释，玻璃纤维膜过滤，免疫亲和柱净化。所述测定方法包括：高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证。液相色谱条件为：流动相比例乙腈∶水(50∶50，V/V)，荧光检测器波长：激发波长：270nm，发射波长：440nm；二极管整列检测器波长：236nm。液质条件：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。质谱条件为采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式。本发明具有准确，精密，可靠等特点。

Description

检测不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法

技术领域：

本发明涉及一种测定不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，特别是涉及高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证中药中玉米赤霉烯酮毒素和α-玉米赤霉烯醇毒素的方法。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生一种雌激素类真菌毒素。由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而且部分镰刀菌为产毒菌，可产生玉米赤霉烯酮毒素，而在植物体内，ZEN代谢产生其他一些产物，主要是α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-ZOL)。因此，很有必要对中药中玉米赤霉烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。

ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品如饲料等。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。

发明内容

到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料中ZEN，α-ZOL毒素的分析，对中药中ZEN，α-ZOL毒素的分析，目前还是空白。因此对中药中ZEN，α-ZOL毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的ZEN，α-ZOL毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于中药中ZEN，α-ZOL毒素的提取、净化方法，优化了液相，液质的色谱条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的ZEN，α-ZOL毒素进行测定。

本发明是通过采用高效液相色谱荧光，紫外检测法测定中药中的ZEN，α-ZOL毒素的方法，同时建立了不同基质中ZEN，α-ZOL毒素的液相色谱-质谱联用确证法。

具体的不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现：

仪器、药品及材料：

仪器：

Hitachi L-2130高效液相色谱系统，日本Hitachi公司；

Hitachi L-2485荧光检测器，日本Hitachi公司；

Shimadzu LC-20AT高效液相色谱系统，日本Shimadzu公司；

Shimadzu SPD-M20A二极管阵列检测器，日本Shimadzu公司；

高效液相色谱仪(日本岛津公司)；

API4000三重四级杆质谱仪；

Qilinbeier旋涡混合器；

Heraeus Multifuge X3R低温高速离心机。

CX-250HP型超声波清洗器，北京医疗设备二厂；

ZD-9556型水平摇床，太仓市科教仪器厂；

WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；

DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司

Zearala testTM HPLC免疫亲和柱，美国VICAM公司；

GF/A型玻璃微纤维滤纸，英国WHATMAN公司。

Ultimate^R XB-C18色谱柱，Welch Materials公司；

对照品：

玉米赤霉烯酮毒素(ZON)标准品购自以色列Fermentek公司，纯度≥99％；α-玉米赤酶烯酮(α-ZOL)标准品购自sigma公司，纯度≥99％；色谱分析用乙腈、甲醇均为为色谱纯，B&J公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

样品：

所测样品分别购自江西樟树、江苏镇江、海南，浙江，河北，北京以及贵州遵义，所有样品均为市场上随机购买而来，低温干燥后备用。

1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的ZEN和α-ZOL毒素

a.色谱条件：

色谱柱为Ultimate^R XB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相为水-乙腈(50∶50，V/V)；流速：1mL/min；柱温25℃；发射波长274nm，激发波长440nm；进样量20μL。

b.溶液配制：

对照品溶液的制备：精密称取ZON和α-ZOL标准品适量，加乙腈分别制成含量为50μg/mL的溶液；

PBS缓冲溶液的配制：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水定容至1000ml。

c.样品溶液的制备：

样品提取：准确称取样品12.5g于三角锥形瓶中，加入1.25g氯化钠及50ml甲醇∶水(V∶V 80∶20)，摇床振摇1h，过滤，取10ml滤液加入10ml PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。

样品净化：吸取上述滤液10ml于玻璃注射器中，6ml/min过免疫亲和柱至2-3ml空气通过免疫亲和柱，以10ml水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，并使2-3ml空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速慢，收集全部洗脱液于玻璃试管中，用0.45μm的一次性针头过滤器过滤后进样分析

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。

2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和α-ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；

a.色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-乙腈(50∶50，V/V)为流动相，柱温25℃，检测波长：236nm；

b.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。

3、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。

a.液相条件：

色谱柱为Phenomenex Gemini 3u C₁₈ 110A column(20mm*2.00mm，3micron)。流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。

b.质谱条件：采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。ZON，m/z 317.0→272.9碰撞电压为-28eV，m/z 317.0→174.8碰撞电压为-34eV，m/z 317.0→131.0碰撞电压为-40eV；α-ZOL，m/z319.0→274.9碰撞电压为-30eV，m/z 319.0→159.9碰撞电压为-44eV，m/z 319.0→130.0碰撞电压为-46eV.

c.测定法：分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10μL，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。

经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。

本发明提供了中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-荧光检测法测定；中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-二极管阵列检测法，并采用光谱图确证了实验中的阳性结果；中药中的阳性结果的高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果确证。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。

1、高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的ZEN和α-ZOL毒素；

(1)标准曲线

取ZEN和α-ZOL混标溶液，稀释得到不同浓度(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.8、1、2.5μg/mL)的混标溶液，分别进样，获得的色谱峰峰面积(A)对ZEN和α-ZOL的质量浓度(C-μg/mL)作回归，得到α-ZOL荧光标准曲线为：A＝721647C+5578.7，r＝0.9999，线性范围为0.01-2.5μg/mL；得到ZEN荧光标准曲线为：A＝2*10⁶C-13664，r＝0.9999，线性范围为0.01-2.5μg/mL。见表1和表2

表1α-ZOL荧光线性关系考察结果

                                                    

对照品浓度C(μg/mL)             峰面积A(均值)

                                                    

0.01                            18203

0.02                            30076

0.05                            44013

0.10                            84894

0.20                            139224

0.40                            277263

0.80                            584039

1                               725178

2.5                             1813285

                                                    

表2 ZEN荧光线性关系考察结果

                                                    

对照品浓度C(μg/mL)             峰面积A(均值)

                                                    

0.01                            22930

0.02                            41397

0.05                            72345

0.10                            115157

0.20                            292014

0.40                            580019

0.6                             875230

2.5                             3807020

                                                    

(2)最低检出限和定量限

根据信噪比S/N≥3为该物质的最低检出限，α-ZOL毒素荧光的最低检出限为2.5μg/kg，ZEN毒素荧光的最低检测限为4μg/kg；根据信噪比S/N≥10为该物质的最低定量限，α-ZOL毒素荧光的最低定量限为4.5μg/kg，ZEN毒素荧光的最低定量限为7.5μg/kg.

(3)日内精密度实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件连续进样6次，计算ZEN和α-ZOL的峰面积值及RSD，结果见表3。

表3荧光日内精密度试验结果

(4)日间精密度实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件每天进样1次，连续进样5天，计算ZEN和α-ZOL的峰面积值，结果见表4。

表4荧光日间精密度试验结果

(5)稳定性实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、12h测定，结果见表5。

表5荧光稳定性实验结果

(6)回收率实验

本实验中采用党参、生麦芽、焦神曲三种药材，这三种药材代表了常用中药的三种基质，且这三种药材经过免疫亲和柱处理之后，经HPLC-FLD检测，对添加的标准品检测无干扰，故将其用来做回收率实验。

本实验添加了3个水平的标准品溶液：水平1：ZEN和α-ZOL的浓度为300μg/kg；水平2：ZEN和α-ZOL的浓度为60μg/kg；水平3：ZEN和α-ZOL的浓度为30μg/kg，每组实验均重复3次，n＝3。

准确称取12.5药材粉末，加入适量标准溶液，按正文样品溶液的制备方法制备样品溶液，精密吸取20μL进样测定，按外标法测定其含量，计算加样回收率结果见表6。

表6ZEN和α-ZOL荧光加样回收率的测定

(7)样品测定

运用上述方法测定了100个中药材和5个中成药，用外标法分别测定制备好的各种中药待测样品液，每个样品进样20μL。所有样品经过免疫亲和柱前处理以后，经高效液相荧光测定，结果如表所示，阳性样品用其含量表示；样品中出现的色谱峰对需检测的ZON和α-ZOL色谱峰无干扰的，用“×”表示，而有的中药出现的色谱峰对需检测的色谱峰有干扰，用“-”表示。结果见表7。

表7样品中ZEN和α-ZOL的测定结果

14

炒神曲

北京同仁堂

×

7.5

×

×

15

建曲

北京同仁堂

×

70.6

-

64.6

16

黄芩

浙江

×

×

×

×

17

板蓝根

海南

×

×

×

×

18

白术

海南

×

×

×

×

19

生麦芽

海南

×

×

×

×

20

胖大海

海南

×

×

×

×

21

姜黄

海南

×

×

×

×

22

黄芪

海南

×

×

×

×

23

山药

海南

×

×

×

×

24

甘草

海南

×

-

-

-

25

厚朴

海南

×

×

×

×

26

丹参

北京

×

×

×

×

27

制巴戟天

北京

×

×

×

×

28

优生大黄

北京

×

×

×

×

29

生杜仲

北京

×

×

×

×

30

羌活

北京

×

×

×

×

31

胖大海

北京

×

×

×

×

32

金银花

北京

×

×

×

×

33

姜厚朴

北京

×

×

×

×

34

黄芩

北京

×

×

×

×

35

防风

北京

×

×

×

×

36

党参

北京

×

×

×

×

37

当归

北京

×

×

×

×

38

川芎

北京

×

×

×

×

39

姜黄

北京

×

×

×

×

40

生何首乌

北京

×

×

×

×

41

生黄芪

北京

×

×

×

×

42

白芷

北京

×

×

×

×

43

板蓝根

北京

×

×

×

×

44

川牛膝

北京1

×

×

×

×

45

川牛膝

北京2

×

×

×

×

46

陈皮

北京

×

×

×

×

47

炒莱菔子

北京

×

×

×

×

48

苍术

北京

×

×

×

×

49

茯苓

北京

×

×

×

×

50

百合

北京

×

×

×

×

51

藿香

贵州遵义

×

×

×

×

52

蒲公英

贵州遵义

×

×

×

×

53

山茱萸

贵州遵义

×

×

×

×

54

山楂

贵州遵义

×

×

×

×

55

鱼腥草

贵州遵义

×

×

×

×

56

生枣仁

贵州遵义

×

×

×

×

57

香本缘

贵州遵义

×

×

×

×

58

薤白

贵州遵义

×

×

×

×

59

枸杞

贵州遵义

×

×

×

×

60

决明子

贵州遵义

×

×

×

×

61

槐米

贵州遵义

×

×

×

×

62

柴胡

贵州遵义

×

×

×

×

63

百合

贵州遵义

×

×

×

×

64

黑芝麻

贵州遵义

×

×

×

×

65

花椒

贵州遵义

×

×

×

×

66

葛根

贵州遵义

×

×

×

×

67

八角茴香

贵州遵义

×

×

×

×

68

甘草

贵州遵义

×

×

×

×

69

肉豆蔻

贵州遵义

×

×

×

×

70

桔梗

江西樟树

×

×

×

×

71

五味子

江西樟树

×

×

×

×

72

远至

江西樟树

×

×

×

×

73

白术

江西樟树

×

×

×

×

74

附子

江西樟树

×

×

×

×

75

人参叶

江西樟树

×

×

×

×

76

升麻

江西樟树

×

×

×

×

77

苏叶

江西樟树

×

×

×

×

78

天南星

江西樟树

×

×

×

×

79

续断

江西樟树

×

×

×

×

80

莪术

江西樟树

×

×

×

×

81

菟丝子

江西樟树

×

×

×

×

82

莲子

江西樟树

×

×

×

×

83

番泻叶

江西樟树

×

×

×

×

84

何首乌

江西樟树

×

×

×

×

85

杜仲

江西樟树

×

×

×

×

86

天冬

江西樟树

×

×

×

×

87

大青叶

江西樟树

×

×

×

×

88

麻黄

江西樟树

×

×

×

×

89

菊花

江西樟树

×

×

×

×

90

甘草

江西樟树

×

×

×

×

91

小茴香

江西樟树

×

×

×

×

92

防风

江西樟树

×

×

×

×

93

黄芪

江西樟树

×

×

×

×

94

厚朴

江西樟树

×

×

×

×

95

麦冬

江苏镇江

×

×

×

×

96

白菊花

江苏镇江

×

×

×

×

97

浙贝

江苏镇江

×

×

×

×

98

三七

江苏镇江

×

×

×

×

99

元胡

江苏镇江

×

×

×

×

100

玄参

江苏镇江

×

×

×

×

101

大山楂丸

北京存仁堂

×

×

×

×

102

加味保和丸

北京存仁堂

×

×

×

×

103

牛黄解毒丸

北京同仁堂

×

×

×

×

104

人参健脾丸

北京存仁堂

×

×

×

×

105

黄连上清丸

北京同仁堂

×

×

×

×

2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；

(1)标准曲线

取ZEN和α-ZOL混标溶液，稀释得到不同浓度(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.8、1、2.5μg/mL)的混标溶液，分别进样，获得的色谱峰峰面积(A)对ZEN和α-ZOL的质量浓度(C-μg/mL)作回归，得到α-ZOL紫外标准曲线为：A＝51729C-1306.8，r＝0.9998，线性范围为0.01-2.5μg/mL；得到ZEN紫外标准曲线为：A＝140323C-3627.4，r＝0.9998，线性范围为0.01-2.5μg/mL。见表8和表9

表8α-ZOL紫外线性关系考察结果

                                         

对照品浓度C(μg/mL)     峰面积A(均值)

                                         

0.02                    926

0.05                    1951

0.10                    4197

0.20                    8595

0.40                    17835

0.80                    40068

1                       49676

2.5                     128565

                                         

表9ZEN紫外线性关系考察结果

                                               

对照品浓度C(μg/mL)     峰面积A(均值)

                                               

0.02                    2534

0.05                    4767

0.10                    10425

0.20                    23213

0.40                    50524

1                       133512

2.5                     348813

                                               

(2)最低检出限和定量限

根据信噪比S/N≥3为该物质的最低检出限，α-ZOL毒素紫外的最低检出限为7.5μg/kg，ZEN毒素紫外的最低检测限为9μg/kg；根据信噪比S/N≥10为该物质的最低定量限，α-ZOL毒素紫外的最低定量限为15μg/kg，ZEN毒素紫外的最低定量限为18μg/kg。

(3)日内精密度实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件连续进样6次，计算ZEN和α-ZOL的峰面积值及RSD，结果见表10。

表10紫外日内精密度试验结果

(4)日间精密度实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件每天进样1次，连续进样5天，计算ZEN和α-ZOL的峰面积值，结果见表11

表11紫外日间精密度试验结果

(5)稳定性实验

精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、12h测定，结果见表。

表12紫外稳定性实验结果

(6)回收率实验

本实验中采用党参、生麦芽、焦神曲三种药材，这三种药材代表了常用中药的三种基质，且这三种药材经过免疫亲和柱处理之后，经HPLC-UV检测，对添加的标准品检测无干扰，故将其用来做回收率实验。

本实验添加了3个水平的标准品溶液：水平1：ZEN和α-ZOL的浓度为300μg/kg；水平2：ZEN和α-ZOL的浓度为60μg/kg；水平3：ZEN和α-ZOL的浓度为30μg/kg，每组实验均重复3次，n＝3。

准确称取12.5药材粉末，加入适量标准溶液，按正文样品溶液的制备方法制备样品溶液，精密吸取20μL进样测定，按外标法测定其含量，计算加样回收率结果见表13。

表13ZEN和α-ZOL荧光加样回收率的测定

(7)样品测定

运用上述方法测定了100个中药材和5个中成药，用外标法分别测定制备好的各种中药待测样品液，每个样品进样20μL。所有样品经过免疫亲和柱前处理以后，经高效液相紫外测定，结果如表所示，阳性样品用其含量表示；样品中出现的色谱峰对需检测的ZON和α-ZOL色谱峰无干扰的，用“×”表示，而有的中药出现的色谱峰对需检测的色谱峰有干扰，用“-”表示。结果表7。

3、液相色谱-质谱分析条件：

液相条件：色谱柱为Phenomenex Gemini C₁₈ 110A column(20mm*2.00mm，3micron)。流动相：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。

质谱条件：采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。ZON，m/z 317.0→272.9碰撞电压为-28eV，m/z 317.0→174.8碰撞电压为-34eV，m/z 317.0→131.0碰撞电压为-40eV；α-ZOL，m/z319.0→274.9碰撞电压为-30eV，m/z 319.0→159.9碰撞电压为-44eV，m/z 319.0→130.0碰撞电压为-46eV.

中药成分复杂，采用高效液相进行分析时，常会出现干扰或者假阳性结果。因此，仅仅通过色谱峰的保留时间进行鉴别，有可能给分析结果造成误差。为了排除干扰和消除误差，本发明采用了HPLC-ESI-MS/MS技术通过ZON和α-ZOL的保留时间，及分析物的离子碎片对测定结果进行了确证，根据质谱图可以看到ZON和α-ZOL特征离子对：ZON的母离子为317.0([M-H]^-)，三个子离子为m/z 131.0([M-CO₂-C₆H₁₀O₂-CO-H]^-)，m/z174.8([M-CO-CO₂-C₅H₁₀-H]^-)，m/z 272.9([M-CO₂-H]^-)；α-ZOL的母离子为m/z 319.0([M-H]^-)，三个子离子为m/z 130.0[M-CO₂-C₇H₁₁O₂-H₂O-H]^-，159.9([M-CO₂-C₇H₁₃-H₂O-H]^-)，274.9([M-CO₂-H]^-)。通过色谱图及相应的质谱图可以确认甘草(海南)，建曲(北京)这两个样品中不含有ZON毒素和α-ZOL毒素，证实液相测得的峰为干扰峰。

附图说明：

图1是ZON和α-ZOL标准品的高效液相色谱-荧光检测法色谱图；

图2是阳性样品薏苡仁的高效液相色谱-荧光检测法色谱图；

图3是ZON和α-ZOL标准品的高效液相色谱-二极管阵列检测法色谱及光谱图；

图4是阳性样品薏苡仁的高效液相色谱-二极管阵列检测法色谱及光谱图；

图5是ZON标准品的HPLC-ESI-MS/MS二级质谱图；

图6是ZON准品的HPLC-ESI-MS/MS三个离子对色谱图；

图7是阳性样品薏苡仁的HPLC-ESI-MS/MS三个离子对色谱图；

图8是α-ZOL标准品的HPLC-ESI-MS/MS二级质谱图；

图9是α-ZOL准品的HPLC-ESI-MS/MS三个离子对色谱图

具体实施方案

(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中ZON的含量；

a.色谱条件：

色谱柱为Ultimate^R XB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相为水-乙腈(50∶50，V/V)；流速：1mL/min；柱温25℃；发射波长274nm，激发波长440nm；进样量20μL。

b.溶液配制：

对照品溶液的制备：精密称取ZON和α-ZOL标准品适量，加乙腈分别制成含量为50μg/mL的溶液；

PBS缓冲溶液的配制：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水定容至1000ml。

c.样品溶液的制备：

样品提取：准确称取样品12.5g于三角锥形瓶中，加入1.25g氯化钠及50ml甲醇∶水(V∶V 80∶20)，摇床振摇1h，过滤，取10ml滤液加入10ml PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。

样品净化：吸取上述滤液10ml于玻璃注射器中，6ml/min过免疫亲和柱至2-3ml空气通过免疫亲和柱，以10ml水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，并使2-3ml空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速慢，收集全部洗脱液于玻璃试管中，用0.45μm的一次性针头过滤器过滤后进样分析

d.测定法：分别对照品和样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定。

(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中玉米赤霉烯酮毒素的含量、光谱图确证阳性结果；

a.色谱条件：Ultimate^R XB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，乙腈-水(50∶50V/V/V)为流动相，柱温25℃，检测波长：236nm；

b.测定法：分别对照品和样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定。

(3)、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。

a.液相条件：色谱柱为Phenomenex Gemini C₁₈ 110A column(20mm*2.00mm，3micron)。流动相：流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。

b.质谱条件：采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。ZON，m/z 317.0→272.9碰撞电压为-28eV，m/z 317.0→174.8碰撞电压为-34eV，m/z 317.0→131.0碰撞电压为-40eV；α-ZOL，m/z319.0→274.9碰撞电压为-30eV，m/z 319.0→159.9碰撞电压为-44eV，m/z 319.0→130.0碰撞电压为-46eV.

c.测定法：分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液8μL，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。

Claims (4)

1.检测不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素(ZON)及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素(α-ZOL)的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中ZON和α-ZOL的含量；

(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和α-ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；

(3)、采用HPLC-ESI-MS/MS对阳性结果进行确证。

2.根据权利要求1的不同基质中药中ZON和α-ZOL的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的ZEN和α-ZOL毒素

a.色谱条件：

色谱柱为Ultimate^R XB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相为水-乙腈(50∶50，V/V)；流速：1mL/min；柱温25℃；发射波长274nm，激发波长440nm；进样量20μL。

b.溶液配制：

对照品溶液的制备：精密称取ZON和α-ZOL标准品适量，加乙腈分别制成含量为50μg/mL的溶液；

PBS缓冲溶液的配制：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水定容至1000ml。

c.样品溶液的制备：

样品提取：准确称取样品12.5g于三角锥形瓶中，加入1.25g氯化钠及50ml甲醇∶水(V∶V 80∶20)，摇床振摇1h，过滤，取10ml滤液加入10ml PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。

样品净化：吸取上述滤液10ml于玻璃注射器中，6ml/min过免疫亲和柱至2-3ml空气通过免疫亲和柱，以10ml水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，并使2-3ml空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速慢，收集全部洗脱液于玻璃试管中，用0.45μm的一次性针头过滤器过滤后进样分析。

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。

(2)用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和α-ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；

a.色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-乙腈(50∶50，V/V)为流动相，柱温25℃，检测波长：236nm；

b.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定。

(3)采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。

a.液相条件：

色谱柱为Phenomenex Gemini 3u C₁₈ 110A column(20mm*2.00mm，3micron)。流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。

b.质谱条件：采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。ZON，m/z 317.0→272.9碰撞电压为-28eV，m/z 317.0→174.8碰撞电压为-34eV，m/z 317.0→131.0碰撞电压为-40eV；α-ZOL，m/z319.0→274.9碰撞电压为-30eV，m/z 319.0→159.9碰撞电压为-44eV，m/z 319.0→130.0碰撞电压为-46eV。

c.测定法：分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10μL，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。

3.根据权利要求2所述的检测不同基质中药中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于样品制备过程中：

a.提取溶剂采用甲醇∶水(80∶20，V/V)混合溶液；

b.提取方式为高速匀质提取3min；

c.稀释溶液采用pH7.0的PBS缓冲溶液。

4.根据权利要求2所述的一种检测不同基质中药中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于：

a.液相色谱法中采用乙腈-水(50∶50，V/V)作为流动相；

b.高效液相色谱-质谱联用法中采用水(含0.1％甲酸)和乙腈(含0.1％甲酸)作为流动相；

c.高效液相色谱-质谱联用法中采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式。

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